Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para implementar el modelo murino de Clostridium difficile con cefoperazona, haciendo especial énfasis en el monitoreo de la enfermedad clínica, la enumeración de bacterias, la citotoxicidad de las toxinas y los cambios histopatológicos posteriores al desafío. Este protocolo detallado ayudará a los investigadores a ejecutar con precisión un modelo murino de infección por Clostridium difficile, lo cual es esencial para estudiar la patogénesis de esta bacteria y evaluar terapias novedosas. La principal ventaja del uso de este modelo murino es que la exposición a un solo antibiótico durante cinco días hace que los ratones sean susceptibles a la colonización por C. difficile y a un curso clínico prolongado de la infección, paralelo a la enfermedad humana.

Para comenzar, tome la cepa de reserva de C.difficile de interés y vortexee. En una cabina de flujo laminar, diluya la cepa en agua estéril en un tubo con tapa roscada hasta una concentración de diez a la quinta esporas por 25 microlitros. Etiquete la mezcla como inóculo de esporas y coloque el tubo en un baño de agua a 65 grados Celsius durante 20 minutos.

A continuación, en la cabina de flujo laminar, pipetee 50 microlitros del inóculo de esporas calentado en un tubo estéril de microcentrifugado y páselo a la cámara anaeróbica hasta su uso posterior. Cargue el inóculo de esporas restante en una jeringa de un mililitro conectada a una aguja estéril para gavaje gástrico con punta de bulbo. En una cabina de flujo laminar, tome un ratón sujeto e inmovilice la cabeza restringiendo suavemente al animal por la piel suelta del cuello y la espalda.

Utilizando el dedo índice, y asegurándose de que el animal no vocalice ni muestre signos de malestar, inmovilice aún más la cabeza del animal y alargue el esófago. Mantenga al ratón en posición vertical y erguida, e introduzca suavemente la aguja de gavaje por un lado de la boca. Dirija la aguja de gavaje a lo largo del paladar y avance lentamente hacia el esófago.

Una vez que la aguja esté aproximadamente a mitad de camino dentro del esófago, inyecte 25 microlitros de inóculo de esporas y luego retire suavemente la aguja. Devuelva el animal a su jaula y obsérvelo en busca de signos de tos o dificultad respiratoria, que podrían indicar una administración traqueal inadvertida. A continuación, tome la alícuota del inóculo de esporas almacenada previamente en la cámara anaeróbica, así como cualquier inóculo de esporas restante de la gavaje, y realice diluciones seriadas de uno a diez en 180 microlitros de PBS 1x.

Realice cuatro a cinco de estas diluciones. Utilizando técnica aséptica, transfiera 100 microlitros de cada dilución en serie a una placa TCCFA individual. Tomando un nuevo espátula estéril en forma de L cada vez, distribuya uniformemente los inóculos de dilución en cada placa.

Incube las placas en condiciones anaeróbicas durante 24 horas a 37 grados Celsius. Finalmente, cuente las colonias de C.difficile en cada placa de dilución y calcule las unidades formadoras de colonias para obtener la dosis infecciosa administrada a los ratones. Para recoger muestras fecales de ratones para evaluación, primero sujete ligeramente pero firmemente al ratón de estudio por la piel suelta del cuello y la espalda, asegurándose de que el animal no esté en estado de estrés.

Usando el dedo meñique, levante suavemente la cola del animal, exponiendo el ano. Sostenga un tubo estéril de microcentrifugado de peso conocido directamente debajo del ano del animal, asegurándose de que el tubo no toque directamente al ratón. Cuando el animal defeque, recoja la bolita fecal en el tubo.

Guarde el tubo a temperatura ambiente hasta que se hayan recolectado todas las muestras necesarias. Pese los tubos que contienen heces en una balanza analítica y registre la masa con cuatro decimales. Calcule el peso del pellet fecal restando el peso del tubo.

A continuación, calcule una dilución de uno a diez del contenido y resuspenda en PBS 1x. Utilice la punta de la pipeta para desintegrar suavemente la materia fecal en la solución. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos, permitiendo que los contenidos se sedimenten.

Manteniendo las soluciones en condiciones anaeróbicas, realice diluciones seriadas para cada muestra en PBS 1x. Transfiera 100 microlitros de cada dilución seriada a placas de TCCFA. Utilice un espátula estéril en forma de L y aplique uniformemente el medio sobre las placas.

Incube las placas en condiciones anaeróbicas a 37 grados celsius durante 24 horas. Finalmente, enumere las colonias de C.difficile y calcule la unidad formadora de colonias por gramo de contenido fecal. Esta figura muestra el peso del ratón en los días posteriores al desafío con C.difficile R20291.

En el día cero, el peso basal se establece en 100. El peso corporal promedio de los ratones se midió cada día posteriormente, durante 14 días. Se observó una disminución significativa del peso en los ratones desafiados entre los días dos y siete posteriores al desafío.

Los ratones parecieron recuperarse y recuperar peso a partir de este momento. Aquí se muestra la carga de C.difficile en las heces en los días posteriores al desafío. A las 24 horas posteriores al desafío, todos los ratones estaban colonizados con 10 a la séptima UFC por gramo de heces.

Esta carga había disminuido a partir del día siete, aunque C. difficile aún estaba presente. El examen histopatológico de los ratones a lo largo del curso de la infección mostró los cambios patológicos más significativos en el ciego. Los puntajes histológicos totales del ciego fueron significativamente diferentes entre el día cero y los días dos y cuatro posteriores al desafío.

Por lo general, las personas nuevas en este modelo de ratón pueden tener dificultades con el cálculo y la preparación del inóculo de esporas utilizado para desafiar a los ratones, así como con el cálculo de la carga bacteriana fecal de C.difficile. Al intentar este protocolo, es importante recordar que las modificaciones en la dosis o en la cepa de esporas de C.difficile administradas a los ratones pueden alterar el resultado de este modelo.