Name: Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante Clostridium difficile R20291 Strain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprende el modelo de ratón con cefoperazona para estudiar infección por Clostridioides difficile usando la cepa R20291. Este protocolo detalla monitoreo clínico, enumeración bacteriana y cambios histopatológicos.

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Los autores desean agradecer a Trevor Lawley del Wellcome Trust Sanger Institute por las esporas de C. difficile R20291 y a James S. Guy de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Carolina del Norte por las células Vero, ambos utilizados en este manuscrito. La histopatología animal se llevó a cabo en el Centro Central de Histopatología Animal del LCCC de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, con la asistencia especial de Traci Raley y Amanda Brown. El Centro de Histopatología Animal del LCCC está financiado en parte por una Subvención de Apoyo del Centro del NCI (2P30CA016086-40) al Centro Oncológico Integral Lineberger de la UNC. También nos gustaría agradecer a Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie y Cassie Schumacher por sus útiles discusiones sobre el protocolo de ensayo de citotoxicidad celular Vero. JAW está financiado por la subvención Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training T32OD011130 de los NIH. CMT está financiado por el premio de desarrollo profesional en metabolómica K01GM109236 por el NIGMS de los NIH.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar en este momento.

Este protocolo caracteriza el curso clínico, incluida la pérdida de peso, la colonización bacteriana, la citotoxicidad de toxinas y los cambios histopatológicos en el tracto gastrointestinal, de ratones tratados con antibióticos desafiados con esporas de C. difficile R20291. Hay varios pasos críticos dentro del protocolo en los que la atención al detalle es esencial. El cálculo preciso del inóculo de esporas de C. difficile es fundamental. Este cálculo se basa en la enumeración original de la cepa de es...

Clostridium difficile es un anaerobio,, Bacillus formador de esporas gram-positiva que causa diarrea que amenaza la vida 1. Infección por C. difficile (CDI) se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad humana y los resultados en más de $ 4.8 mil millones en costos de salud por año 1-4. En 2013, los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades clasifican C. difficile como un riesgo de resistencia a antibióticos urgente, lo que indica que presenta una amenaza inmediata para la salud pública 1. Actualmente, el tratamiento antibiótico con vancomicina y metronidazol se consideran el estándar de cuidado para CDI 5. Desafortunadamente, la recurrencia de CDI después del tratamiento exitoso con antibióticos es alta, se produce en 20 - 30% de los pacientes 2,5-7. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas terapias contra este patógeno entérico es necesario. Para evaluar la terapéutica frente a C. difficile, un modelo animal que se aproxima la enfermedad humana en corriente alternaSe necesita cepa linically relevantes. Inicialmente, se establecieron los postulados de Koch para C. difficile en 1977, utilizando un modelo de hámster sirio clindamicina tratados con 8. Este modelo todavía se utiliza hoy en día para investigar los efectos de toxinas de C. difficile en la patogénesis 9,10. Sin embargo, el CDI en el modelo de hámster se traduce en altas tasas de mortalidad y no se aproxima a las manifestaciones de la enfermedad insidiosa crónicas que se pueden ver en los seres humanos con CDI 10,11. Sobre la base de la disponibilidad y accesibilidad de reactivo de plataformas murinas en investigación, un modelo de ratón de CDI es relevante. En 2008, un modelo sólido ratón de CDI se estableció mediante el tratamiento de ratones con un cóctel de antibióticos en el agua potable (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazol y vancomicina) durante 3 días, seguido de una inyección intraperitoneal de clindamicina 12. Este ratones que son más susceptibles a la colitis CDI y severa. Dependering de la dosis de inóculo administrado, una amplia gama de signos clínicos y la letalidad se puede observar utilizando este modelo. Desde entonces, varios regímenes de antibióticos se han investigado que alteran la microbiota intestinal murino, disminuyendo la resistencia a la colonización hasta el punto en C. difficile puede colonizar el tracto gastrointestinal (revisado en Best et al. Y Lawley &amp; Young) 13,14. Más recientemente, un amplio espectro de cefalosporina, cefoperazona, dada en el agua de bebida durante 5 o 10 días reproducible hace ratones susceptibles a CDI 15. Puesto que la administración de cefalosporinas de tercera generación están asociados con un mayor riesgo de CDI en los seres humanos, el uso del modelo de cefoperazona refleja con mayor precisión la enfermedad 16 de origen natural. Cefoperazona tratados con ratones susceptibles a C. difficile han sido desafiados con las dos esporas de C. difficile y células vegetativas de una variedad de cepas que van de clínicarelevancia y la virulencia 17. A pesar de algunos de los estudios originales que utilizan C. difficile células vegetativas como la forma infecciosa, esporas de C. difficile se consideran el principal modo de transmisión 18. En la última década, C. difficile R20291, a / BI / 027 NAP1, ha surgido, causando epidemias de CDI 19,20. Hemos tratado de determinar la evolución clínica de la enfermedad, cuando los ratones tratados con cefoperazona fueron desafiados con la cepa de C. difficile clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Este protocolo se detalla el curso clínico, incluyendo pérdida de peso, la colonización bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y cambios histopatológicos en el tracto gastrointestinal de los ratones desafiados con esporas de C. difficile R20291. En general, este modelo de ratón demuestra ser una plataforma experimental valioso para CDI aproximación de la enfermedad humana. Este modelo de ratón caracterizado por lo tanto se puede utilizar para evaluar los efectosde nuevas terapias en la mejora de la enfermedad clínica y en la restauración de la resistencia a la colonización contra C. difficile.

<table><tbody><tr><td>#62 Limpiador desinfectante esporidicular perisept&nbsp;</td><td>SSS Navigator</td><td>48027</td><td>Este producto requerirá dilución según lo recomendado por el fabricante</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filter</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-3</td><td>Alternativa a la placa filtrante para muestras individuales probadas en el Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Necesita ser calentado en baño de agua a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>0.4% Azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1% Peniciilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>10% inactivado por calor FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Necesita calentarse en baño de agua a 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>jeringa de plástico de 1 ml&nbsp;</td><td>BD Medical Supplies</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrífuga de 2 ml Tapón de rosca</td><td>Corning</td><td>430917</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo plano para cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Costar Corning</td><td>CL3595</td><td></td></tr><tr><td>Placa de filtro de 96 pocillos</td><td>Millipore</td><td>MSGVS2210</td><td></td></tr><tr><td>Junta adhesiva</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptona</td><td>Becton Dickinson</td><td>211684</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>Cefoperazone</td><td>MP Bioworks</td><td>199695</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitine</td><td>Sigma</td><td>C47856</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Antitoxin Kit</td><td>Tech Labs</td><td>T5000</td><td>Utilizado como control para el ensayo de células Vero</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Toxina Lista A</td><td>Biological Labs</td><td>152C</td><td>Control positivo para el ensayo de células Vero</td></tr><tr><td>D-cicloserina</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver más abajo)</td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>Gibco</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x Media</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Necesita calentarse en baño de agua a 37 ° C antes de usar</td></tr><tr><td>Fructosa</td><td>Fisher</td><td>L95500</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Bright-Line, Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>MgSO4 (anhidro)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Parte de las placas de TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &mu; m filter</td><td>Millex-GS</td><td>SLGS033SS</td><td>Filtro para placas TCCFA&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td>Parte de las placas TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>Parte de las placas TCCFA (ver abajo)</td></tr><tr><td>Número 10 hoja de bisturí desechable</td><td>Miltex, Inc</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Placas PCR</td><td>Fisherbrand</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico</td><td>Kord-Valmark Marca 2900</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esparcidor de células estéril de plástico en forma de L</td><td>Fisherbrand</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa paso</td><td>Dymax Corporation</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>Taurocolato</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td>Parte de las placas TCCFA (ver más abajo)</td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Ratones</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>Los ratones deben tener entre 5 y 8 semanas de edad</td></tr><tr><td>Microscopio óptico Olympus BX43F</td><td>Cámara Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DP27</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Dimension software&nbsp;</td><td>Olympus Ciencias de la</td><td></td><td></td> Vida</tr></tbody></table>

cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; clostridium difficile</em&gt; r20291 strain

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile es un patógeno entérico anaeróbico, grampositivo y formador de esporas que se asocia con un aumento de la morbilidad y la mortalidad y, en consecuencia, representa una amenaza urgente para la salud pública. La recurrencia de una infección por C. difficile (ICD) después de un tratamiento exitoso con antibióticos es alta, ocurriendo en el 20-30% de los pacientes, por lo que es necesario descubrir nuevas terapias contra este patógeno. Los modelos animales actuales de ICD dan lugar a altas tasas de mortalidad y, por lo tanto, no se aproximan a las manifestaciones crónicas e insidiosas de la enfermedad observadas en los seres humanos con ICD. Para evaluar la terapéutica contra C. difficile, se necesita un modelo de ratón que se aproxime a la enfermedad humana utilizando una cepa clínicamente relevante. Este protocolo describe el modelo de ratón cefoperazone de CDI utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente tratable, R20291. En el protocolo se detallan las técnicas para el seguimiento clínico de la enfermedad, la enumeración bacteriana de C. difficile, la citotoxicidad de la toxina y los cambios histopatológicos a lo largo de la ICD en un modelo de ratón. En comparación con otros modelos murinos de ICD, este modelo no es uniformemente letal a la dosis administrada, lo que permite observar un curso clínico prolongado de infección concordante con la enfermedad humana. Por lo tanto, este modelo de ratón de cefoperazona de CDI demuestra ser una valiosa plataforma experimental para evaluar los efectos de nuevas terapias en la mejora de la enfermedad clínica y en la restauración de la resistencia a la colonización contra C. difficile.

Durante un estudio representativo, 5 semanas de edad C57BL / 6 ratones WT fueron pretratados con cefoperazona en su agua potable (0,5 mg / ml) durante 5 días y se dejaron a 2 días a lavar con agua potable regular. Los ratones fueron retados con 10 5 esporas de C. difficile R20291 mediante sonda oral en el día 0 (Figura 1A). Los ratones se controlaron para la pérdida de peso y los signos clínicos (letargo, inapetencia, diarrea, y la postura encorvada) ...

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para implementar el modelo murino de Clostridium difficile con cefoperazona, haciendo especial énfasis en el monitoreo de la enfermedad clínica, la enumeración de bacterias, la citotoxicidad de las toxinas y los cambios histopatológicos posteriores al desafío. Este protocolo detallado ayudará a los investigadores a ejecutar con precisión un modelo murino de infección por Clostridium difficile, lo cual es esencial para estudiar la patogénesis de esta bacteria y evaluar terapias novedosas. La principal ventaja del uso de este modelo murino es que la exposición a un solo antibiótico durante cinco días hace que los ratones sean susceptibles a la colonización por C. difficile y a un curso clínico prolongado de la infección, paralelo a la enfermedad humana.Para comenzar, tome la cepa de reserva de C.difficile de interés y vortexee. En una cabina de flujo laminar, diluya la cepa en agua estéril en un tubo con tapa roscada hasta una concentración de diez a la quinta esporas por 25 microlitros. Etiquete la mezcla como inóculo de esporas y coloque el tubo en un baño de agua a 65 grados Celsius durante 20 minutos.A con

cefoperazone-treated-mouse-model-clinically-relevant-clostridium

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Winston, J. A., et al. Modelo murino tratado con cefoperazona de la cepa clínicamente relevante de Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo muestra el procedimiento para inocular ratones pretratados con antibióticos con esporas de Clostridium difficile para establecer un modelo murino de infección que estudie la patogénesis y las respuestas del huésped.

Establecimiento de un modelo murino de infección por Clostridium difficile

Fuente: Winston, J. A. et al. Modelo murino tratado con cefoperazona de la cepa clínicamente relevante de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra la cuantificación de Clostridium difficile en muestras fecales de un modelo murino infectado utilizando técnicas de cultivo selectivo. Describe los procedimientos para la recogida de muestras, el procesamiento anaeróbico, la dilución en serie y la enumeración de colonias para evaluar la colonización bacteriana y las...

Cuantificación de Clostridium difficile en muestras fecales de un modelo de ratón infectado

Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con...

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

La capacidad de modelar infecciones del tracto urinario (ITU) es crucial para poder comprender la patogénesis bacteriana y generar el desarrollo de nuevas terapias. El objetivo de este trabajo es demostrar modelos murinos de ITU experimentales e ITU asociadas a catéteres que recapitulen y predigan los hallazgos observados en humanos.

Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

La eficacia antibiótica se determina más comúnmente mediante la realización de estudios cinéticos de eliminación y la medición de unidades formadoras de colonias (UFC). Al integrar la microscopía electrónica de barrido (SEM) con estos métodos estándar, podemos distinguir los efectos farmacológicos del tratamiento entre diferentes antibióticos.

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.

Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

En este artículo, presentamos un protocolo para establecer el modelo de ratón de colitis inducida por sodio, pseudo-germen, sulfato de dextrano libre de antibióticos, para investigar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos positivos del Bacillus cereus sobre la colitis.

Investigación de los efectos paliantes de la administración de Bacillus cereus en la colitis a través de la modulación de la microbiota intestinal

El parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) es un problema de salud mundial urgente con opciones de prevención y tratamiento subóptimas. Presentamos un modelo de ratón de parto prematuro inducido por infección bacteriana vaginal ascendente y describimos cómo analizar la morbilidad y mortalidad neonatal resultante.

Modelado de infección vaginal ascendente, parto prematuro y morbilidad neonatal en ratones

Este protocolo describe los pasos necesarios para la colonización de ratones con pks+ Escherichia coli en condiciones no inflamatorias, así como métodos no invasivos para la validación de la colonización y evaluación de la expansión de pks+ E. coli en heces.

Colonización con pks+ Escherichia coli de Murina en condiciones no inflamatorias

Aprende el modelo de ratón con cefoperazona para estudiar infección por Clostridioides difficile usando la cepa R20291. Este protocolo detalla monitoreo clínico, enumeración bacteriana y cambios histopatológicos.

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante

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