Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante Clostridium difficile R20291 Strain

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para la implementación del modelo de ratón cefoperazone de infección por Clostridium difficile, con especial énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, la enumeración de bacterias, la citotoxicidad de la toxina y los cambios histopatológicos posteriores al desafío. Este protocolo detallado ayudará a los investigadores a ejecutar con precisión un modelo de ratón de infección por Clostridium difficile, que es esencial para estudiar la patogénesis de esta bacteria y acceder a nuevas terapias. La principal ventaja de utilizar este modelo de ratón es que la exposición a un antibiótico durante cinco días hace que los ratones sean susceptibles a la colonización de C. difficile y a un curso clínico prolongado de infección concurrente con la enfermedad humana.

Para empezar, tome la cepa de C.difficile de interés y vórtice. En una campana de flujo laminar, diluir el caldo en agua estéril en un tubo con tapón de rosca hasta una concentración de diez a la quinta espora por 25 microlitros. Etiquete la mezcla como inóculo de esporas y coloque el tubo en un baño de agua a 65 grados centígrados durante 20 minutos.

A continuación, en la campana de flujo laminar, pipetear 50 microlitros del inóculo de esporas calentadas en un tubo de microcentrífuga estéril y pasarlo a la cámara anaeróbica hasta su uso posterior. Cargue el inóculo de esporas restante en una jeringa de un mililitro conectada a una aguja sonda gástrica estéril con pera gástrica. En una campana de flujo laminar, tome un ratón sujeto e inmovilice la cabeza sujetando suavemente al animal por la piel suelta del cuello y la espalda.

Con el dedo índice, y asegurándose de que el animal no vocalice ni muestre signos de angustia, inmovilice aún más la cabeza del animal y alargue el esófago. Mantenga el ratón en posición vertical y erguida y pase suavemente la aguja sonda por el costado de la boca. Dirija la aguja de sonda nasogástrica a lo largo del paladar y avancéela lentamente hasta el esófago.

Una vez que la aguja esté aproximadamente a la mitad del esófago, inyecte 25 microlitros de inóculo de esporas y luego retire suavemente la aguja. Regrese al animal a su jaula y obsérvelo para detectar cualquier signo de tos o dificultad respiratoria que pueda indicar una administración traqueal inadvertida. A continuación, tome la alícuota de inóculo de esporas almacenada previamente en la cámara anaeróbica, y cualquier inóculo de esporas de sonda nasogástrica restante, y realice de una a diez diluciones seriadas en 180 microlitros de 1x PBS.

Realice de cuatro a cinco de estas diluciones. Utilizando una técnica aséptica, transfiera 100 microlitros de cada dilución en serie a una placa TCCFA individual. Tomando un nuevo esparcidor estéril en forma de L cada vez, distribuya uniformemente los inóculos de dilución en cada placa.

Incubar las placas en condiciones anaeróbicas durante 24 horas a 37 grados centígrados. Por último, se cuentan las colonias de C. difficile en cada placa de dilución y se calculan las unidades formadoras de colonias para obtener la dosis infectiva administrada a los ratones. Para recolectar muestras fecales de ratones para su evaluación, primero sujete ligera pero firmemente al ratón sujeto por la piel suelta en el cuello y la espalda, asegurándose de que el animal no esté en peligro.

Con el dedo meñique, levante suavemente la cola del animal, exponiendo el ano. Sostenga un tubo de microcentrífuga estéril de peso conocido directamente debajo del ano del animal, asegurándose de que el tubo no toque directamente el ratón. Cuando el animal defece, recoja la bolita fecal en el tubo.

Guarde el tubo a temperatura ambiente hasta que se recojan todas las muestras necesarias. Pesa los tubos que contienen heces en una báscula analítica y registra la masa con cuatro decimales. Calcula el peso de la pelletza fecal restando el peso del tubo.

A continuación, calcule una dilución de uno a diez del contenido y vuelva a suspender en 1x PBS. Utilice la punta de la pipeta para interrumpir suavemente la materia fecal y convertirla en solución. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos, permitiendo que el contenido se asiente.

Manteniendo las soluciones anaeróbicamente, realizar diluciones seriadas para cada muestra en 1x PBS. Transfiera 100 microlitros de cada dilución en serie a placas de TCCFA. Utilice un esparcidor estéril en forma de L y aplique uniformemente los medios a las placas.

Incubar las placas en condiciones anaeróbicas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Por último, enumerar las colonias de C. difficile y calcular la unidad formadora de colonias por gramo de contenido fecal. Esta figura muestra el peso del ratón en los días posteriores al desafío con C. difficile R20291.

En el día cero, el peso de referencia se establece en 100. Se midió el peso corporal promedio del ratón cada día siguiente, durante 14 días. Se observó una disminución significativa en el peso en los ratones desafiados en los días dos a siete después del desafío.

Los ratones parecieron recuperarse y recuperar peso después de este punto. Aquí se muestra la carga de C. difficile en las heces en los días posteriores al desafío. A las 24 horas después del desafío, todos los ratones fueron colonizados con 10 a la séptima UFC por gramo de heces.

Esta carga había disminuido a partir del séptimo día, aunque C. difficile sigue presente. El examen histopatológico de los ratones a lo largo del curso de la infección mostró los cambios patológicos más significativos en el ciego. Las puntuaciones histológicas cecales totales fueron significativamente diferentes entre el día cero y los días dos y cuatro después de la provocación.

En general, los individuos nuevos en este modelo de ratón pueden tener dificultades con el cálculo y la preparación del inóculo de esporas utilizado para desafiar a los ratones y el cálculo de la carga bacteriana fecal de C. difficile. Al intentar este protocolo, es importante recordar que las modificaciones de la dosis o la cepa de esporas de C. difficile administradas a ratones pueden alterar el resultado de este modelo.