Name: El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a analizar el ensamblaje del proteasoma mediante subunidades recombinantes y electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Este método permite detectar intermediarios en la vía de ensamblaje de complejos multiproteicos.

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Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de apoyo Fondos de Investigación (RSFG) de la Universidad de Indiana-Purdue University, Indianapolis, y en parte por un premio de la Asociación Americana del Corazón 14GRNT20390154, a ARCA

1. Expresión bacteriana. Nota: Los plásmidos de expresión utilizados en este estudio se describen en la Tabla 1. Soluciones, los medios y tampones utilizados en este estudio se describen en la Tabla 2. La clonación de genes de la subunidad del proteasoma archaeal y la generación de plásmidos de expresión se describen en otro 18,20. En resumen, los plásmidos de coexpresión recombinante de subunidades emplean una estrategia operón bicistrónico que ayuda en la obtención de niveles de expresión comparables de subunidades individuales 18,20. Los parámetros de expresión se indican a continuación fueron determinada empíricamente para ser óptimo para las subunidades del proteasoma en este estudio. Puede ser necesario para optimizar la expresión de otros mutantes del proteasoma, por proteasomas de otras especies archaeal, o para otros complejos de proteína recombinante (ver Discusión). <ol><li> Transformar el plásmido de expresión de interés en químicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) células. </li><li> Añadir 1 - 2 l de plásmido (típicamente de 50 - 100 ng) a una alícuota de células DE3 que estaban recién descongelado en el hielo, y continúe a incubar en hielo durante 20 min. </li><li> choque térmico de las células a 42ºC durante 45 s y el tubo de retorno de hielo durante 2 min additionl. </li><li> Añadir 1 ml de medio LB y se incuba a 37 ° C con agitación (150 rpm) durante 1 h. </li><li> Spread 100-200 l de la mezcla de transformación sobre LB-kan placas (placas que contienen medio sólido LB, suplementado con kanamicina (todos los plásmidos utilizados en este estudio resistencia codificar a este antibiótico)). Incubar las placas a 37 ºC O / N. </li><li> A la mañana siguiente, inocular una única colonia de la placa de LB-kan en 3 ml de medio LB-kan líquido en un tubo de cultivo de vidrio. Incubar a 37 ºC con agitación (150 rpm) durante aproximadamente 2,5 a 3 h, o hasta que se observa turbidez. </li><li> Medir la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) en un espectrofotómetro. Diluir el culto celularUre con una cantidad apropiada de medio LB precalentada-Kan a un OD 600 de 0,4 en un volumen final de 6 ml. Reanudar la agitación a 37 ºC durante 40 min. </li><li> Inducir la expresión de proteínas en los cultivos líquidos mediante la adición de IPTG a partir de una solución madre a una concentración final de 1 mM. Incubar a 37 ºC con agitación (150 rpm) durante aproximadamente 6-7 h. </li><li> Cosechar cultivos de células bacterianas en su totalidad en tubos de 1,5 mL microcentrífuga. </li><li> Añadir 1,5 ml de un cultivo en tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir otros 1,5 ml de la misma cultura de la pastilla. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Repita el paso 1.11 hasta que todo el cultivo se recoge en el tubo de microcentrífuga. </li><li> Almacenar los pellets inducidos a -80 ° C hasta su lisis. </li></ol> 2. bacteriana de lisis y el lisado de mezcla. Nota: </strong&gt; Para las muestras estudiadas a través de la co-expresión, la sección 2.1 (y sus subsecciones) seguir. Para las muestras que requieren mezcla lisado, sección 2.2 (y sus subsecciones) seguir. El análisis TSP (Total, Soluble, Pellet) que se incluye en el protocolo es útil en la optimización de la expresión de proteínas que pueden ayudar a asegurar que cantidades aproximadamente iguales de subunidades alfa y beta se combinan durante la mezcla de lisado (ver Discusión). También proporciona un control importante, si no son los esperados resultados aguas abajo (es decir, se verifica que la proteína se expresó y soluble). Por lo tanto, es muy recomendable que incluye el análisis de TSP inicialmente. Una vez que un protocolo óptimo se ha logrado una combinación de subunidades particular, el análisis TSP no es estrictamente necesario por lo que se describe como opcional a continuación. <ol><li> La lisis de las células bacterianas y la preparación de fracciones solubles. <ol><li> Descongelar el pellet de células inducida en hielo durante 5 min. Resuspender el precipitado en 600 l de tampón de lisis. </li><li> CªUbaté la suspensión a 30 ° C con agitación (150 rpm) durante 30 min para generar lisado bruto total. Nota: En el siguiente paso, y la subsección que sigue son opcionales. </li><li> Retire los dos 25 alícuotas del lisado total de crudo en 1,5 ml tubos de microcentrífuga separados y llevar a cabo análisis de TSP de la siguiente manera. <ol><li> Para uno de los dos 25 alícuotas, añadir tampón de muestra SDS 5X a una concentración final de 1X. Etiquetar el tubo con &quot;T&quot; para &quot;lisado total de crudo&quot;. </li><li> Incubar la muestra &quot;T&quot; a 100 ºC durante 5 minutos para desnaturalizar las proteínas por completo. </li><li> Mientras tanto, tomar la segunda alícuota de 25 l y centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos. Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento pequeña, y la transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiqueta este nuevo tubo &quot;S&quot; para &quot;fracción soluble&quot;. </li><li> Para los BEHI pequeña pellet izquierdand en el paso anterior, se añaden 25 l de tampón de lisis y vórtice para resuspender. Etiquetar este tubo &quot;C&quot; de &quot;fracción de sedimento&quot;. </li><li> Añadir 6 tampón de muestra l de 5X SDS a los tubos y &quot;S&quot; &quot;P&quot; y se incuba a 100 ºC como se describe anteriormente. Nota: Si las muestras TSP no serán utilizados ese día para analizar la expresión, pueden ser congeladas a -20 ° C hasta que se necesite. Una vez descongelado, se deben volvieron a incubar a 100 ºC, como se describió anteriormente, inmediatamente antes de la carga en un gel de SDS-PAGE estándar 12% y / o 15%. </li></ol></li><li> Si bien el análisis se lleva a cabo TSP, centrifugar los restantes 550 l de lisado bruto total (o la totalidad de los 600 l de lisado bruto total si el análisis TSP no se lleva a cabo) a 10.000 x g durante 10 minutos. Recoger el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos. Este es el lisado soluble que se utilizará para la purificación. </li></ol></li><li> mezcla lisado. <ol><li> Llevar a cabo la lisis tal como se describe en los pasos 2.1.1 y 2.1.2 anteriores. </li><li> Mezclar 600 l de lisado bruto total a partir de bacterias que expresan la subunidad α deseado con 600 l de lisado bruto total a partir de bacterias que expresan la subunidad β deseado. Incubar a 37 ºC con lenta agitación durante 30 min. Nota: Puede que sea necesario para optimizar el tiempo de incubación para lograr la máxima asamblea durante la mezcla lisado (ver Discusión). El tiempo y la temperatura que se presenta aquí son óptimas para las proteínas recombinantes en este estudio y se determinaron en otro lugar 18. </li><li> Centrifugar el lisado de mezclado a 10.000 x g durante 10 min para separar el material soluble del sedimento insoluble. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice este lisado soluble mixto para la purificación de proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Purificación de la proteína a través de inmovilizada Cobalt Affinity Resin(ICAR). <ol><li> Equilibrar la resina. <ol><li> A fondo resuspender la resina invirtiendo la botella y la transferencia de 50 l de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 700 xg durante 2 min a la resina de pellets. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. Nota: Llevamos a cabo la aspiración de la pipeta usando un azul punta de pipeta de 1 ml para eliminar la mayor parte del líquido. Una punta de 2 l blanco se utiliza para el control fino de la eliminación del sobrenadante restante, dejando una capa muy delgada de líquido de los granos. </li><li> Añadir 1 ml de tampón A. Mezclar suavemente para resuspender la resina y se centrifuga a 700 xg durante 2 min para sedimentar la resina. aspirar cuidadosamente el sobrenadante y repetir este paso de lavado una vez más. </li></ol></li><li> Aplicar lisado soluble obtenido anteriormente en la sección 2.1 o 2.2 a la resina equilibrada. Incubar el tubo con una rotación suave a 4 ° C durante 60 min. Se centrifuga el tubo a 700 × g &lt;/ Em&gt; durante 5 min y con cuidado aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavar la resina de la siguiente manera para eliminar las proteínas unidas de forma no específica. <ol><li> Resuspender resina con 1 ml de tampón A y se incuban con agitación suave a 4 ° C durante 10 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más. </li><li> Resuspender resina con 1 ml de Tampón B (Tampón A con imidazol 5 mM) y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más. </li><li> Resuspender resina con 1 ml de tampón C (tampón A con imidazol 10 mM) y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. </li></ol></li><li> Eluir la proteína mediante la adición de 400 l de tampón E (tampón A con imidazol 200 mM) to la resina. Incubar con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar a 700 xg durante 5 min. </li><li> Transferir el sobrenadante que contiene proteína purificada a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Desalar la proteína purificada por centrifugación de serie de la siguiente manera. <ol><li> Para 400 l de proteína purificada, añadir 100 l de tampón A (esto reduce la concentración de imidazol de 200 mM a 160 mM). Aplicar proteína purificada a 0,5 ml filtros de ultracentrifugación con un 10 kDa de peso molecular de corte. Centrifugar a 14.000 × g durante 5 min. </li><li> Desechar el filtrado y añadir 400 l de tampón A para diluir el retenido y se centrifuga de nuevo. Continuar los ciclos de centrifugación / dilución hasta la concentración de imidazol cae por debajo de 4 mm. Como un ejemplo, si cada centrifugación concentra 500 l hasta ~ 70 l (o aproximadamente 7 veces), a continuación, dos ciclos reducirán el 160 mM a partir de concentración de imidazol (7 × 7 = 49 veces) a aproxoximately 3,3 mM. </li><li> Medir la concentración de proteína de la muestra desalada usando el ensayo BCA 21. Se requiere desalación para reducir los niveles de imidazol por debajo del límite de tolerancia para el ensayo BCA, como se describe en las instrucciones del fabricante: Nota. Nuestro laboratorio prefiere el ensayo BCA porque es sensible, tiene un gran rango dinámico, y exhibe una variación mucho menor de proteína a proteína. Sin embargo, otros métodos para determinar la concentración de proteína pueden ser sustituidos por el ensayo de BCA. La clave es ser consciente de las ventajas y limitaciones de cada método. </li></ol></li><li> Añadir tampón de muestra nativo 5X a una concentración final de 1X y proceder a la electroforesis. Alternativamente, las muestras almacenadas a -20 ° C para su posterior análisis. </li></ol> 4. desnaturalizante en gel de poliacrilamida electroforesis (PAGE). Precaución: no polimerizado acrilamida es una neurotoxina. Use gea de protección apropiador. <ol><li> Preparar el gel no desnaturalizante PÁGINA como sigue. <ol><li> Preparar el casete de gel para moldear utilizando placas de vidrio limpias y emitan soporte. Coloque fabricante de gradiente en la parte superior de un pequeño agitador magnético y se colocará un pequeño imán en cada cámara. </li><li> El uso de 40% (w / v) de acrilamida y 2% (w / v) de soluciones madre bisacrilamida, preparar 5% y 10% (w / v) Las soluciones de gel de acrilamida en un tampón de la solución nativa. Asegúrese de que la proporción de acrilamida total bisacrilamida es 37,5: 1. Se enfría en hielo antes de verter. Nota: El sistema PÁGINA desnaturalizante se utiliza aquí es esencialmente idéntico al sistema SDS-PAGE de Laemmli, con SDS omitió 22. </li><li> Añadir amonio persulfato (de un 10% (w v) solución / preparada en agua) a las soluciones de acrilamida para iniciar la polimerización. La concentración final de amonio persulfato es 0,1% (w / v). </li><li> Vierta las soluciones de acrilamida en las dos cámaras del fabricante de gradiente. Con el tubo de salida b insertadantre las placas de la casete de gel, activar el agitador magnético y se abren las válvulas fabricante de gradiente. Verter la 5 - gel con gradiente desnaturalizante al 10%. </li><li> Una vez vertida, superponer el gel con una capa delgada de isopropanol y permitir que el gel se polimerice durante 30 min. Durante este tiempo, preparar la solución de gel de acrilamida al 5% en tampón fresco resolver nativo. Después de la puesta de gel, vierta el isopropanol y enjuague la parte superior del gel con agua desionizada de una botella con atomizador. </li><li> A la solución de gel de 5% preparada anteriormente, añadir amonio persulfato (exactamente como se describe en 4.1.3) y se vierte en la parte superior del gel polimerizado hasta placas de vidrio están llenos. Inserto de peine gel. Permitir que el gel superpuesto polimerizar durante 30 minutos adicionales. </li><li> Una vez gel se polimeriza, montar casete de gel en el aparato de electroforesis. Como alternativa, el gel almacenar a 4 ° C, envueltas en toallas de papel humedecido y una envoltura de plástico hasta que esté listo para su uso. </li></ol></li><li> Una vez que no desnaturalizante en gel PAGE se ensambla en electrophoresis aparato, llene el tanque con tampón de procesamiento 1X nativa preparada fresca de un tampón 10X ejecución nativa de valores. </li><li> Carga de 10 g de proteína purificada, obtenida al final de la sección 3, en cada pocillo utilizando una jeringa de vidrio. </li><li> Carga 2 l de estándar de alto peso molecular nativo de proteína (diluido en tampón de ejecución nativo 1X) en uno de los pocillos. </li><li> gel de funcionar a 55 V y 4 ºC hasta que el frente del colorante se escurre el gel (aproximadamente 4 - 4,5 horas). </li><li> Además del gel no desnaturalizante, analizar alícuotas de la proteína purificada por la norma SDS-PAGE 22. <ol><li> Mezclar alícuotas (10 g) de las muestras de proteína purificada, obtenida al final de la sección 3, con tampón 5X de muestra de SDS a una concentración final de 1X. </li><li> Incubar a 100 ºC durante 5 min y cargar en estándar 12% y / o 15% en geles de SDS-PAGE 22. </li><li> Correr a 80 V durante 20 min y luego a 120 V hasta que el frente de colorante se sale de la gel (esto es aproximadamente un complementoitional 75 min para un gel 12%, y 120 min para un gel 15%). </li></ol></li></ol> Actividad 5. Visualización y tinción de proteínas. <ol><li> Tras la electroforesis, las placas de vidrio separadas cuidadosamente y transferir el gel no desnaturalizante a una bandeja de gel que contiene 50 ml de agua desionizada. Enjuague gel con agitación suave durante 5 minutos. Desechar el agua y repetir este paso de lavado tres veces. </li><li> Realizar ensayo de recubrimiento de sustrato de la siguiente manera. <ol><li> Añadir 1 ml de tampón de revelado que contiene el sustrato de péptido fluorogénico Suc-LLVY-AMC y se extendió uniformemente sobre el gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min. Nota: una varilla de vidrio o un liberador de gel (pequeña cuña de plástico utilizado para placas de vidrio separadas) se pueden utilizar para extender el líquido sobre el gel. </li><li> transferir cuidadosamente el gel en el transiluminador UV del sistema de imágenes de gel y observar la fluorescencia debido al sustrato péptido escindido. imagen de registro. Transferir cuidadosamente los ba gelck a la bandeja de gel. </li><li> Enjuague el gel dos veces con 50 ml de agua desionizada durante 5 minutos con agitación suave. </li><li> Tinción del gel con 10 ml de un reactivo de tinción de Coomassie coloidal durante 60 minutos con agitación suave. destain de gel con 50 ml de agua hasta que el fondo se vuelve claro. Esta etapa de tinción se aplica a los geles de SDS-PAGE estándar también. </li></ol></li></ol>

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<li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se demuestra el beneficio de un enfoque combinado para analizar el montaje del proteosoma por nondenaturing PAGE utilizando proteasomas arqueas recombinantes. El método usual de 9,11 coexpresión bacteriana de subunidades del proteasoma permite el análisis rápido, pero puede no revelar montaje intermedios clave. Se aconseja la combinación de co-expresión con lisado de mezcla para desarrollar una visión más amplia de montaje de eventos. La ventaja de este enfoque combinado es que a ...

Complejos multiproteicos llevan a cabo numerosas actividades celulares críticas 1. Para muchos de estos complejos, se sabe mucho más acerca de su estructura y la función de aproximadamente el 2,3 de su montaje. El proteasoma es uno tan complejo y se encuentra en todos los ámbitos de la vida. En eucariotas, esta máquina molecular está en el núcleo del sistema de proteasoma / ubiquitina (UPS) y proporciona la principal vía de degradación de proteínas intracelulares 4. El proteasoma eucariota (referido como el proteasoma 26S) se compone de dos conjuntos principales sub: un proteasoma 20S, o núcleo de la partícula (CP) 5, que puede ser un tope en uno o ambos extremos por una partícula de regulación de 19S (RP) 6. El proteasoma 20S es un gran proteasa compartimentada. Su estructura cuaternaria se conserva absolutamente en todos los dominios de la vida y consiste en una pila de cuatro ciclos de siete miembros que contienen dos tipos de subunidades relacionadas estructuralmente, α; y ß 5,7,8. En eucariotas, los dos anillos exteriores están cada uno compuesto de siete subunidades alfa diferentes y los dos anillos interiores están cada uno compuesto de siete subunidades beta distintas; actividad proteolítica reside dentro de tres de las subunidades beta. Por el contrario, los anillos Cp de arqueas y bacterias normalmente se componen de un solo tipo de α y un tipo de subunidad β. Proteasomas arqueas han proporcionado un importante sistema modelo para estudiar el montaje del proteasoma tanto por su simplicidad compositiva y su compartir un mecanismo de ensamblaje común con sus homólogos eucariotas 9-13. En breve, las subunidades alfa ensamblan en anillos alfa primero, que sirven como un andamio sobre el que beta subunidades de montar. Las medias proteasomas resultantes (α 7 β 7) dimerize, dando lugar a ensamblados completamente CP (α β 7 7 7 β α 7). Durante la dimerización, los propéptidos presentan en subunidades ßse eliminan autocatalítica, la exposición de las treoninas N-terminales catalíticos. El uso de proteasomas arqueas para modelar ensamblaje tiene con frecuencia las ventajas de la producción de proteínas recombinantes del proteasoma archaea en Escherichia coli. Este es un enfoque valioso porque permite a las subunidades que se producen en diversas combinaciones, ya que ambos WT y versiones mutantes, en un organismo huésped que no produce sus propios proteasomas. El control de la asamblea de varios complejos de proteínas bioquímicamente requiere algún tipo de método de fraccionamiento que separa los complejos totalmente ensamblados de montaje intermedios y precursores. Debido a su capacidad de resolver superior, no desnaturalizante de poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) ha demostrado ser especialmente útil en el fraccionamiento de diversos grandes complejos multiproteicos 14-17. La combinación de la producción del proteasoma arqueas recombinante y PÁGINA desnaturalizante se ha convertido en un poderoso enfoque en dissecting ensamblaje proteasoma 9,11,12,18. Sin embargo, el método habitual por la que se aplica este enfoque (es decir. A través de la co-expresión recombinante de subunidades alfa y beta) tiene un inconveniente importante. Las reacciones de ensamblaje son cooperativas y fuertemente dependiente de la concentración 3. Dado que la concentración de proteínas dentro de las células es muy alta 19, debido a los efectos de volumen excluidos, reacciones de montaje se efectúen rápidamente in vivo. Por lo tanto es posible que se pierda importantes intermedios de montaje cuando se coexpresan alfa y beta subunidades. Aquí, argumentamos a favor de un enfoque combinado en el estudio del conjunto de proteasoma utilizando subunidades del proteasoma arqueas recombinantes. En este enfoque, se emplean dos métodos de mezcla coexpression y lisado. El primero permite el análisis rápido de montaje debido a la coexpresión es menos mano de obra. Esta última depende de la expresión separada de alfa y beta subunidades, seguido de mezcla. Aunque este requires un poco más esfuerzo que la co-expresión, es más que compensada por la capacidad de detectar intermedios que se pierden durante la co-expresión. Juntos, estos dos métodos pueden proporcionar una imagen más completa del conjunto del proteasoma.

<table><tbody><tr><td>Solución de acrilamida (40%)</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>La acrilamida no polimerizada es una neurotoxina. Use el equipo de protección adecuado</td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon ultra 0,5 mL</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de ensayo</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bisacrilamida (2%)</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Azul</td> <td>de bromofenolSigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 células competentes</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Reactivo de tinción coloidal coomassie para geles</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Sistema de documentación</td></tr> de <tr><td>gel Liberadores de gel</td><td>Biorad 1653320</td><td></td><td>Plástico en forma de cuña utilizado para separar placas de gel; útil para esparcir líquido.</td></tr><tr><td>Varilla de vidrio</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Jeringa de vidrio para carga de geles</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Kit de calibración nativo</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>Estándares de proteínas de alto peso molecular</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Creador de gradientes</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>Para la inducción de la expresión de proteínas</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Aparato de electroforesis en gel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Plásmido de expresión</td></tr><tr><td>Precision plus all blue</td> standard <td>Biorad</td><td></td><td>1610373 Estándar de proteínas moleculares para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Kit de mutagénesis de cambio rápido</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Sustrato fluorogénico</td></tr><tr><td>Talon Metal Resina de afinidad</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Cobalto inmovilizado</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Bacto BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>bandeja de muestras UV Biorad</td><td>1708271</td><td></td><td>Para la obtención de imágenes UV de geles</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

el examen de la asamblea proteasoma con recombinante arqueano proteasomas y desnaturalizante pÁgina: el caso de un enfoque combinado

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteasomas se encuentran en todos los ámbitos de la vida. Ellos proporcionan la principal vía de degradación de proteínas intracelulares en las células eucariotas, aunque su montaje no se conoce completamente. Todos los proteasomas contienen una partícula estructuralmente conservadas núcleo (CP), o proteasoma 20S, que contiene dos anillos de subunidades beta heptameric emparedadas entre dos anillos α subunidad heptameric. Archaeal proteasomas 20S son de composición más simple en comparación con sus homólogos eucariotas, sin embargo, que ambos comparten un mecanismo de montaje común. En consecuencia, arqueas proteasomas 20S siguen siendo modelos importantes para el montaje del proteasoma eucariota. En concreto, la expresión recombinante de 20S arqueas proteasomas junto con electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) ha dado muchas pistas importantes sobre la biogénesis del proteasoma. A continuación, se discute un medio para mejorar la estrategia habitual de la co-expresión de α del proteasoma arqueas y las subunidades ß antes de nondenaturiPÁGINA ng. Se demuestra que a pesar de la rápida y eficiente, un enfoque coexpresión solo puede faltar montaje intermedios clave. En el caso de la proteasoma, la coexpresión no puede permitir la detección de la media-proteasoma, una que contiene una α-anillo completo intermedia y una β-anillo completo. Sin embargo, este intermedio se detecta fácilmente mediante la mezcla de lisado. Sugerimos que la combinación de co-expresión con mezcla lisado se obtiene un enfoque que es más profundo en el análisis de montaje, sin embargo, sigue siendo no intensiva de trabajo. Este enfoque puede ser útil para el estudio de otros complejos multiproteicos recombinantes.

El montaje del proteasoma (Figura 1) comienza cuando subunidades se combinan para formar anillos 9. Esto se puede ilustrar cuando subunidades alfa de la archaeon Methanococcus maripaludis S2 se expresan en E. coli como C-terminal de hexahistidina marcado (marcado con His) derivados (Tabla 1). Cuando el α-su proteína recombinante se purificó por ICAR y se analizó por desnaturalizante PAGE, se observaron dos bandas (Figura 2A, carril 1). Hemos...

Este protocolo utiliza tanto la co-expresión de subunidades y de mezcla para un examen más a fondo de ensamblaje proteasoma subunidad recombinante postlysis.

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

El objetivo general de este experimento es analizar el ensamblaje de un complejo multiproteico, como el proteasoma, utilizando subunidades recombinantes y electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, o PAGE. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del proteasoma, como por ejemplo, qué especies intermedias se encuentran a lo largo de la vía de ensamblaje de este complejo proteico. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado rápido del ensamblaje mediante dos enfoques paralelos, lo que posibilita la detección de intermediarios en la vía y fuera de la vía. Este procedimiento comienza con la expresión bacteriana, tal como se describe en el protocolo escrito. Para realizar la lisis bacteriana, descongele la pastilla de células inducidas que coexpresan la combinación deseada de subunidades del proteasoma, sobre hielo durante cinco minutos. Una vez descongelada, re suspenda la pastilla en 600 microlitros de tampón de lisis. Incube la suspensión a 30

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Bioquímica

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

En este video, demostramos un ensayo de agregación de proteínas basado en células utilizando inhibidores del proteasoma, que bloquean la actividad del proteasoma, evitando que las proteínas mutantes mal plegadas, fusionadas a una etiqueta fluorescente, sufran una degradación proteasómica dependiente de ubiquitina, lo que lleva a su acumulación dentro del citoplasma celular. A continuación, los agregados de proteínas se visualizan y cuantifican mediante microscopía de fluorescencia.

Ensayo de formación de agregados de proteínas: un método para detectar y cuantificar la agregación de proteínas en células cultivadas tras la inducción por inhibidor del proteasoma

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Este método describe el clonaje, expresión y purificación de Nsa1 recombinantes para la determinación estructural por cristalografía de rayos x y dispersión de rayos-x de ángulo pequeño (SAXS) y es aplicable para el análisis estructural híbrido de otras proteínas que contiene tanto había ordenado y desordenado dominios.

La combinación de Cristalografía de rayos x con dispersión de rayos-x de ángulo pequeño para modelar regiones no estructuradas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito son cruciales para todas las funciones celulares. Adjunto, describimos un protocolo que permite el análisis paralelo de estas interacciones con una proteína de elección. Nuestro protocolo fue optimizado para cultivos de células vegetales y combina la purificación de la afinidad con la proteína basada en espectrometría de masa y detección de metabolitos.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Este protocolo describe en detalle la preparación de complejos nucleosómicos utilizando dos métodos de preparación de muestras para congelar rejillas TEM.

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Aprende a analizar el ensamblaje del proteasoma mediante subunidades recombinantes y electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Este método permite detectar intermediarios en la vía de ensamblaje de complejos multiproteicos.

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado (Video) | JoVE Journal

El examen de la Asamblea proteasoma con recombinante arqueano Proteasomas y desnaturalizante PÁGINA: El Caso de un enfoque combinado

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