Name: Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende a implementar cromatografía de exclusión por tamaño e intercambio iónico en línea con SAXS para mejorar la calidad de datos estructurales de proteínas. Este método minimiza la desnaturalización entre purificación y medición.

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Agradecemos el apoyo financiero para el proyecto de la beca francesa REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 y de las becas de investigación del Service de Santé des Armées y la Délégation Générale pour l'Armement. Estamos agradecidos al ESRF por el tiempo de haz SAXS. Agradecemos a Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister y Guy Schoehn por su apoyo financiero y científico.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para muchas macromoléculas, una etapa de purificación final utilizando cromatografía se requiere antes de la recolección de datos SAXS para obtener un buen conjunto de datos de calidad. Sin embargo, no todas las muestras se mantienen estables; que pueden ser propensos a la agregación o re-equilibración a una mezcla de estados de oligomerización. Por lo tanto, se requiere una etapa de purificación final en línea en la línea de luz para minimizar el tiempo entre la purificación y la recopilación de datos con el fin de obtener los datos SAXS mejor calidad. Dependiendo de las propiedades biofísicas de la proteína de interés, SEC-SAXS o IEC-SAXS pueden ser elegidos para obtener una calidad óptima de la muestra. Aquí, en una construcción de proteína derivada de la helicasa / primasa D5, ambas técnicas se explican y discuten. Adquisición de datos SEC-SAXS se está convirtiendo cada vez más estandarizado y está disponible en muchas líneas de luz BioSAXS. Análisis de los datos, especialmente la sustracción del fondo, es relativamente sencillo y fácil. Sin embargo, una señal de amortiguación establesy la separación suficiente de las especies macromoleculares sigue siendo esencial. Por lo tanto, es crítico para reservar el tiempo suficiente para equilibrar la columna a fondo. El fallo de este método puede ser debido a los contaminantes persistentes de tamaño similar a la proteína de interés, las concentraciones bajas, y tampones sensibles a la radiación. En la práctica, inicialmente, SEC-SAXS es ​​probable que se utilicen como el método de elección para la mayoría de las muestras macromoleculares. Sin embargo, muchos protocolos de purificación requieren una etapa de IEC antes debido a la presencia de contaminantes o agregación. Dado que cada etapa de concentración y la cromatografía se asocia con pérdidas de muestra (estimado en 30 a 50%) y el tiempo, directa IEC-SAXS es ​​ventajoso. Para las muestras que no se pueden purificar por SEC, ya sea debido a la presencia de &quot;contaminantes&quot; de tamaño similar o porque severamente agregado a las concentraciones necesarias, IEC-SAXS siempre sería el mejor enfoque adecuado. Además, los caudales más altos compatiblespor el número de columnas de IEC pueden ayudar a reducir el tiempo de tránsito entre la purificación y la medición. En el ejemplo que aquí se presenta, IEC se utilizó con una etapa de elución, lo que permite la separación de los estrechos picos de D5 323-785 de contaminantes eligiendo cuidadosamente las etapas de concentración de sal. En principio, el número de pasos es ilimitado, pero en la práctica, se requiere al menos 1 paso por el pico, y no demasiados debe ser elegido. Para el método de sustracción de fondo se ha descrito anteriormente, es crucial para medir un número relativamente alto de diferentes composiciones de amortiguamiento con el fin de encontrar el juego. Un inconveniente común de las dos técnicas es la falta de información precisa la concentración de proteína. Debido a esto, la determinación de masas precisa basada en la dispersión hacia delante no es posible. Para las proteínas globulares como D5 323 a 785, el volumen Porod ofrece una alternativa, aunque menos precisa estimación, la masa, pero para las proteínas altamente flexibles o desordenados, Este enfoque no sería válida. Una variación del gradiente por etapas método IEC-SAXS se presenta aquí es el uso de un gradiente lineal en su lugar. Si bien es posible trabajar con tantos pasos como se desee para aislar sub-picos usando una elución por etapas, en el enfoque de gradiente lineal, se requiere para optimizar las condiciones de gradiente cuidadosamente con el fin de separar los picos completamente antes de iniciar el SAXS experimentar. sustracción de fondo en este enfoque podría hacerse frame-sabia y pudo ser verificada mediante la comparación de los cuadros individuales, pero requiere el manejo de datos más avanzada y un software dedicado no existe todavía. La elección de una columna adecuada es crítica para ambas técnicas, ya que determina la separación de las especies macromoleculares. columnas de exclusión por tamaño difieren en la capacidad de carga, el rango de tamaño de macromoléculas separables, y la resolución, mientras que las columnas de intercambio iónico varían en el tipo y la densidadde sus cargos inmovilizados. Mientras que el protocolo presentado aquí es específica de la línea de luz ESRF BM29, la adaptación a cualquier otra línea de luz SAXS es, en principio, sencillo. Los principales requisitos son un suficientemente alto flujo de rayos X y un detector adecuado (idealmente un solo contador de fotones), para adquirir datos razonables de señal a ruido en el intervalo de segundos o menos, y un sistema de cromatografía líquida en línea capaz de crear gradientes. La implementación exacta sería, por supuesto, dependerá del entorno en línea de haz local. Los resultados obtenidos en D5 323-785 utilizando los dos métodos difieren ligeramente. El radio de giro es ligeramente menor para los datos de IEC que para los datos de la SEC, y los mínimos locales de la curva de dispersión se desplaza a vectores de dispersión de un poco más grandes. Esto significa que el D5 323-785 medido con IEC-SAXS es ligeramente más compacto que el D5 323-785 medido con SEC-SAXS. Esto podría be debido a diferencias en la preparación de la muestra, en el tiempo transcurrido entre la purificación y medida (IEC es más rápido), o, menos probable, a un contaminante en la muestra purificada-SEC. Los modelos de talón obtenidos de forma totalmente independiente con ambos métodos son comparables (Figura 1H). D5 323-785 muestra la estructura hueca hexameric espera 18. En conclusión, en línea de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño en línea son importantes métodos de purificación bioquímicas que pueden ser acoplados directamente a SAXS 6,7,9-12,25,26. La sustracción de fondo de los datos IEC-SAXS es ​​un poco más difícil y ambigua que para SEC-SAXS, pero sin embargo es posible. Dependiendo de las propiedades biofísicas de la proteína de interés, tanto SEC y IEC-SAXS permiten la optimización de la separación de las especies con las ventajas inherentes. Proporcionar el ingenio que los pasos de validación (como se describe) se observan correctamente, los datos resultantes pueden ser analizadosla confianza h, y los modelos se pueden determinar usando las herramientas estándar disponibles en la comunidad. Juntos, los dos técnicas permiten la separación en línea para una amplia gama de macromoléculas biológicas, produciendo datos no accesibles a través de mediciones estáticas estándar.

BioSAXS es una poderosa herramienta para determinar la forma de los objetos de tamaño nanométrico 1-4. La dispersión de los rayos X por una solución que contiene macromoléculas, de un tamaño en el rango de nm, se registra en ángulos muy bajos. Este rango angular contiene información acerca de los parámetros globales: el radio de giro; la distancia entre partículas más grande; la forma de las partículas; y el grado de plegamiento, la desnaturalización, o trastorno. La técnica no requiere cristales, y la macromolécula se queda en solución y por lo tanto se puede mantener en condiciones que imitan ciertos parámetros importantes de la célula, tales como fuerza iónica, pH, etc. El conocimiento de estos factores podría ayudar a determinar, por ejemplo, el estado oligomérico fisiológicamente relevante de una proteína de interés o para validar un modelo propuesto de un complejo. La caracterización de las interacciones proteína-proteína en diferentes condiciones de tampón, la creación de modelos de dominios que faltan, el refinamiento de modelos de homología, y el dela terminación de los estados plegado y desplegado discretos se puede realizar rápida y fácilmente 5. Al igual que con cualquier técnica, BioSAXS tiene debilidades intrínsecas: muestras de agregados o desnaturalizados, mezclas de partículas, muestras heterogéneas, daño por radiación, y los desajustes de amortiguamiento pueden resultar en datos de la ONU-interpretables. Para muchos métodos de análisis, se asume implícitamente que la muestra es monodispersa, el requisito de que es a menudo difícil de obtener en la práctica. En muchos casos, la degradación de la muestra es sutil y no se puede detectar en los datos por sí mismo, y cualquier intento de interpretar los datos da resultados inexactos o incluso engañosas. Para superar estos obstáculos, la combinación de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y SAXS se puso en práctica en muchas líneas de luz para garantizar la calidad de los datos y para hacer que esta técnica sea más accesible para las muestras cada vez más difíciles 6-11. Recientemente, hemos añadido un nuevo método para el repertorio mediante el desarrollo de intercambio iónico en líneacromatografía (IEC) -junto SAXS 12. Ambas técnicas están abriendo SAXS a una amplia gama de partículas biológicas antes imposibles de analizar. La elección del método a utilizar depende de las propiedades biofísicas de las partículas de interés. SEC separa macromoléculas por su tamaño, por lo que se necesita al menos una diferencia del 10% en la masa molecular aparente para la separación. Las limitaciones físicas de la columna y las propiedades fisiológicas de las muestras, como las superficies hidrofóbicas, la flexibilidad y la falta de estabilidad, también complican la recogida de datos, análisis e interpretación. Cromatografía de intercambio iónico, que separa las moléculas en base a su carga y, por lo tanto, su afinidad de unión a la columna de IEC, se puede utilizar en lugar de o además de la SEC. La carga total puede ser manipulado fácilmente cambiando el pH, o la variación de la concentración de sal del tampón, proporcionar un método relativamente simple para el el controladolución de las moléculas de la columna de la IEC. Mediante el uso de la carga, la separación de tipos y tamaños de moléculas similares, que de otro modo serían difíciles de separar, se puede realizar de forma rutinaria con la norma IEC. Además, IEC tiene la ventaja de ser capaz de hacer frente a las muestras diluidas, lo que permite que uno evite las etapas de concentración, que llevan el riesgo potencial de la desnaturalización de la proteína. Desafortunadamente, como la distribución de carga es altamente dependiente de la muestra, IEC requiere la optimización con respecto a el pH y las concentraciones de sal 13,14. Para muchas proteínas que son difíciles de expresar, purificar, o ambos, sólo bajas cantidades de muestra están disponibles para el estudio. Es importante que sea eficiente y para reducir al mínimo el número de etapas de purificación y, por lo tanto, las pérdidas. Por esta razón, la última etapa de purificación es en línea directamente antes de la adquisición de datos SAXS, con el fin de aumentar la probabilidad de la recogida de un buen conjunto de datos. aquí, Se presentan en línea y comparar SEC-SAXS e IEC-SAXS. Ambas técnicas se llevaron a cabo en la línea de luz BioSAXS BM29 en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Grenoble, Francia 15. Como caso de prueba, se utilizó el dominio D5N y helicasa de la proteína del virus vaccinia D5, que era bastante difícil de analizar estructuralmente utilizando otros métodos. El virus vaccinia es un miembro de la familia Poxviridae y es 98% idéntica a la virus de la viruela, la causa de la viruela. Utilizando el sistema de vaccinia, estudiamos la maquinaria de replicación, se centra aquí en la D5 esencial helicasa-primasa. D5 es una proteína de 95 kDa con un dominio N-terminal primasa arqueo-eucariota (AEP) 16 seguido de una región de clúster cisteína (res. 240 a 345) 16. Más hacia el C-terminal viene un dominio D5N (res. 340 a 460), que siempre se asocia con helicasas de tipo D5, y, finalmente, una superfamilia 3 (SF3) de dominio helicasa (res. 460 a 785) 17 (Figure 1A). El dominio helicasa de D5 construye una estructura de anillo hexameric que se necesita para la unión apretada al ADN. Gracias a los recientes estudios de SAXS y EM, las estructuras de baja resolución de la primasa y la helicasa dominios son ahora conocidos 18. Aquí, se muestra cómo utilizar las técnicas de cromatografía en línea ejecutados sobre la línea de luz BioSAXS BM29 en el ESRF para hacerse una idea de la estructura del fragmento C-terminal (residuos 323-785) de D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Gel de proteínas prefabricadas</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético glacial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Filtros centrífugos Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasas&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Columna de desalinización</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td></td> Roche <td></td> 656313 <td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Caldo LB Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb vector&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&nbsp; Eurofins mwg operón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR niño de purificación</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Tinción de gel de ADN segura</td><td>Tecnología de vida Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasa</td><td>ThermoFisher científico</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>hecho en casa</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Tecnología de vida Invitrogen C404003</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R column&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td><>strong>Softwares</td>Beamline software de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>control BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>desarrollo local</td></tr><tr><td>Camserver software</td><td>Dectris</td><td>n.a.detector</td> <td>software de control</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programa para alinear modelos ab initio&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio programa de reconstrucción</td>de</tr><tr><td>HPLC programa de HPLC Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>programa de HPLC LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Desarrollo local</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programa, que realiza la manipulación con el software experimental SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td> <td>para la visualización</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programa para superponer estructuras 3D</td></tr><tr><td><strongstrong>Name</strong</td><td>>Compañía</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic BioLogic Biofrac Colector de fracciones</td><td>Biorad</td> Sistema de HPLC Biorad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotecnología</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una saxs beamline

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

pequeño ángulo Biológica dispersión de rayos X (BioSAXS) es una poderosa técnica de la biología molecular y estructural utilizado para determinar estructura de la solución, el tamaño y forma de las partículas, y la relación de superficie a volumen de macromoléculas. La técnica es aplicable a una variedad muy amplia de condiciones de solución que abarcan una amplia gama de concentraciones, valores de pH, fuerzas iónicas, temperaturas, aditivos, etc., pero se requiere la muestra a ser monodispersa. Esta advertencia llevó a la implementación de sistemas de cromatografía de líquidos en líneas de luz SAXS. A continuación, describimos la integración aguas arriba de exclusión por tamaño (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico (IEC) en una línea de luz, diferentes métodos para la óptima sustracción de fondo, y la reducción de datos. Como ejemplo, se describe cómo usamos sec- y IEC-SAXS en un fragmento de la proteína esencial virus vaccinia D5, que consiste en un dominio D5N helicasa. Determinamos su forma general y el peso molecular, que muestra la estructura de hexameric THe proteína.

Los resultados del análisis invariante modelo libre se enumeran en la Tabla 1. El análisis de los datos D5 323-785 SEC-SAXS mostró una estimación masa molecular (a partir de un análisis de Porod) de 345 kDa frente a 338 kDa, observó el uso de la norma IEC-SAXS. Ambos están de acuerdo con la masa esperada de 53,5 kDa 6 veces (321 kDa) para un hexámero. El ab initio de modelado de ambos conjuntos de datos se llevó a cabo sin simetría impuesta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) y el uso de la simetría C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Como los ajustes globales de los datos de dispersión, tanto para reconstrucciones son comparables en ambos casos (Figura 1D y E), C6 simetría puede ser asumida. Así, el modelo corresponde a una estructura en forma de cono hexagonal con un canal central, que aparece parcialmente obstruida (SEC: Figura 1F; IEC: Figura 1H). Un examen de los modelos individuales antes de promediar muestra que esta obstrucción es probable que sea un artefacto del proceso de promediado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> Figura 1: análisis de los datos SAXS y comparación de D5 323 -785 (figura adaptados de Referencias 12 y 18). A) estructura de dominio esquemática de la proteína D5 y D5 323-785. B) Desconectado cromatograma de intercambio iónico con la indicación de los tres picos. curva de naranja: la absorbancia a 280 nm (au), curva azul: porcentaje de tampón B. Los porcentajes de tampón B en los picos se indican. C) Online cromatograma de intercambio iónico. tecla de color como en B. Además, la intensidad medida se indica en verde. La curva de dispersión experimental unand calculado curva del modelo obtenido por SEC-SAXS D) y IEC E) análisis de los datos de D5 323-785. Modelo F) del grano de 323-785 D5 basado en la SEC información y datos G) IEC. H) superposición de los modelos de la SEC e IEC. Los paneles en F) a H) fueron creados usando un software de visualización molecular 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parámetros de recopilación de datos </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Longitud de onda (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-rango (-1) </td><td> 0,0032 - 0,49 </td></tr><tr><td> De muestra a detector de distancia </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Tiempo de exposición (s) </td><td> 1 por trama </td></tr><tr><td> intervalo de concentración </td><td> n / A </td></tr><tr><td> Temperatura (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detector </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotones / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Tamaño del haz (m 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Parámetros estructurales para D5 323 a 785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [de la Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [de la Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min Rg - q max Rg utilizado para Guinier </td><td> 0,77 - 1,24 </td></tr><tr><td> D max (Å) [a partir de p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-gama utilizada para p (r) (Å -1)</td><td> 0,02 - 0,17 </td></tr><tr><td> Porod volumen V P (A 3) [de la dispersión] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Masa molecular M r (kDa) [de la V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Calculado monomérica señor de la secuencia (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Parámetros estructurales para D5 323 a 785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [de la Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [de la Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min Rg - q max Rg utilizado para Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (Å) [a partir de p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-gama utilizada para p (r) (Å -1) </td><td> 0,03 - 0,18 </td></tr><tr><td> Porod volumen V p (&amp; #197; 3) [de la dispersión] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Masa molecular M r (kDa) [de la V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Calculado hexameric señor de la secuencia (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: parámetros de datos de SAXS. La tabla resume los parámetros de SAXS adquisición y análisis de datos.

La determinación de la estructura de la solución de una proteína por un pequeño ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) requiere muestras monodispersas. A continuación, se presentan dos posibilidades para asegurar un retraso mínimo entre la preparación de la muestra y de adquisición de datos: cromatografía de exclusión por tamaño en línea (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico en línea (IEC).

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

El objetivo general de la implementación de la cromatografía en línea de exclusión por tamaño e intercambio iónico en líneas de haz de dispersión de rayos X de ángulo pequeño es obtener datos de modelos de baja resolución de mejor calidad al garantizar retrasos mínimos entre la preparación de la muestra y la adquisición de datos. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural. Al igual que la operación del radio, la distancia intraparticular más grande, la forma de la partícula, el grado de desnaturalización o desorden del plegamiento.SAXS requiere muestras molares dispersas. La principal ventaja de esta técnica es que el tiempo entre la purificación y la medición es corto, lo que ayuda a evitar la desnaturalización o advicción de la muestra. Antes de ir a la instalación de la línea de luz, prepare una muestra concentrada utilizando métodos publicados anteriormente y realice pruebas SEC.En la instalación de línea de luz, coloque un mililitro de tampón de filtración de gel en un tubo de reacción de 1,5 mililitros. A continuación, conecte el frasco de tampón de filtración de gel a un sistema de HPLC en línea con el capilar de flujo continuo de la configuración SAXS. Establezca el caudal, la presión máxima de la columna y el tiempo de adquisición.Nótese la contrapresión sin la columna. Purgue las líneas y, a continuación, conecte y equilibre la columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Cargue la muestra de tampón de un mililitro en el cambiador de muestras.Salga y asegure o bloquee la caseta experimental, luego inicie sesión en el software de control de la línea de luz en el modo de cambiador de muestras. Envíe la muestra tampón en el cambiador de muestras directamente a través del capilar de flujo SAXS. Realice una breve prueba de SAXS y compruebe que la intensidad de la dispersión de rayos X del sonido no muestre signos de daño por radiación.Cambie el sistema de control de la línea de luz al modo HPLC y realice una prueba SAXS del tampón a través del sistema HPLC SAXS completo. Si los datos no coinciden con la primera medición, vuelva a equilibrar y realice otra ejecución de prueba. A continuación, en el laboratorio, centrifugar la muestra de proteína a 13.000 veces G durante 10 minutos para eliminar los agregados.Transfiera el sobrenadante a un vial de vidrio compatible con HPLC. Cargue el vial en el muestreador automático, anotando la posición de la muestra. Enclava la conejera y crea una carpeta para los datos del experimento en el sistema de control de la línea de luz.Luego, en el software de HPLC, haga clic en lote rápido. Establezca la ruta del archivo y active la conversión automática ASCII de los datos UV Vis. Introduzca el volumen de inyección y la posición de la muestra en el muestreador automático.Haga clic en Inicio'para agregar la ejecución a la cola. Introduzca el nombre del archivo, pero no haga clic en guardar'todavía. En el software de control de la línea de luz, establezca el número de tramas de datos para que el tiempo de recopilación de datos SAXS sea ligeramente mayor que el tiempo de adquisición de HPLC.Abra el obturador de la línea de luz e inicie la recopilación de datos SAXS. Cambie al software de HPLC y haga clic en 'guardar' para inyectar la muestra. Anote el número de fotograma al comienzo de la adquisición de datos UV Vis y controle la intensidad sumada a lo largo del tiempo.Durante la preparación de la muestra, realice una prueba IEC con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 25 milimolar a un molar. Para cada pico de interés, determine la cantidad correspondiente de tampón B con alto contenido de sal en la fase móvil. Para comenzar el experimento IEC SAXS, reserve muestras de un mililitro de tampones A y B, y luego conecte los tampones al sistema HPLC.Configure los parámetros de HPLC y luego purgue el sistema y enjuague las líneas con tampón bajo en sal A. Conecte y equilibre la columna de intercambio iónico con tampón A. Cargue las muestras de un mililitro de tampones A y B en el cambiador de muestras. Enclave la caseta y realice una breve prueba de SAXS para cada muestra de tampón en el modo de cambiador de muestras para comprobar la susceptibilidad del tampón al daño por radiación. A continuación, cambie al modo HPLC y realice otra ejecución de prueba SAXS para el tampón A. Compare los patrones de dispersión con los obtenidos de la ejecución de la prueba del cambiador de muestras.A continuación, cree una carpeta para los datos del experimento. A continuación, diseñe un gradiente de HPLC escalonado que comience con un búfer B con un valor de sal alto del cero por ciento y aumente un cinco por ciento a intervalos de dos volúmenes de columna para alcanzar el 100 por ciento del tampón B. Configure una sola ejecución de gradiente en la que no se inyecte ninguna muestra. Abra el obturador de la línea de luz, inicie la recopilación de datos SAXS e inicie la ejecución de HPLC.Obsérvese el número de fotogramas transcurridos cuando comienza la recopilación de datos UV Vis. Después de la recopilación de datos, verifique que la intensidad sumada haya permanecido constante durante al menos 100 fotogramas y coincida con los valores obtenidos de las muestras de los tampones A y B. Luego, realice otro método de HPLC de gradiente paso a paso, comenzando desde el cero por ciento del tampón B. Cree un paso para cada valor de porcentaje B determinado en la ejecución de la prueba de gradiente IEC fuera de línea. Agregue pasos de degradado un punto porcentual por debajo y 1,5 puntos por encima de cada uno de esos valores.Establezca cada intervalo de paso en 2.5 volúmenes de columna y el paso final en el gradiente al 100 por ciento B. Diluya el sobrenadante según sea necesario para lograr la composición del tampón A. Detenga las bombas de HPLC, desconecte la tubería de la columna de los detectores y coloque el extremo de la línea en un recipiente para recoger el flujo de la columna. A continuación, transfiera la línea tampón A a la muestra diluida, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas en el tubo. Encienda las bombas para extraer la muestra en la columna.Una vez que el recipiente de muestra esté casi vacío, detenga las bombas y vuelva a colocar la botella de tampón A en la línea. Encienda las bombas y pase el tampón A a través de la columna durante dos volúmenes de columna, luego detenga las bombas y vuelva a conectar la columna a los detectores. Con el nuevo método paso a paso, configure una sola ejecución de HPLC sin inyección automática de muestras.Abra el obturador de la línea de luz y adquiera los datos SAXS y UV Vis. Controla la intensidad sumada a lo largo del tiempo. A continuación, utilice un software de posprocesamiento para convertir los datos de HPLC a un formato ascii.Utilizando un administrador de datos en línea, identifique las tramas SAXS correspondientes al pico de elución de la muestra. Verifique que el radio de giyración sea estable en todo el pico. Importe los fotogramas de pico en un programa de procesamiento de datos SAXS y cree una curva de dispersión media no corregida.Para SCC SAXS, confirme que la región Q alta del búfer promedio, no solo la curva de dispersión no corregida. Cargue y escale los fotogramas sustraídos automáticamente del pico y compruebe que no haya diferencias sistemáticas. Promedie todas las curvas para obtener la curva SAXS final.Para IEC SAXS, promedie 50 fotogramas de cada paso de degradado. Compare estos promedios con la curva no corregida y seleccione el paso de degradado con la mejor coincidencia de Q alta. Reste el promedio elegido de la curva no corregida para crear la curva SAXS final.Por último, determinar la distribución de la distancia de pares y realizar un modelado ab initio para determinar el modelo más representativo de la proteína. Los parámetros de los datos estructurales obtenidos de SEC e IEC SAXS de la proteína D5 fueron muy similares. Las estimaciones de la masa molecular concordaron con la masa predicha.El modelado ab initio se realizó sin simetría impuesta y con simetría C6. Ambos modelos son compatibles con los datos del experimento, lo que indica que la estructura de la proteína posee simetría C6. El modelado molecular produce una estructura piramidal hexogonal con un canal central parcialmente obstruido.Los modelos SEC e IEC promediados fueron muy similares. Al examinar los modelos individuales, se encontró que las obstrucciones del canal probablemente eran un artefacto del proceso de promediación. SAXS se está volviendo más razonable, más estándar, pero para muchos pasos de purificación y otros pasos de cromatografía de intercambio iónico necesarios para deshacerse de agregados o contaminantes.En este protocolo presentamos ambas técnicas, la cromatografía de exclusión de tamaño en línea y la cromatografía de intercambio iónico en línea en una línea de luz bio SAXS. Una advertencia de ambas técnicas es que no se conoce la concentración precisa de proteínas, por lo que no podemos determinar la dispersión de la masa molecular. Sin embargo, en el caso de las proteínas globulares, todavía podemos estimar el volumen de masa.Se podría aplicar un gradiente lineal en lugar del gradiente escalonado que usamos aquí en la cromatografía de intercambio iónico, aunque esto requiere una optimización de la condición de tampón para una separación óptima de los picos. Estas técnicas nos permiten recopilar datos SAXS de buena calidad, incluso en sistemas complicados.

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Investigación

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