Name: La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Aprende la criofijación por inmersión para estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión mediante microscopía electrónica de transmisión. Este método económico preserva excelentemente las estructuras celulares.

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Expresamos nuestro agradecimiento a M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet y A. Devin por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito. Estamos agradecidos con el poste de imagen electrónica del Centro de Imágenes de Burdeos donde se tomaron las imágenes. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de la Investigación Científica.

1. Preparación de Formvar cuadrícula Film NOTA: Realizar la manipulación cloroformo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas). Utilice 400 rejillas de cobre de malla de microscopía electrónica. Con otros tipos de rejilla (otros tamaños de malla, de oro y de rejillas de níquel), la calidad de congelación es peor. <ol><li> Preparar una solución de 100 ml de 0,3% formvar en cloroformo. Deje que se disuelva durante la noche sin agitación. </li><li> Ponga 400 de malla (número de agujeros por pulgada cuadrada) rejillas microscopycopper de electrones (diámetro 3,05 mm) en un vial de vidrio (altura de 3 cm y 2 cm de diámetro) que contiene acetona. Agitar el vial de vidrio con un movimiento circular de la mano. Eliminar la acetona con una pipeta de transferencia de plástico. Permitir que el disolvente se evapore durante 5 min. Transferencia de las rejillas mediante el vertido de ellos sobre un papel de filtro y dejar que se sequen durante 5 min. </li><li> Polaco un portaobjetos de vidrio 76 x 26 mm 2 frotándolo con un paño sin pelusa hasta brillante / resbaladizo.</li><li> Tomar un cristalizador (diámetro 15 cm, altura: 7 cm y la capacidad de 1.200 ml) y llenarlo hasta el borde con agua destilada. Limpiar la superficie del agua haciendo pasar una barra de vidrio sobre la superficie dos veces para eliminar el polvo. </li><li> Mantenga el portaobjetos de vidrio entre dos dedos y la inmersión en la solución formvar durante unos segundos. Hold en posición vertical se seque bajo un vaso de precipitados al revés durante 5 min. </li><li> Cuando la película está seca, la puntuación de los bordes de la lámina de vidrio con una hoja de afeitar afilada para definir los límites de la película a ser desalojados de la diapositiva. </li><li> Tome una respiración profunda y exhalar fuertemente sobre el portaobjetos para obtener una capa de vapor de agua sobre y debajo de la película para hacer la película ligeramente opaca y aumentar su visibilidad. <ol><li> Inmediatamente flotar la película sobre la superficie del agua cristalizador por tocar el fondo de la corredera con un ángulo de aproximadamente 30 °. Deje que el lanzamiento de la película de la diapositiva y despegarlo sobre la superficie del agua cristalizador. Tire suavemente de la película con laPinzas, si es necesario. </li></ol></li><li> Coloque suavemente las rejillas boca abajo en la película flotando en la superficie del agua en las regiones que son del espesor adecuado (alrededor de 10 nm) y sin arrugas. </li><li> Recoja la película cubriendo las rejillas con papel Joseph mientras flotan sobre la superficie del agua del cristalizador. <ol><li> Sosteniendo el papel de Joseph con una mano, toque un extremo del papel de Joseph en un extremo de la película. Espere hasta que el papel de Joseph esté completamente mojado. Retire el papel Joseph con las rejillas atascadas. </li></ol></li><li> Coloque las rejillas durante 24 h en una placa de Petri cubierta para su secado final y almacenamiento antes de su uso a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparación del medio de sustitución de congelación NOTA: El tetróxido de osmio (OsO 4 ) y el acetato de uranilo son productos químicos peligrosos. Manéjelos en la campana extractora de humos mientras esté usando el equipo de protección personal (EPP) apropiado, incluyendo una bata de laboratorio y guantes. Follow las advertencias de seguridad para el manejo (OSO 4) y acetato de uranilo. Utilice crioviales tóricas para evitar la fuga de OsO4. <ol><li> Los estudios ultraestructurales <ol><li> Ponga el vidrio OsO4 ampolla en un frasco de vidrio. </li><li> Romper la ampolla agitando el matraz. </li><li> Añadir un volumen apropiado de acetona 100% para obtener una concentración final del 4%. </li><li> Agitar y dispensar alícuotas de 1,5 ml en 1,8 crioviales mL. </li></ol></li><li> immunolabeling proteínas <ol><li> Colocar 0,05 g de acetato de uranilo en un matraz de vidrio. </li><li> Añadir 50 ml de acetona al 100%. </li><li> Se agita la solución con un agitador magnético. Cuando la solución se vuelve clara, filtrarla utilizando un filtro de 0,2 micras. </li><li> Dispensar alícuotas de 1,5 ml en 1,8 crioviales mL. NOTA: Preparar los crioviales que contienen medio de congelación-sustitución antes del proceso de congelación profunda y mantenerlos en -84 ° C congelador. Invertir el frasco de vidrio para tirar laOsO4 ampolla en los residuos peligrosos. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de células NOTA: Este paso es fundamental para el éxito del método. Para todos los tipos de células, cultivar las células para obtener el número indicado de células. Centrifugar en el tubo indicado en el momento y la velocidad especificada. <ol><li> Para obtener la consistencia apropiada de los gránulos de diferentes tipos de células, cultivar las células como sigue: <ol><li> Para Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, inocular la levadura en 5 ml de medio líquido mínimo o completo. Incubar durante la noche a 28 ° C, giratorio (180 rpm). Se mide la densidad óptica a 600 nm (OD 600) del cultivo durante la noche. Diluir las células de levadura a una DO 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 28 ° C, la rotación, para obtener 1 x 10 9 células de levadura 7. </li><li> Para Leishmania flagelo, inoparásitos culate en 5 ml de AM medio con 7,5% de FCS (suero de ternera fetal). Incubar durante la noche a 24 ° C, giratorio (180 rpm). Medir la OD 600 del cultivo durante la noche. Diluir las células de parásitos a un OD 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 24 ° C, la rotación, para obtener 5 x 10 8 células de parásitos 12. </li><li> Para Trypanosoma brucei, inocular parásitos en 5 ml de medio SDM-79 con 10% de FCS y 30 mg / ml de higromicina. Incubar durante la noche a 27 ° C, giratorio (180 rpm). Medir la OD 600 del cultivo durante la noche. Diluir las células de parásitos a un OD 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 27 ° C, la rotación, para obtener 5 x 10 8 células de parásitos 13. </li><li> Para Escherichia coli, inocular bacterias en 5 ml de medio DYT con 100 g / ml de ampicilina. Incubar durante la noche a 37 ° C, giratorio (180rpm). Medir la OD 600 del cultivo durante la noche. Diluir células de las bacterias hasta una DO 600 de 0,2 en 50 ml de medio selectivo fresco. Continuar incubar las células a 37 ° C, la rotación, para obtener 5 x 10 10 células de las bacterias 14. NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células en cultivo puede estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario. Muy lento crecimiento cepas de células pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente. </li></ol></li><li> Para todos los tipos de células, transferir el medio de cultivo que contiene las células a 50 ml tubo de polipropileno y se centrifuga durante 3 minutos a 1500 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet de todos los tipos de células en 1 ml de medio de cultivo celular relevante. </li><li> Centrifugar todos los tipos de células en un tubo de microcentrífuga durante 1 min a 3.900 x g. Eliminar completamente el sobrenadante. </li><li> Mantener las células en hielo. </li></ol> Nota: Manejar nitrógeno líquido con cuidado. Utilice equipo de protección personal, incluyendo cryogloves y gafas. El propano es potencialmente explosivo, por lo que realizar la licuefacción en una habitación bien ventilada o bajo una campana de humos. No se permiten llamas abiertas. <ol><li> Ponga aproximadamente 150 ml de nitrógeno líquido en una bandeja de poliestireno. Coloque una taza de latón (altura 3,6 cm, diámetro 2 cm y espesor 1,5 mm) en nitrógeno líquido para congelar ella. No deje que el nitrógeno líquido penetre en el vaso de latón. </li><li> Espere hasta que las burbujas desaparezcan para asegurarse de que la copa de latón se congela. </li><li> Ponga la manguera conectada al cilindro de propano en contacto con la pared de la copa de latón. </li><li> abrir con cuidado la válvula de la botella de propano. NOTA: En este paso, el propano se licua en la taza de latón. </li><li> Detener la licuefacción mediante el cierre de la válvula del cilindro de propano y rápidamente la eliminación de la manguera de gas. </li><li> Llene la bandeja de poliestireno con Ni líquidoTROGEN hasta 5 mm desde la parte superior de la copa de latón. No deje que el nitrógeno líquido penetre en la taza de latón. </li></ol> 5. Plunge congelación de la muestra <ol><li> Ponga aproximadamente 200 ml de nitrógeno líquido en la bandeja de poliestireno. Congelar pequeñas tazas de latón (altura 1,5 cm de diámetro de 2,5 cm y el espesor de 1 mm) poniéndolos en nitrógeno líquido. Ponga una taza para una muestra de células en suspensión. Tenga cuidado de no mezclar las muestras. Con este fin, poner la muestra 1 en la copa 1, la muestra 2 en la copa 2, etc. </li><li> Congelar las pinzas por el desplome de su punta en nitrógeno líquido. </li><li> Sumérgete una aguja doble de disección de borde en el sedimento obtenido en 3.5. </li><li> Usando pinzas, tomar una malla 400 de rejilla de microscopía de cobre recubierto con formvar preparado en el apartado 1. </li><li> Uso de la aguja de disección, colocar una gota de la pella obtenida en 3.5 en la parrilla. Prueba diferentes tamaños de gota (por ejemplo, 2, 5 y 10! L). </li><li> sumergirse Muy rápidamente la cuadrícula en poder de las pinzas en el gen de propano líquidopuntuación en la sección 4 y se agita la rejilla con movimiento circular durante unos segundos. </li><li> Rápidamente transferir la rejilla congelado con las pinzas para la pequeña taza de latón congelado en la sección 5.1. NOTA: Para cada muestra, hacer por lo menos 3 rejillas. Siempre congelar las pinzas antes de tomar una rejilla de cobre. </li></ol> 6. Freeze-sustitución NOTA: El tetróxido de osmio es potencialmente volátil, a fin de utilizar un respirador purificador de aire con cartuchos de vapor. Congelación de la fijador en nitrógeno líquido antes de la congelación de inmersión también es una solución. <ol><li> Para los estudios de ultraestructura, abrir los tubos de 1,8 ml criovial que contienen medio de congelación-sustitución preparado en la sección 2.1. Para los estudios de inmunolocalización, abrir los tubos de 1,8 ml criovial que contienen medio de congelación-sustitución preparado en el apartado 2.2. Coloque la tapa en los crioviales. </li><li> Congelar las pinzas por el desplome de su punta en nitrógeno líquido. </li><li> Rápidamente quite la tapa y la transferencia de las rejillas congeladas iONT los crioviales utilizando las pinzas. </li><li> Ponga la tapa en los crioviales. </li><li> Repita la operación para cada cuadrícula de cada muestra. </li><li> Cierre todas las tapas y se agita la crioviales con un movimiento circular de la mano para asegurar que las muestras están en el medio de congelación-sustitución. </li><li> Coloque los crioviales en una caja hermética durante 3 días en un congelador C -84 ° durante el proceso de congelación-sustitución. </li></ol> Calentamiento 7. Muestra <ol><li> Los estudios ultraestructurales <ol><li> Llevar los crioviales en una bandeja de poliestireno (para evitar un aumento repentino de la temperatura) a una C congelador -30 °. Colocarlos en el congelador a -30ºC durante 1 h. </li><li> Coloque los crioviales en un congelador C -15 ° durante 2 h. Colocar las muestras a 4 ° C durante 2 h y después durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el medio de sustitución de congelación con una pipeta de transferencia de plástico. Añadir aproximadamente 500 l de acetona al 100%. </li><li> Se agita la 1,8 ml criovialcon un movimiento circular de la mano y rápidamente se vierte la acetona (1,5 ml) que contiene las rejillas en un vial de vidrio (altura de 3 cm y el diámetro de 2 cm). </li><li> Enjuague el mismo criovial con 1 ml de acetona al 100% para estar seguros de haber transferido todos las rejillas. Se agita la criovial con un movimiento circular de la mano y se vierte el contenido del criovial en un vial de vidrio. </li><li> Enjuague cada vial de vidrio con 3 ml de acetona al 100% 3 veces durante 10 min. </li><li> Siga los procedimientos de incrustación y de inclusión como se describe en la referencia 15. Impregnar la muestra con concentraciones crecientes de resina epoxi en acetona (25%, 50% y 75%) e incrustar la muestra con resina epoxi 100% en cápsulas de gelatina. </li></ol></li><li> immunolabeling estudios <ol><li> Llevar a los 1,8 crioviales ml en una bandeja de poliestireno (para evitar un aumento repentino de la temperatura) a la -30 ° C congelador. </li><li> Coloque los crioviales durante 2 h en un congelador C -30 °. </li><li> En unos -30 °<html> C congelador, se agita la criovial con un movimiento circular de la mano y rápidamente vierte el medio de sustitución de congelación en un vial de polipropileno (altura 5 cm y diámetro de 1,5 cm). </li><li> Reemplazar el medio sustitución congelación con 2 ml de medio de congelación-sustitución fresco. </li><li> Colocar el vial de polipropileno durante 2 h en un congelador C -30 °. </li><li> Enjuague el vial de polipropileno durante 1 h con 2 ml de 100% de acetona y tres veces durante 1 h con 2 ml de etanol al 100%. </li><li> Siga los procedimientos de incrustación y de inclusión como se describe en la referencia 15. Impregnar la muestra con concentraciones crecientes de resina acrílica (25%, 50%, y 75% en acetona) e incrustar la muestra con resina acrílica 100% en cápsulas de gelatina. </li></ol></li></ol> 8. Visualización de muestras <ol><li> Después de la inserción, hacer 80 nm secciones ultra-delgadas de las muestras con un ultramicrotomo. Contraste las secciones con 2% de citrato de plomo a temperatura ambiente durante 1 minculo = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Utilice un microscopio electrónico de 80 kV o 120 kV para observar las secciones 15. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

TEM es un método poderoso para la observación ultraestructural de los orgánulos, células y tejidos. Criofijación / congelación-sustitución es actualmente el mejor método para la conservación de ambos ultraestructura y la proteína de la antigenicidad. Fijadores químicos penetran y actúan muy lentamente permitiendo de este modo reordenamientos estructurales antes de la estabilización completa de la ultraestructura 2. A la inversa, criofijación / congelación-sustitución estabiliza instantáneamente e...

Preparación de la muestra es crítico para el éxito de cualquier estudio de microscopía electrónica. Convencional fijación EM era el principal método para la fijación de tejidos o células para microscopía electrónica de transmisión (TEM) 1. En primer lugar, aldehídos y tetróxido de osmio se utilizan para fijar químicamente el material a temperatura ambiente. Luego, el material se deshidrató con disolventes orgánicos, se infiltró, y se embebió en resina epoxi. Este método depende de la tasa de penetración de los fijadores en la célula. En consecuencia, los artefactos y la extracción de los contenidos celulares se observan generalmente 2. Criofijación es claramente una mejor alternativa para la preservación de las estructuras celulares 3, manteniéndolos intactos. La más alta calidad de las imágenes de TEM 4 en las secciones de resina delgada se puede obtener usando el método de sustitución criofijación / congelación. El objetivo de esta técnica es obtener bi vitrificadomuestras ological sin formación de cristales de hielo o que contienen cristales de hielo lo suficientemente pequeñas como para no dañar la ultraestructura de las células. congelación de alta presión (HPF) y criofijación ultra-rápido, que también se llama paso de congelación (PF), dos métodos para cryofix muestras. HPF inmoviliza moléculas en la célula de forma instantánea y evita el daño causado por la fijación EM convencional. Existen varios tipos de máquinas de congelación y dispositivos de sustitución automáticos se han desarrollado 5. Las máquinas de congelación y consumibles (nitrógeno líquido, la muestra de los transportistas, etc.) son caros, pero que permiten para la producción de micrografías electrónicas de alta calidad 6, 7. PF es una técnica que se utilizó en la década de 1950 y que se describe en la literatura como simple y barato 8 .Durante el procedimiento de PF, la muestra preparada se congela a un ritmo rápido para obtener cristales de hielo tamaño de menos de 3 a 5 nm. Con este fin, la muestra essumergido en un criógeno líquido, tal como etano, propano, o una mezcla de etano-propano. Desde la década de 1950, las mejoras de PF se han hecho para hacer esta técnica a disposición de un mayor número de usuarios. Congelación de alta presión es actualmente la única forma viable para congelar una gran variedad de muestras más gruesa que 50 m (hasta un espesor de 200 micras para muestras en forma de disco) 5, mientras que PF es ampliamente utilizado para la imagen objetos pequeños (&lt;100 nm ), tales como complejos macromoleculares suspendidas en una película fina de hielo amorfo 9. Muestras grandes, por ejemplo las células eucariotas, se pueden cryofixed por PF, pero requiere soportes para muestras, tales como tubos de cobre capilar o sistemas de sándwich 8, 10, 11. Aquí, una rápida, fácil de usar y de inmersión tecnología de congelación / congelación-sustitución bajo costo utilizable para diferentes cultivos de células de suspensión se presenta.

<table><tbody><tr><td>Rejillas</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propano N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Aguja de disección de doble filo</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Crioviales</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio 8,5 mL</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio portaobjetos</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina acrílica</td><td>Microscopía electrónica Ciencias 104371</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi M endurecedor</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Ftalato de dibutilo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi M accelerateur</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Cristalizador</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph paper</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Tazas</td><td></td><td></td> de latón <td>hágalo usted mismo, tienda o hecho por usted mismo</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caja hermética</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Respirador purificador de aire</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho para respirador</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de partículas</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

la congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en microscopía electrónica de transmisión

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) es una herramienta extraordinaria para estudiar la ultraestructura celular, con el fin de localizar las proteínas y visualizar complejos macromoleculares a muy alta resolución. Sin embargo, para llegar lo más cerca posible al estado nativo, es necesaria conservación de la muestra perfecta. la fijación convencional microscopía electrónica (EM) con aldehídos, por ejemplo, no proporciona una buena conservación ultraestructural. La penetración lenta de fijadores induce reorganización celular y la pérdida de los diversos componentes de la célula. Por lo tanto, la fijación EM convencional no permite una estabilización instantánea y la preservación de las estructuras y antigenicidad. La mejor opción para el examen de eventos intracelulares es utilizar criofijación seguido por el método de fijación de congelación-sustitución que mantiene a las células en su estado nativo. congelación de alta presión / de congelación-sustitución, que conserva la integridad de la ultraestructura celular, es el método más comúnmente utilizado, pero requiere expensicinco equipos. Aquí, se presenta un método fácil de usar y fijación de congelación bajo costo seguido de congelación-sustitución de cultivos de células en suspensión.

En este artículo, se presenta un método de congelación-fácil de usar y de inmersión de bajo costo para ultraestructurales (Figuras 1 y Figura 2) y immunolabeling (Figura 3) estudios. Se demuestra que no es necesario contar con un equipo especial para el procedimiento de congelación-sustitución y que el procedimiento de calentamiento tarda menos de 6 h en lugar de las 24 h utilizando un sistema dedic...

Este manuscrito describe un método fácil de usar y criofijación bajo costo para la visualización de células en suspensión por microscopía electrónica de transmisión.

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

El objetivo de los siguientes experimentos es proponer una herramienta para estudios ultraestructurales y de inmunolocalización de células en suspensión para su visualización en microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es fácil de usar, de bajo costo y proporciona una excelente preservación de la estructura celular. Se trata de un cultivo de células en suspensión.En primer lugar, las células se recogen mediante diferentes centrifugaciones para obtener un pellet en un tubo de microcentrífuga. En un segundo paso, la muestra se congela rápidamente por congelación por inmersión, lo que inmoviliza las células y limita la formación de cristales de hielo. A continuación, se realiza la sustitución por congelación para reemplazar el agua por solvente que contiene tetróxido de osmio como fijador para estabilizar las estructuras celulares.Los resultados muestran que la congelación por inmersión y la sustitución por congelación preservan perfectamente la infraestructura de las células. La fijación química era un método principal para fijar tejidos o células para la microscopía electrónica de transmisión, pero con este método, generalmente se observan artefactos y extracción de cont

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se ilustra aquí el uso de electrones cryotomography (TEC) para estudiar la ultraestructura de las células bacterianas en casi nativo estados, a "macromoleculares" (~ 4 nm) de resolución.

Electron Cryotomography de las células bacterianas

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Obtener imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta calidad es un desafío, especialmente en el caso de las células vegetales, que tienen abundantes vacuolas grandes llenas de agua y espacios aireados. La congelación a alta presión en tándem y la sustitución rápida por congelación reducen en gran medida el tiempo de preparación de las muestras de plantas para TEM, al tiempo que producen muestras con una excelente conservación ultraestructural.

Tandem congelación de alta presión y la rápida congelación de sustitución de tejidos vegetales para Microscopía Electrónica de Transmisión

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, "Flash-y-congelación", que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Aquí se presenta un protocolo para el cultivo celular en membranas de nitruro de silicio y congelación por inmersión antes de la toma de imágenes de fluorescencia de rayos X con una nanosonda de rayos X criogénica de sincrotrón. Cuando sólo se proporciona nanoanálisis a temperatura ambiente, las muestras congeladas se pueden liofilizadas. Estos son pasos críticos para obtener información sobre la composición elemental intracelular.

Cultivo celular en membranas de nitruro de silicio y criopreparación para nanoanálisis de fluorescencia de rayos X de sincrotrón

Aquí, se presenta un protocolo que describe los pasos de preparación de la muestra y recolección de datos requeridos en la tomografía de rayos X criobla (SXT) para obtener imágenes de la ultraestructura de células crioconservadas enteras a una resolución de medio paso de 25 nm.

Una descripción cartográfica 3D de la célula mediante tomografía de rayos X cryo soft

Aquí mostramos cómo usar el dispositivo de congelación sándwich para la congelación rápida de especímenes biológicos, incluidas bacterias, levaduras, células cultivadas, células aisladas, tejidos animales y humanos y virus. También mostramos cómo preparar especímenes para la sección ultrafina después de una congelación rápida.

Congelación rápida utilizando un dispositivo de congelación sándwich para una buena preservación ultraestructural de especímenes biológicos en microscopía electrónica

Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Aquí, presentamos una línea para el fresado de haces de iones enfocados correlativos en 3D para guiar la preparación de muestras celulares para la tomografía crioelectrónica. La posición 3D de las proteínas de interés marcadas con fluorescencia se determina primero mediante criofluorescencia y luego se dirige a la molienda. El protocolo es adecuado para células de mamíferos, levaduras y bacterias.

Preparación de muestras mediante fresado por haz de iones focalizado correlativo en 3D para tomografía crioelectrónica de alta resolución

Este protocolo de video ilustra cómo realizar una tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido de muestras virológicas. Para obtener resultados óptimos, las muestras se preparan mediante congelación a alta presión y posterior sustitución por congelación.

Tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido en virología: imágenes 3D de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación

Aprende la criofijación por inmersión para estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión mediante microscopía electrónica de transmisión. Este método económico preserva excelentemente las estructuras celulares.

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión (Video) | JoVE Journal

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

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