La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

El objetivo de los siguientes experimentos es proponer una herramienta para estudios ultraestructurales y de inmunolocalización de células en suspensión para su visualización en microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es fácil de usar, de bajo costo y proporciona una excelente preservación de la estructura celular. Se trata de un cultivo de células en suspensión.

En primer lugar, las células se recogen mediante diferentes centrifugaciones para obtener un pellet en un tubo de microcentrífuga. En un segundo paso, la muestra se congela rápidamente por congelación por inmersión, lo que inmoviliza las células y limita la formación de cristales de hielo. A continuación, se realiza la sustitución por congelación para reemplazar el agua por solvente que contiene tetróxido de osmio como fijador para estabilizar las estructuras celulares.

Los resultados muestran que la congelación por inmersión y la sustitución por congelación preservan perfectamente la infraestructura de las células. La fijación química era un método principal para fijar tejidos o células para la microscopía electrónica de transmisión, pero con este método, generalmente se observan artefactos y extracción de contenido celular. Una alternativa a la fijación química es la criofijación.

Este método representa la mejor opción para producir la más alta calidad de morfología en secciones delgadas de resina. La congelación por inmersión es una técnica de criofijación que inmoviliza las moléculas de la célula de forma instantánea para evitar el daño causado por la fijación química convencional. Antes de congelar la muestra por inmersión, se debe preparar la rejilla cortada con película Formvar para utilizarla como soporte para la congelación.

Pula el portaobjetos de vidrio con un paño sin pelusa hasta que esté brillante y límpialo con un paño. Sumerja el portaobjetos de vidrio en una solución de Formvar 0,3% en cloroformo durante unos segundos y déjelo secar en posición vertical en un vaso de precipitados. La manipulación debe realizarse bajo una campana extractora utilizando equipo de protección personal debido a la presencia de cloroformo.

Después de llenar un cristalizador con agua destilada, pase sobre la superficie del agua una barra de vidrio para eliminar el polvo. Cuando la película esté seca, marque los bordes con una cuchilla de afeitar afilada para que la película se levante. Congela el portaobjetos exhalando abundantemente sobre el portaobjetos para obtener una capa de vapor de agua en la película.

Inmediatamente haga flotar la película sobre la superficie del agua tocando la parte inferior del tobogán con un ángulo de unos 30 grados con respecto a la superficie del agua. Baje lentamente el portaobjetos en el baño, quitando la película según sea necesario. La película Formvar se deposita lentamente en la superficie del agua.

Fije la película en el borde del cristalizador con unas pinzas. Coloque suavemente las rejillas de cobre de malla 400 boca abajo sobre la película en las regiones que tengan el grosor adecuado y sin arrugas. La película con rejillas se recoge cubriéndolas con papel Joseph mientras flotan en la superficie del agua.

Toma el borde del papel de José y la película con rejillas debe venir con él. No dejes que tus dedos toquen la superficie del agua o corres el riesgo de dejar una película en el agua. Deje que las rejillas se sequen varias horas antes de usarlas.

Para estudios ultraestructurales, coloque la ampolla de tetróxido de osmio en un matraz de vidrio. Agitar bien el matraz para romper la ampolla. Agregue el volumen adecuado de acetona al 100% para tener una concentración final del 4%Agite el matraz que contiene el medio de sustitución por congelación y dispense alícuotas de 1,5 mililitros en crioviales con pipeta de transferencia de plástico.

Cierre todas las tapas y manténgalas en el congelador a menos 84 grados antes de usar. Para estudios de inmunomarcaje de proteínas, prepare acetato de uranilo al 0,1% en acetona. Cuando la solución se vuelva clara, filtre con un filtro de 0,2 micrómetros y dispense alícuotas de 1,5 mililitros en crioviales.

Manténgalo en el congelador a menos 84 grados antes de usar. Para asegurarse de tener la consistencia adecuada de gránulos de diferentes tipos de células, las células de levadura cruda en un medio líquido completo como mínimo para obtener un 10 a las nueve celdas. Escherichia coli en medio DTY para obtener cinco células bacterianas de 10 a 10.

Leishmania flagelo en medio AM y Trypanosoma brucei en medio SDM79 para obtener cinco células de 10 a ocho parásitos. Transfiera el medio de cultivo que contiene las células en suspensión a un tubo de propileno de 50 mililitros y centrifugue durante tres minutos a 1.500 g. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro del medio de cultivo celular respectivo.

Centrifugar en un tubo de microcentrífuga durante un minuto a 3.900 g. Retirar completamente el sobrenadante. Para el método de congelación por inmersión, se debe usar una botella de propano con un tubo conectado al cilindro de propano.

Dado que el propano es potencialmente explosivo, realice la licuefacción en una habitación bien ventilada o en una campana extractora. No se permiten llamas abiertas. Siempre se debe usar equipo de protección personal, incluidas las criogénicas, cuando se use nitrógeno líquido.

Ponga una pequeña cantidad de nitrógeno líquido en una bandeja de poliestireno. Coloque la taza de latón en nitrógeno líquido. Aparecen burbujas.

Espera hasta que las burbujas disminuyan. A continuación, se congela la copa de latón. Ponga el tubo conectado al cilindro de propano en contacto con la pared de la tapa de latón.

Abra suavemente la válvula del cilindro de propano. Se forma una gran cantidad de humo a medida que el propano no comienza a licuarse. Cuando el propano comienza a licuarse, el humo desaparece.

Detenga la licuefacción cerrando la válvula del cilindro de propano y retirando rápidamente el tubo conectado al cilindro de propano. Llene la bandeja de poliestireno con nitrógeno líquido hasta cinco milímetros desde la parte superior de la taza de latón. Congelamos pequeños vasos de latón donde reemplazaremos la muestra después de congelarla poniéndolos en nitrógeno líquido.

Ponga una taza por una muestra. Tenga cuidado de no mezclar muestras. Para obtener la consistencia adecuada del pellet, solo es necesario respetar las condiciones de cultivo y los parámetros de centrifugación indicados anteriormente.

Congela las pinzas antes de usarlas. Tome una rejilla de microscopía de cobre de malla 400 cortada con Formvar. Sumerja una aguja de disección de doble filo en el pellet.

Coloque, con la herramienta, una gota de pellet en la rejilla. Sumerja muy rápidamente la rejilla en propano líquido y revuelva durante unos segundos. Transfiera rápidamente la rejilla congelada en la pequeña taza de latón.

Para cada muestra, haga al menos tres cuadrículas. No olvide congelar las pinzas antes de tomar una cuadrícula. Congela las pinzas antes de usarlas.

Retire rápidamente la copa y transfiera las rejillas congeladas al criovial con las pinzas. Vuelva a colocar la tapa en el criovial. Repita la operación para cada cuadrícula de cada muestra.

Cierre las tapas y revuelva el criovial para asegurarse de que las muestras estén en medio de sustitución por congelación. Deje los crioviales durante tres días en el congelador a menos 84 grados. Lleve los crioviales en una bandeja de poliestireno para evitar un aumento repentino de la temperatura hasta el congelador de menos 30 grados.

Deje una hora a menos 30 grados. Lleve los crioviales a menos 15 grados durante dos horas, luego coloque las muestras a cuatro grados durante dos horas y 30 minutos a temperatura ambiente. Retire el medio de sustitución de congelación con pipetas de transferencia de plástico y colóquelo en una botella de desecho adecuada claramente identificada.

Pon unos 500 microlitros de acetona al 100%. Abra el frasco de vidrio y agite el criovial y coloque rápidamente el medio de sustitución de congelación en un vial de vidrio. Enjuague un criovial con acetona al 100%.

Enjuague tres veces 10 minutos con acetona al 100%. Lleve los crioviales en una bandeja de poliestireno para evitar un aumento repentino de la temperatura hasta el congelador de menos 30 grados. Deje dos horas a menos 30 grados.

Después de colocar las muestras en un vial de polipropileno, reemplace el medio de sustitución de congelación por un medio de sustitución de congelación fresco y deje dos horas a menos 30 grados. Enjuague una hora con acetona al 100% y tres veces una hora con etanol al 100%. El método de congelación por inmersión/sustitución por congelación dio como resultado una excelente conservación de las estructuras intracelulares de las células en suspensión.

En Saccharomyces cerevisiae, las estructuras no se encogen y el citoplasma parece denso. Además, las membranas son lisas, lo que es una prueba de una buena conservación. Todos los orgánulos, como el núcleo, las mitocondrias y las vacuolas, se pueden identificar perfectamente.

También se observa una excelente conservación en el flagelo de Leishmania, Trypanosoma brucei y Escherichia coli. En el núcleo, la doble membrana que forma la envoltura nuclear, el poro nuclear, el cuerpo del polo del huso y los ribosomas unidos a la membrana externa de la envoltura nuclear son claramente visibles. En las mitocondrias, las invaginaciones de la membrana interna, llamadas crestas, son claramente visibles.

Los orgánulos críticos son las vacuolas, porque los grandes cristales de hielo pueden desarrollarse fácilmente. En la imagen, las vacuolas se conservan perfectamente sin daños por cristales de hielo. El método de congelación/sustitución por congelación también se puede utilizar para realizar la inmunolocalización de proteínas.

El procedimiento conserva perfectamente la antigenicidad de la proteína y, como se mencionó anteriormente, los orgánulos están claramente identificados. Ya se han probado diferentes anticuerpos para dirigirse a diferentes proteínas de la levadura, como la anti-ATP sintasa y la anti-porina. Este experimento también es posible para diferentes sistemas experimentales, como en Leishmania, donde se localizó la proteína flabarina.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras con el método de congelación por inmersión / sustitución por congelación para visualizarlas en microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es rápida, fácil de usar, de bajo costo y proporciona una excelente preservación de las infraestructuras celulares. Tenga cuidado con el nitrógeno líquido, pero especialmente con el tetróxido de osmio y el acetato de uranilo.

Deben manipularse en la campana extractora mientras se usa el equipo de protección personal adecuado, incluida la bata de laboratorio y los guantes.