Name: La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar óxido nítrico en muestras biológicas mediante quimioluminiscencia, midiendo nitritos y nitratos con soluciones reductoras de triyoduro y cloruro de vanadio. Esta técnica sencilla y sensible permite rastrear el metabolismo del NO.

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Los autores quieren reconocer las contribuciones importantes de Dr. A. Dejam y MM Pelletier en el desarrollo del uso de la solución de nitrito de preservar para las mediciones de nitritos en la sangre.

Todos los protocolos que incluyen el uso de animales fueron aprobados para su uso por NIDDK Cuidado de Animales y el empleo y se obtuvo sangre humana a partir de bancos de sangre de donantes sanos NIH. 1. Preparación de muestras <ol><li> Preparación de solución de nitrito de preservar <ol><li> Preparar una solución que contiene 890 mM de ferricianuro de potasio (K 3 Fe (CN) 6) y NEM mM 118 (N-etilmaleimida) en agua destilada. Disolver bien hasta que quede claro de color amarillo sin cristales presentes. Añadir NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) en una relación 1: 9 (v / v, NP-40 / solución). Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma y se almacena a 4 ° C durante aproximadamente una semana). </li></ol></li><li> Recogida y preparación de muestras de sangre <ol><li> Recoger la sangre usando al menos una aguja de 20 G para evitar la hemólisis con heparina para evitar la coagulación (5 U / ml). Para la muestra de sangre, se mezcla la sangre con nitrito de solución de conservación inmediatamente en una proporción de 1: 4 (v/ V / solución de sangre). </li><li> Para las muestras de plasma y células rojas de la sangre, se centrifuga la sangre recogida durante 5 minutos a 4000 xga 4 ° C para separar las células rojas de la sangre (RBC) y plasma. Tome el sobrenadante (plasma) y se mezcla con nitrito de solución de conservación como se describe anteriormente para la determinación de los niveles de nitrito en plasma. </li><li> Retire cuidadosamente el plasma y la capa leucocitaria de la muestra y la pipeta de muestra RBC desde la parte inferior del tubo restante para evitar la contaminación por otros tipos de células de la sangre utilizando una punta de pipeta de corte, y la transfiere en un tubo que contiene solución de conservación de nitrito en el mismo relación que anteriormente. </li><li> Mezclar cada muestra (plasma y RBC) con metanol frío con una relación de 1: 1 o 1: 2 (v / v de la muestra / metanol) y se centrifuga a 13.000 xg ellos a 4 ° C durante 15 min para precipitar las proteínas. Tomar el sobrenadante y utilizarlo para la medición de nitritos o congelar muestras preparadas, si es necesario, en hielo seco y almacenar a -80 ° C. Nota: El nitrito rea rápidamentects con la oxihemoglobina (oxiHb) de nitrato de formación de sangre. Desde oxiHb siempre está presente en gran exceso sobre el nitrito, esta reacción conduce a la aniquilación casi completa de nitrito de sangre nativa con un marco de tiempo de ~ 10 min. Con el fin de preservar la mayor parte de nitrito de sangre endógena, se añadió una solución de nitrito de preservación de las muestras de sangre inmediatamente después de la extracción de sangre. La solución lisar rápidamente glóbulos rojos y oxidar oxiHb en metahemoglobina (metahemoglobina), una forma inactiva de la hemoglobina que no reacciona químicamente con nitrito. </li></ol></li><li> Preparación de las muestras de otros tipos de fluido corporal <ol><li> Después de la recogida de la muestra en un recipiente adecuado, mezclar bien con nitrito de preservar la solución, y medir deproteinate inmediatamente o congelar y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Recogida y preparación de muestras de tejido <ol><li> Recoger tejidos de animales perfundidos con solución salina heparinizada (10 U HEPArin / ml). Impuestos Especiales sobre 1 g de tejido deseado y homogeneizar, ya sea usando un homogeneizador manual o un homogeneizador automatizado. </li><li> Añadir cantidad conocida de nitrito de solución de conservación según sea necesario para lograr homogeneizado suave. </li><li> Una vez que el tejido se homogeneiza, precipitar proteínas utilizando metanol frío (1: 1 o 1: 2 relación v / v de la muestra / metanol) como se describió anteriormente, las muestras de centrifugar a 13.000 xg a 4 ° C durante 15 min. </li><li> Recoge los niveles de nitrito sobrenadante y medida. Si es necesario, congelar las muestras en cualquier etapa de la preparación en hielo seco y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de soluciones reductoras <ol><li> Tri-yoduro (I 3) la reducción de solución de nitrito y R- (X) -NO especies determinación 1,3,4 <ol><li> Preparar una solución de KI 301 mM junto con una solución de 138 mM I 2 en agua. Mezclar con ácido glacial acético en proporción de 2: 7 (v / v / solución de ácido) en un agitador magnético durante ~ 30 min hasta que todocristales se disuelven. Preferiblemente tener en botella oscura, como yoduro es sensible a la luz, y el uso dentro de una semana desde su preparación. Nota: Esta solución reducirá el nitrito en NO y que también dará a conocer NO a partir de R-SNO, R-NNO y NO-Fe grupos funcionales (R- (X) -NO), pero el nitrato no se verá afectada. La señal de los grupos funcionales basados ​​en NO anteriores se puede separar de la verdadera señal de nitrito por tratamiento de la media de la muestra con sulfanilamida acidificada (AS) y comparar AS tratada y la señal no tratada. AS irreversiblemente forma catión diazonio con nitrito y este complejo no puede ser reducida por I 3 solución. Porque así como el tratamiento, preparar una solución 290 mM de sulfanilamida en HCl 1 M y añadirlo a una parte alícuota de la muestra en relación 1: 9 (v / v AS / muestra). Medir la señal CL en piezas tratadas y sin tratar AS-de la muestra. Se calcula la verdadera señal de nitrito como una diferencia de parte tratada y no tratada AS-de la muestra. El nitrito puede ser también midió mediante el uso de una liendre selectivaRite-reducción solución de mezcla de ácido ascórbico / ácido acético como se describe en la parte 2.2. Sin embargo, debido a la generalmente pequeña cantidad de R- (X) -NO especies presentes, las mediciones usando muestras AS-no tratados son en la mayoría de los casos una muy buena aproximación del contenido total de nitrito. </li></ol></li><li> / Solución de ácido acético (4A) de ácido ascórbico para la determinación selectiva de nitrito de 2 <ol><li> Preparar ácido ascórbico 500 mM en agua. Mezclar esta solución con ácido acético glacial en una relación 1: 7 (v / v, ácido ascórbico / ácido acético) para preparar la mezcla de reacción. Nota: Esta solución es específico para el nitrito, no va a liberar NO desde cualquier R- (X) -NO especies o nitrato. Sin embargo, la solución de ácido ascórbico y ácido acético debe prepararse poco antes de cada día de las mediciones, como el ácido ascórbico se oxida fácilmente en solución. La finalización de la reducción de nitrito depende de la concentración de ácido ascórbico; y ácido ascórbico al menos 50 mm se recomienda para r completaeducción de nitrito de plasma. Sin embargo, se recomienda llevar a cabo unos experimentos piloto con diferentes concentraciones de ácido ascórbico y normas de nitritos en el rango de concentración de nitrito esperado antes de las mediciones de muestras finales. Tenga en cuenta que el ácido ascórbico reduce ligeramente durante las mediciones, se recomiendan cambios tan frecuentes de mezcla de reacción en la cámara de reacción de vidrio. </li></ol></li><li> El vanadio (III) cloruro de solución reductora para la determinación de nitrato de 9 <ol><li> Preparar la solución de 51 mM de VCl3 en HCl 1. Filtrar la solución a través de filtro de 200 micras y guardar en un frasco oscuro, utilice el plazo de dos semanas. Nota: Esta solución reducirá nitrato, nitrito y todo R- (X) -NO especies, por lo que si cantidades comparables de nitrito u otro R- (X) -NO especies están presentes junto con el nitrato, el contenido final de nitrato tienen que ser calculados como la diferencia entre las señales CL obtenidos con VCl 3 y I3 la reducción de las soluciones. </li></ol></li></ol> 3. La quimioluminiscencia (CL) de configuración del analizador y Medidas <ol><li> Solucion estandar <ol><li> Preparar 1 M solución de nitrito sódico (NaNO2). La misma solución se puede utilizar para las determinaciones de nitrito y nitrato. </li></ol></li><li> El uso de analizador de NO Nota: En la actualidad hay dos disponibles comercialmente NO analizadores que son lo suficientemente sensibles como para fines de investigación biológica - Sievers NOA y 88Y Ecophysics EPC. Ambos operan en el mismo principio; la principal diferencia es que la EPC 88Y utiliza el oxígeno del aire de la habitación para que el ozono (O 3), mientras que NOA requiere un tanque de oxígeno externo para este propósito. El procedimiento siguiente describe la puesta en marcha de la Sievers NOA. <ol><li> configuración del instrumento <ol><li> Realizar una configuración inicial de la analizador de NO de acuerdo con las recomendaciones del fabricanteSegún lo visto en la Figura 1. </li><li> Abrir O2 depósito conectado al instrumento. Elija &quot;análisis&quot; y &quot;entrar&quot; en el menú principal en el panel frontal. En la siguiente pantalla seleccione &quot;Iniciar&quot; y pulse &quot;enter&quot;. Conectar la trampa ácido (que contiene NaOH 1 M) en el instrumento como se ve en la Figura 1. </li><li> Esperar hasta fotomultiplicador se enfría a temperatura por debajo de -12 ° C y la cámara de reacción se evacua a 6 Torr. Se tarda unos 30 minutos para llegar a una línea de base plana y estable. La línea de base necesita para estabilizar dentro de 1 - 2 mV, su valor nominal es menos importante que su estabilidad. Nota: Si se mide el nitrato, encender el baño de enfriamiento de agua (establecido a 4 ° C, la cual sirve como trampa fría para ácidos y vapores de agua) y el baño de agua de calentamiento (la cámara de reacción principal, 95 ° C). La velocidad de la reducción de nitrato en NO en solución VCl 3 es dependiente de la temperatura, y es muy lento a tempe habitacióntura, por lo que se necesita aumento sustancial de la temperatura para observar la reacción. </li><li> Se abrirá el tanque y conecte la cámara de reacción de vidrio para atrapar el ácido como se ve en la Figura 1. Llenar la cámara de reacción con una solución de reductor apropiado, reducir la formación de burbujas al mínimo y conecte la cámara de reacción a la trampa de ácido. El uso de ensayo y error, ajustar la velocidad de burbujeo Él para que coincida con la velocidad de aspiración instrumento (normalmente ~ 200 ml / min para el NOA de Siever). </li><li> Encienda el ordenador que controla el instrumento e inicie el software líquido basado en Labview. Para activar la comunicación entre el instrumento y el software de adquisición, pulse &quot;enter&quot; cuando en &quot;menú de datos de&quot; hasta que la pantalla se lee &quot;activar la salida&quot;, a continuación, presione &quot;claro&quot; para volver de nuevo a la pantalla de datos. </li><li> Esperar a que una traza de línea de base estable en la pantalla y comenzar la inyección de las muestras y patrones de nitrito en la reducción de solución a través del septum. Siempre esperar a llegar a una línea de base estable popaer el pico. Esto puede tardar hasta 2 minutos. El software de líquido tiene una opción para &quot;marcar&quot; los tiempos de inyección y anotar la inyección y se exportará estos comentarios en un archivo separado (filename.info) como un complemento útil para el archivo de datos (filename.data). </li><li> Una vez que se miden las muestras y patrones, elegir la opción &quot;parada&quot; opción en el menú del software Liquid - esto va a escribir los datos de un archivo temporal en un archivo permanente conocida como &quot;filename.data&quot;. Al pulsar la opción de &quot;abortar&quot; terminará la medición sin necesidad de escribir los datos adquiridos en un archivo permanente. </li><li> Para terminar el experimento, desconectar la máquina de la vasija de reacción apagando la llave de paso en la parte superior del recipiente de reacción y desconectar el tubo entre la trampa y ácido recipiente de reacción (véase la Figura 1). Ahora deja de analizador de NOA - presione &quot;claro&quot;, vaya a &quot;análisis&quot;, máquina de poner en &quot;espera&quot; y espera &quot;confirmar&quot;. Si se usa con regularidad, lainstrumento puede dejarse en modo de espera durante varias semanas. Cierre el suministro de oxígeno. A continuación, enjuagar la solución reductora de la cámara de reacción, de desconexión y cierre del depósito de Él del recipiente de reacción de vidrio y termine de limpiar recipiente de reacción. </li></ol></li><li> Normas y inyecciones de muestra <ol><li> Inyectar 50 l de solución de nitrito de 1 mM en la mezcla de reacción usando una jeringa Hamilton bien lavada. Espere por lo menos 1 - 2 minutos entre cada inyección para lograr una buena separación de los picos. repetición de la inyección de 50 l para obtener duplicados a cada punto de datos. Lavar la jeringa con agua desionizada después de cada inyección. </li><li> Para adquirir un conjunto completo de datos para la curva estándar, continuar con las inyecciones duplicadas de 100, 150 l (200 l adicionales podrían ser necesarias si se espera que las altas concentraciones de nitrito o nitrato) de solución de nitrito de 1 mM. En cada caso, tenga cuidado que esperar hasta que la señal pasa de nuevo a la línea de base y luego adquirir 1 - 2 millasn de la línea de base para lograr una buena separación de los picos. Nota: las normas de nitrito se pueden medir en cualquier momento durante los experimentos. Sin embargo, es preferible adquirir la curva estándar antes de la medición de datos, ya que también sirve como un control independiente de la funcionalidad de instrumento. Cuando se recogen los datos, cantidad de muestra inyectada debería conducir a picos bien pronunciadas. Sin embargo se debe tener en cuenta que el fotomultiplicador es lineal sólo hasta ~ 800 mV, por lo que ninguno del pico debe ser superior a ~ 700 mV. Esto se puede lograr ya sea por la disminución de la cantidad inyectada de la muestra o la dilución de la muestra con agua desionizada. Cada punto se debe medir al menos por duplicado. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

El Dr. Alan Schechter aparece como co-inventor de varias patentes concedidas a los Institutos Nacionales de la Salud para el uso de sales de nitrito para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Él recibe las regalías sobre la base de los NIH concesión de licencias de estas patentes para el desarrollo clínico, pero sin otra compensación.

Los pasos críticos dentro del Protocolo Las alícuotas de todas las soluciones (incluyendo el agua) que se usan para preparar, diluir o tratar de otro modo las muestras originales tienen que ser guardados y revisados ​​para su posible nitrito o (más a menudo) la contaminación por nitratos. Encontramos que la mayoría contaminación proviene del agua y muchos productos químicos utiliza para tratar la muestra (ferricianuro en particular) también contiene cantidad significativa de contaminación con n...

Nitrito y nitrato a un menos extender, los niveles en la sangre refleja el estado general del cuerpo NO metabolismo. las concentraciones de nitrito en la sangre y la mayoría de los órganos y tejidos son sólo en alta nanomolar o rango micromolar bajo, el nitrato es por lo general presentes en cantidades mucho más elevadas - en el rango micromolar. Los cambios en los niveles de nitritos debido a la progresión de la enfermedad o los cambios en los hábitos alimenticios son bastante pequeñas y sólo pueden ser medidos usando un método muy sensible. Debido a sus muy diferentes niveles y diferentes procesos metabólicos, determinación separada de los niveles de nitrito y nitrato es esencial. El llamado &quot;NO determinación x&quot;, donde nitritos y nitratos se mide en conjunto tiene muy poco valor. Se han desarrollado varios métodos para la cuantificación de nitrito en diversas muestras biológicas - siendo el más común el más antiguo, en base a la reacción de Griess que había sido descrito originalmente en 1879. Incluso con modificatio modernons, el límite de sensibilidad para el nitrito alcanzable por el método de Griess &#39;está en el rango bajo micromolar. Quimioluminiscencia (CL), combinado con tri-yoduro de solución reductora, se considera actualmente el método más sensible, lo que permite la cuantificación en el intervalo nanomolar bajo de concentraciones de nitrito 1-8,10,11. El mismo método CL, en combinación con vanadio (III) cloruro solución reductora, se puede utilizar para mediciones sensibles de nitrato, con precisión en el rango nanomolar 9. CL detecta gas libre NO. Por lo tanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotioles (R-SNO), R-nitrosaminas (R-NNO), o compuestos de metal-NO (más adelante en el manuscrito que se refiere como &quot;R- (X) -NO&quot;), deben ser convertidos en liberar el gas NO con el fin de cuantificar su valor de origen a través de CL. La conversión a NO se consigue utilizando varias soluciones de reducción diferentes, dependiendo de la naturaleza de la NO metabolito. Después de la conversión, libre de gas NO se purga del recipiente de reacción por un gas portador (He, N2 o Ar) en la cámara de reacción del analizador CL donde el ozono (O 3) se combina con el NO para formar dióxido de nitrógeno (NO 2) en su estado activado. Con el retorno al estado fundamental, NO2 * emite en la región del infrarrojo y fotón emitido es detectado por fotomultiplicador (PMT) del instrumento CL. La intensidad de la luz emitida es directamente proporcional a la concentración de NO en la cámara de reacción, que permite el cálculo de la concentración de la especie original utilizando curvas de calibración adecuados. En nuestro protocolo, que la determinación basada en CL primer regalo de nitrito y nitrato en los entornos clínicos más utilizados - en la sangre y el plasma, y ​​luego se discute cómo determinar estos iones en muestras de tejido. También explicamos en detalle cómo conservar la concentración de nitrito fisiológico original en entornos de nitrito-reactivos, tales como la sangre y sus compartimentos, plasma y células rojas de la sangre.

<table><tbody><tr><td>ferricianuro de potasio; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-nonilfenil-polietilenglicol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamida; AS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético, ácido</td> ascórbico <td>glacial Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>yoduro de potasio; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>yodo; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td> nitrito de sodio <td>tóxico y sensible a la luz</td></tr><tr><td>; Cloruro de 563218</td><td></td><td></td> > vanadio (III) NaNO2</<td>subSigma</td></tr><tr><td>; VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>sensible a la luz, tóxico</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; Ecofísica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el oxido nítrico, en materiales biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

El óxido nítrico (NO) es una de las principales moléculas de regulador en la homeostasis vascular y también un neurotransmisor. producido enzimáticamente NO se oxida en nitrito y nitrato por interacciones con diversas proteínas oxi-hemo y otras vías todavía no bien conocidas. El proceso inverso, la reducción de nitrito y nitrato en NO había sido descubierto en mamíferos en la última década y que se destaca por ser una de las posibles vías para prevenir o aliviar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares, metabólicas y trastornos musculares que se cree estar asociado con niveles disminuidos de NO. Por tanto, es importante para estimar la cantidad de NO y sus metabolitos en diferentes compartimentos del cuerpo - la sangre, fluidos corporales y los diversos tejidos. La sangre, debido a su fácil accesibilidad, es el compartimiento preferido utilizado para la estimación de metabolitos de NO. Debido a su corta vida (pocos milisegundos) y baja concentración sub-nanomolar, mediciones fiables directas de sangre NO &lt;em&gt; in vivo presentan grandes dificultades técnicas. Por lo tanto la disponibilidad de NO se estima por lo general basado en la cantidad de sus productos de oxidación, nitrito y nitrato. Estos dos metabolitos siempre se miden por separado. Hay varios métodos bien establecidos para determinar sus concentraciones en los fluidos y tejidos biológicos. Aquí se presenta un protocolo para el método de quimioluminiscencia (CL), basado en la detección espectrofotométrico de NO después de nitrito o nitrato de reducción por (III) soluciones de cloruro de tri-yoduro o vanadio, respectivamente. La sensibilidad para la detección de nitrito y nitrato está en la gama baja nanomolar, que establece CL como el método más sensible disponible actualmente para determinar los cambios en las rutas metabólicas NO. Explicamos en detalle cómo preparar muestras de fluidos y tejidos biológicos con el fin de preservar el valor de origen de nitritos y nitratos presentes en el momento de la recogida y la forma de determinar sus respectivas cantidades en las muestras. Las limitaciones de la técnica CL también son explained.

Figura 2 muestra resultados representativos obtenidos de normas y cinco muestras diferentes. Como se muestra en esta figura, los aumentos de tensión fotomultiplicador inmediatamente después de que se inyecta la solución (estándares o muestras) que contiene nitrito en la reducción de la solución (inyecciones veces se indican mediante flechas rojas debajo de la curva) y vuelve al valor de referencia una vez que todo el nitrito presente en el inyectado solución se redujo. T...

< clase p = 'jove_content'>El óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en la homeostasis vascular. La producción de NO in vivo es demasiado baja para la medición directa. La quimioluminiscencia proporciona información útil sobre el ciclo del NO a través de la medición de sus precursores y productos de oxidación, nitrito y nitrato. Se explica la determinación de nitrito/nitrato en tejidos y fluidos corporales.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

El objetivo de este protocolo es utilizar la quimioluminiscencia para cuantificar el óxido nítrico en muestras biológicas mediante la cuantificación de los niveles de nitrito y nitrato, utilizando soluciones reductoras de triyoduro y cloruro de vanadio. Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para rastrear el metabolismo y la señalización del óxido nítrico, tanto regional como longitudinalmente a partir de una variedad de muestras biológicas. La principal ventaja de esta técnica es su sencillez y alta sensibilidad.La comprobante de este procedimiento estará a cargo de Katelyn Cassel, nuestra becaria del IRTA. Ella nos mostrará cómo medir el nitrito por quimioluminiscencia acoplado a una solución de triyoduro. Para empezar, haz una solución que conserve los nitritos.Prepare una solución que contenga un NEM de 118 milimolares y un ferrocianuro de potasio de 890 milimolares en agua destilada. Disuelva los sólidos hasta que la solución sea de color amarillo claro sin cristales. A continuación, añada esta solución a NP 40 en una proporción de 9 a 1 volumen por volumen.Mezcle la solución suavemente para evitar la formación de espuma. Nunca hagas vórtices con esta mezcla. La solución conservante de nitrito se puede utilizar durante aproximadamente una semana si se almacena a 4 grados centígrados.El protocolo se puede utilizar en muchas muestras biológicas recién obtenidas. En este caso, se centrifugó sangre recién extraída para obtener una muestra de plasma para su análisis. Es muy importante procesar la sangre o cualquier muestra biológica que contenga una gran cantidad de proteínas hemo, como la hemoglobina o la mioglobina, lo más rápido posible, porque las proteínas hemo reaccionarán con el nitrito y destruirán el nitrito.Ahora, para preservar la mayor parte del nitrito endógeno en la sangre, mezcle inmediatamente el plasma con una solución que conserve el nitrito en una proporción de 1 a 4 volumen por volumen. Durante cualquier etapa de esta preparación, la muestra se puede congelar en hielo seco. Para desproteinar la muestra, mézclala con una parte igual de metanol frío.A continuación, centrifugar la muestra a 13000 G durante 15 minutos a 4 grados centígrados para precipitar las proteínas. Tome el sobrenadante y utilícelo para la medición de nitritos. Para una medida sensible de nitrito, se considera más eficaz una solución reductora de triyoduro.Al prepararlo, asegúrate de que todos los cristales se disuelvan. Mantenga la solución en un frasco oscuro y úsela dentro de una semana después de la preparación. Una solución reductora de cloruro de vanadio ofrece la mayor precisión para medir el nitrato.Se utiliza una solución de nitrito de 1 micromolar para determinar la curva estándar para el nitrito, así como para el nitrato. Configure el analizador de óxido nítrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Primero, abra el tanque de oxígeno, encienda el instrumento y conéctelo a una trampa de ácido, que contiene un molar de hidróxido de sodio.A continuación, abra el tanque de helio, luego conecte la cámara de reacción de vidrio al tanque de helio. Ahora, cargue la cámara de reacción con una solución de triyoduro para la medición de nitritos. Agregue agente antiespumante.Ajuste el caudal de gas para ralentizar el burbujeo. Y luego conecte la trampa de ácido a la cámara de reacción. Usando prueba y error, ajuste el flujo de helio correctamente, para que coincida con la succión del instrumento.Ahora, inicie el software líquido basado en programación visual. Primero, habilite la comunicación entre el instrumento y el software de adquisición desde el menú Datos, luego desde el menú principal en el panel frontal inicie el análisis. Espere a que el enfriador del fotomultiplicador se enfríe por debajo de menos 12 grados Celsius y a que el fotomultiplicador se estabilice.Después de unos 30 minutos, la línea de base se habrá estabilizado dentro de 1 o 2 milivoltios. La estabilidad del valor es fundamental, no el valor en sí. Una vez que el analizador se haya estabilizado, use una jeringa Hamilton bien lavada para inyectar las soluciones.En primer lugar, inyecte al menos tres volúmenes diferentes del patrón de nitrito de 1 micromolar. Inyecte las soluciones en la solución reductora a través del tabique. Inyecte cada patrón o muestra dos veces.Si se prevén altos niveles y muestras de nitrito, considere inyectar un cuarto volumen grande de solución de nitrito estándar para una mejor determinación de la pendiente de la curva estándar. Observe siempre la salida y espere a que el analizador se vuelva a estabilizar hasta la línea de base antes de inyectar la siguiente muestra. Esto tarda al menos un minuto.Utilice volúmenes de muestra que alcancen un máximo inferior a 700 milivoltios para obtener resultados precisos. Entre pasadas, lave bien la jeringa con agua desionizada. Es muy importante lavar bien la jeringa.Una vez realizadas todas las mediciones, pulse la opción de parada en el software. Los datos se guardarán automáticamente. Al presionar abortar, finalizará la medición sin guardar los datos.Cierre la llave de paso en la parte superior del recipiente de reacción y desconecte el tubo que conecta la trampa de ácido y el recipiente de reacción. Después del experimento, ponga el analizador en modo de espera. Presione análisis en el panel principal y confirme que ingresa al modo de espera.A continuación, apague el suministro de oxígeno. Desconecte la tubería del tanque de O2 a la trampa de ácido. A continuación, enjuague la solución de triyoduro con helio.A continuación, cierre y desconecte el tanque de helio del recipiente de reacción de vidrio. Finalmente, limpie el recipiente con etanol y agua según sea necesario. Los estándares de prueba junto con las muestras de plasma muestran que inmediatamente después de su inyección, el voltaje del fotomultiplicador aumenta y vuelve a la línea de base una vez que se ha reducido todo el nitrito, lo que puede demorar hasta un minuto.Para cuantificar la señal, se construyó una curva estándar a partir de los estándares, utilizando el área bajo el pico de salto de voltaje. Utilizando la curva estándar, la cuantificación de las muestras fue muy reproducible entre sus inyecciones duplicadas. La quimioluminiscencia se considera el estándar de oro para determinar las concentraciones de nitrito.Una vez dominado, el límite de sensibilidad para el nitrito es tan bajo como veinte milimolares. Lo más importante para trabajar con quimioluminiscencia es la precisión. Debido a la alta sensibilidad del método, cada error afectará el resultado final.Así que tómate tu tiempo y no te apresures. Después de que se desarrollara esta técnica a principios de la década de 2000, allanó el camino para que los investigadores exploraran las vías metabólicas del óxido nítrico y aprendieran que la deficiencia de óxido nítrico está causando muchas enfermedades, especialmente enfermedades cardiovasculares.

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Investigación

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Biology

Biología

La producción endógena de óxido nítrico (NO) regula una amplia variedad de funciones biológicas. Cada vez es más claro que la interrupción o la desregulación de la señalización de NO basado en está involucrado en muchas enfermedades humanas. Los métodos para cuantificar los metabolitos relevantes no pueden proporcionar nuevos biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la enfermedad humana.

Técnicas analíticas para el ensayo de bioactividad del óxido nítrico

Los niveles de óxido nítrico (NO), molécula de señalización celular inflamatoria, se analizan comúnmente utilizando el reactivo de Griess. En este protocolo, hemos creado un ensayo de Griess modificado que utiliza tejido cerebral vivo de Drosophila para detectar la secreción de NO en un método simple, cuantificable y altamente repetible.

Nuevo ensayo cuantitativo de tejido completo de los niveles de óxido nítrico en la respuesta neuroinflamatoria de Drosophila

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Trabajos previos sugieren que la composición isotópica de nitrógeno de los óxidos de nitrógeno atmosférico podría distinguir la influencia de diferentes fuentes en el medio ambiente. Informamos sobre un método automatizado, móvil y basado en el campo para la alta eficiencia de recolección de NOatmosférico x para el análisis isotópico de N con una resolución horaria.

Automatizado, de alta resolución Sistema de Recolección móvil para el análisis isotópico de nitrógeno NO<sub&gt; x</sub

Este papel describe el óxido nítrico (NO) protocolos de fumigación para el control de plagas de postcosecha. Cámaras de fumigación se vuelcan con el nitrógeno (N2) establecer condiciones de oxígeno ultralow antes NO se inyecta. Al final, cámaras se vuelcan con N2 para diluir NO antes de exponer los productos al aire ambiente para evitar la exposición a2.

Procedimientos de laboratorio fumigación Control de plagas con Gas de óxido nítrico

Α-hidroxilación de nitrosaminas carcinógenas por cytochrome P450s es la aceptada vía metabólica que produce intermediarios DNA-perjudiciales, causantes de mutaciones. Sin embargo, nuevos datos indican más a nitrosamidas puede oxidarse. Describimos un general método para la detección de nitrosamidas producido en vitro del citocromo P450-catalizada metabolismo de nitrosaminas.

Un método General para la detección de formación de Nitrosamide en el metabolismo In Vitro de nitrosaminas por Cytochrome P450s

Se proporciona en detalle una serie de métodos para determinar la tasa potencial de DNRA basada en 14análisis NH4+/15NH4+. NH4+ se convierte en N2O a través de varios pasos y se analiza utilizando cromatografía de gases cuadrúpedos-espectrometría de masas.

Medición de las tasas potenciales de reducción de nitrato disimilado a amonio basada en 14NH4+/15NH4+ Análisis a través de la conversión secuencial a N2O

Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.

Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Este protocolo describe un método para cuantificar la producción de óxido nítrico (NO) en cultivos epiteliales de las vías respiratorias diferenciados en la interfaz aire-líquido (ALI) midiendo nitrito en secreciones apicales mediante un ensayo de quimioluminiscencia basado en triioduros.

Medición de la producción de óxido nítrico en cultivos celulares epiteliales traqueales de ratón diferenciados en la interfaz aire-líquido

Aprende a cuantificar óxido nítrico en muestras biológicas mediante quimioluminiscencia, midiendo nitritos y nitratos con soluciones reductoras de triyoduro y cloruro de vanadio. Esta técnica sencilla y sensible permite rastrear el metabolismo del NO.

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia (Video) | JoVE Journal

La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

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