La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia

El objetivo de este protocolo es utilizar la quimioluminiscencia para cuantificar el óxido nítrico en muestras biológicas mediante la cuantificación de los niveles de nitrito y nitrato, utilizando soluciones reductoras de triyoduro y cloruro de vanadio. Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para rastrear el metabolismo y la señalización del óxido nítrico, tanto regional como longitudinalmente a partir de una variedad de muestras biológicas. La principal ventaja de esta técnica es su sencillez y alta sensibilidad.

La comprobante de este procedimiento estará a cargo de Katelyn Cassel, nuestra becaria del IRTA. Ella nos mostrará cómo medir el nitrito por quimioluminiscencia acoplado a una solución de triyoduro. Para empezar, haz una solución que conserve los nitritos.

Prepare una solución que contenga un NEM de 118 milimolares y un ferrocianuro de potasio de 890 milimolares en agua destilada. Disuelva los sólidos hasta que la solución sea de color amarillo claro sin cristales. A continuación, añada esta solución a NP 40 en una proporción de 9 a 1 volumen por volumen.

Mezcle la solución suavemente para evitar la formación de espuma. Nunca hagas vórtices con esta mezcla. La solución conservante de nitrito se puede utilizar durante aproximadamente una semana si se almacena a 4 grados centígrados.

El protocolo se puede utilizar en muchas muestras biológicas recién obtenidas. En este caso, se centrifugó sangre recién extraída para obtener una muestra de plasma para su análisis. Es muy importante procesar la sangre o cualquier muestra biológica que contenga una gran cantidad de proteínas hemo, como la hemoglobina o la mioglobina, lo más rápido posible, porque las proteínas hemo reaccionarán con el nitrito y destruirán el nitrito.

Ahora, para preservar la mayor parte del nitrito endógeno en la sangre, mezcle inmediatamente el plasma con una solución que conserve el nitrito en una proporción de 1 a 4 volumen por volumen. Durante cualquier etapa de esta preparación, la muestra se puede congelar en hielo seco. Para desproteinar la muestra, mézclala con una parte igual de metanol frío.

A continuación, centrifugar la muestra a 13000 G durante 15 minutos a 4 grados centígrados para precipitar las proteínas. Tome el sobrenadante y utilícelo para la medición de nitritos. Para una medida sensible de nitrito, se considera más eficaz una solución reductora de triyoduro.

Al prepararlo, asegúrate de que todos los cristales se disuelvan. Mantenga la solución en un frasco oscuro y úsela dentro de una semana después de la preparación. Una solución reductora de cloruro de vanadio ofrece la mayor precisión para medir el nitrato.

Se utiliza una solución de nitrito de 1 micromolar para determinar la curva estándar para el nitrito, así como para el nitrato. Configure el analizador de óxido nítrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Primero, abra el tanque de oxígeno, encienda el instrumento y conéctelo a una trampa de ácido, que contiene un molar de hidróxido de sodio.

A continuación, abra el tanque de helio, luego conecte la cámara de reacción de vidrio al tanque de helio. Ahora, cargue la cámara de reacción con una solución de triyoduro para la medición de nitritos. Agregue agente antiespumante.

Ajuste el caudal de gas para ralentizar el burbujeo. Y luego conecte la trampa de ácido a la cámara de reacción. Usando prueba y error, ajuste el flujo de helio correctamente, para que coincida con la succión del instrumento.

Ahora, inicie el software líquido basado en programación visual. Primero, habilite la comunicación entre el instrumento y el software de adquisición desde el menú Datos, luego desde el menú principal en el panel frontal inicie el análisis. Espere a que el enfriador del fotomultiplicador se enfríe por debajo de menos 12 grados Celsius y a que el fotomultiplicador se estabilice.

Después de unos 30 minutos, la línea de base se habrá estabilizado dentro de 1 o 2 milivoltios. La estabilidad del valor es fundamental, no el valor en sí. Una vez que el analizador se haya estabilizado, use una jeringa Hamilton bien lavada para inyectar las soluciones.

En primer lugar, inyecte al menos tres volúmenes diferentes del patrón de nitrito de 1 micromolar. Inyecte las soluciones en la solución reductora a través del tabique. Inyecte cada patrón o muestra dos veces.

Si se prevén altos niveles y muestras de nitrito, considere inyectar un cuarto volumen grande de solución de nitrito estándar para una mejor determinación de la pendiente de la curva estándar. Observe siempre la salida y espere a que el analizador se vuelva a estabilizar hasta la línea de base antes de inyectar la siguiente muestra. Esto tarda al menos un minuto.

Utilice volúmenes de muestra que alcancen un máximo inferior a 700 milivoltios para obtener resultados precisos. Entre pasadas, lave bien la jeringa con agua desionizada. Es muy importante lavar bien la jeringa.

Una vez realizadas todas las mediciones, pulse la opción de parada en el software. Los datos se guardarán automáticamente. Al presionar abortar, finalizará la medición sin guardar los datos.

Cierre la llave de paso en la parte superior del recipiente de reacción y desconecte el tubo que conecta la trampa de ácido y el recipiente de reacción. Después del experimento, ponga el analizador en modo de espera. Presione análisis en el panel principal y confirme que ingresa al modo de espera.

A continuación, apague el suministro de oxígeno. Desconecte la tubería del tanque de O2 a la trampa de ácido. A continuación, enjuague la solución de triyoduro con helio.

A continuación, cierre y desconecte el tanque de helio del recipiente de reacción de vidrio. Finalmente, limpie el recipiente con etanol y agua según sea necesario. Los estándares de prueba junto con las muestras de plasma muestran que inmediatamente después de su inyección, el voltaje del fotomultiplicador aumenta y vuelve a la línea de base una vez que se ha reducido todo el nitrito, lo que puede demorar hasta un minuto.

Para cuantificar la señal, se construyó una curva estándar a partir de los estándares, utilizando el área bajo el pico de salto de voltaje. Utilizando la curva estándar, la cuantificación de las muestras fue muy reproducible entre sus inyecciones duplicadas. La quimioluminiscencia se considera el estándar de oro para determinar las concentraciones de nitrito.

Una vez dominado, el límite de sensibilidad para el nitrito es tan bajo como veinte milimolares. Lo más importante para trabajar con quimioluminiscencia es la precisión. Debido a la alta sensibilidad del método, cada error afectará el resultado final.

Así que tómate tu tiempo y no te apresures. Después de que se desarrollara esta técnica a principios de la década de 2000, allanó el camino para que los investigadores exploraran las vías metabólicas del óxido nítrico y aprendieran que la deficiencia de óxido nítrico está causando muchas enfermedades, especialmente enfermedades cardiovasculares.