La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores

El objetivo de este protocolo es presentar un método eficiente para la identificación de neuronas parcheadas durante los registros electrofisiológicos utilizando biocitina e inmunotinción para la recuperación de la morfología antes de volver a teñir con anticuerpos específicos para determinar la identidad neuroquímica. Por lo tanto, este método describe un paso importante necesario para estudiar la diversidad en la estructura y función neuronal. Esto es esencial para entender su papel en las redes cerebrales.

La principal ventaja de utilizar técnicas de procesamiento secuencial, es que elimina la pérdida de datos debido a la imposibilidad de recuperar la morfología. Por lo tanto, esto también ayuda a guiar los marcadores neuroquímicos que se analizarán en estas células. Aunque este método está descrito para la recuperación morfológica de células en secciones gruesas, también se puede aplicar en secciones delgadas y en muestras previamente teñidas y montadas.

Por lo general, los neutros nuevos en este método pueden tener dificultades para volver a sellar el soma mientras se separan de la celda, y pueden no permitir el tiempo adecuado para los rellenos exitosos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que se requieren técnicas específicas para el llenado efectivo de biocitona de las células con el fin de recuperar la morfología completa. Para comenzar este procedimiento, en la configuración de pinza de voltaje, aplique pequeños pasos breves de voltaje utilizando la función de prueba de membrana en modo de baño mientras se acerca a la celda.

Coloque el parche en la célula aplicando succión. Luego, sostenga la celda a menos 70 milivoltios. Obsérvese el desarrollo de un sello de gigaohmios.

Compense los transitorios capacitivos y luego aplique la succión controlada con una jeringa o por vía oral para lograr la configuración de toda la celda. Estime la capacitancia de toda la celda y la resistencia en serie, y detenga los pulsos de prueba de membrana. La resistencia en serie de menos de 10 megaohmios es óptima.

Esto asegurará el establecimiento de condiciones de registro de células enteras para permitir el llenado de biocitina. Una vez finalizados los registros fisiológicos, restablezca la configuración de la pinza de parche moviendo lentamente la pipeta de registro en pequeños pasos, alternando hacia arriba y hacia afuera en el modo de pinza de voltaje. El paso más crítico para lograr la recuperación morfológica de las células es asegurar el resellado del soma neuronal mientras se separa la pipeta de registro de la célula.

Usando la función de prueba de membrana, visualice la pérdida de transitorios capacitivos y el colapso de las respuestas de corriente a una línea recta, lo que indica el nuevo sellado de la celda y el establecimiento de un parche de afuera hacia afuera en la punta de la pipeta. Mientras tanto, mantener la celda a un potencial despolarizado facilitará el proceso de resellado. Después de separar la pipeta de la célula, mantenga el corte en la cámara de registro durante tres a cinco minutos para asegurar el transporte del colorante a los procesos dendríticos y axonales distales.

A continuación, transfiera el corte a una placa de 24 pocillos que contenga 4% de PFA para su fijación. De 24 a 48 horas después de la fijación de PFA, transfiera todos los cortes fijados a PBS molar punto cero para su almacenamiento antes de la inmunotinción. En este procedimiento, lave los tejidos tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS de punto cero y un molar.

A continuación, bloquee los tejidos con suero bloqueante al 10 por ciento durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, incuba las secciones de los anticuerpos primarios CB1R a temperatura ambiente durante la noche para identificar la expresión del receptor cannabinoide tipo 1. A continuación, lave las secciones del cerebro tres veces durante 10 minutos cada una con un PBS de 0,1 molares.

La estreptavidina y el anticuerpo secundario contra el primer anticuerpo primario se añaden a la placa del pocillo y se mantienen durante la noche a cuatro grados centígrados. Posteriormente, incubar las secciones en colorante rojo de estreptavidina conjugado a cuatro grados centígrados durante la noche en la oscuridad para revelar la biocitina. Después de eso, lave las secciones del cerebro tres veces durante 10 minutos cada una en PBS de 0,1 molares.

Para proteger la florescencia y facilitar el retinado en el futuro, monte las secciones en un medio de montaje igualmente espaciado. Enmarca los bordes de los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. En este paso, retira el esmalte de uñas del portaobjetos de vidrio con un hisopo de algodón de acetona.

Retire el cubreobjetos con cuidado con unas pinzas de punta fina y ponga unas gotas de PBS 0,1 molar en las secciones. Es fundamental no dañar el tejido del proceso mientras se desmonta el tejido del medio de montaje acuoso. Retire con cuidado las secciones del portaobjetos con un pincel fino y lávelas con PBS de 0,1 molares durante 24 a 48 horas en una coctelera, y manténgalas alejadas de la luz a cuatro grados centígrados.

Para asegurar la extracción completa del medio de montaje, lave las secciones una o dos veces al día siguiente en PBS de 0,1 molares durante 10 minutos cada vez. A continuación, incubar las secciones con un segundo anticuerpo primario, colecistoquinina, durante un día. Lave las secciones del cerebro tres veces durante 10 minutos cada una en PBS de 0.1 molares.

Posteriormente, teñir las secciones con un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo goat anti-mouse. Asegurarse de que los espectros de emisión de excitación del anticuerpo secundario no se superpongan con la estreptavidina y las tinciones inmunofluorescentes previas. Después, monte las secciones en un medio de montaje acuoso.

Enmarca los bordes de la cubierta con esmalte de uñas transparente. Tras el éxito del llenado de biocitina y el primer proceso de inmunotinción, la estructura neuronal puede visualizarse e imagenizarse como se muestra en la imagen confocal obtenida con un aumento de 60x. La sección también se inmunotiñó para CB1R junto con biocitina, y la inmunotinción de CB1R en el soma neuronal que expresa biocitotina está indicada por la punta de flecha.

La misma sección se procesó para la inmunorreactividad de CCK después de una semana, y la imagen muestra la recuperación exitosa del etiquetado inmunológico de CCK en varias neuronas indicado por el asterisco. Obsérvese que la célula marcada con biocitina indicada por la punta de flecha no expresaba CCK. Una imagen combinada de los paneles A, B y C muestra que las tres etiquetas se visualizan de forma robusta, y la superposición entre biocitina y CB1R es evidente.

La imagen muestra que el segundo proceso de inmunotinción no compromete la señal del proceso de tinción anterior. La morfología de la célula llena de biocitina se obtuvo a partir de las imágenes confocales previas a esta inmunotinción con CCK. De manera crucial, además del soma y la dendrita, se pueden visualizar los axones y se observa el co-marcaje de los procesos axonales marcados con CB1R y biocitina.

Al intentar este procedimiento, es importante dirigirse a las células sanas ubicadas debajo de la superficie del corte para evitar las neuronas con procesos cortados. Y eso podría comprometer la recuperación de la morfología. Una vez dominadas, la recuperación morfológica de las células llenas de biocitina puede obtenerse de forma fiable durante el registro de la pinza del parche.

La implementación exitosa de la técnica de inmunotinción en serie mejorará la eficiencia de la recuperación de datos y facilitará la caracterización neuronal durante los registros estándar de patch clamp. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar de manera efectiva las células llenas de biocitina para recuperar la morfología neuronal y determinar marcadores neuroquímicos.