Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica ⁺ Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

El objetivo general de este ensayo es enumerar y caracterizar las poblaciones de células T CD8 positivas específicas del virus de la inmunodeficiencia de simios generadas por vacunación o infección primaria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología de células T, como cuál es la frecuencia de células T CD8 específicas de antígeno inducidas por vacunación o infección. La principal ventaja de esta técnica es que puede cuantificar linfocitos T CD8 específicos de antígeno en muestras biológicas obtenidas directamente ex vivo sin necesidad de reestimulación in vitro.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la evaluación de las células T CD8 específicas de la incisión en el macaco rhesus, y para el estudio de las respuestas de las células T CDB en múltiples entornos de enfermedades. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al conocimiento incompleto disponible para la genética MHC del macaco rhesus, y porque la tinción por citometría de flujo requiere una aplicación precisa de anticuerpos. Comience volviendo a suspender el rhesus PBMC en el medio R10.

Añade una concentración de 1,6 por 10 a la séptima celda por mililitro. Alícuota 50 microlitros de células al número apropiado de tubos de citometría de flujo, y agregue 50 microlitros de inhibidor de proteína quinasa a cada tubo. Agite cada tubo e incube las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

La cantidad correcta de tetrámero MHC peptídico titulado debe diluirse en una mezcla maestra suficiente para teñir todos los tubos experimentales. Por lo tanto, es importante preparar un 15% de exceso de la mezcla maestra, para tener en cuenta los errores de pipeteo. Mientras las células se incuban, granule los agregados de proteínas en la solución de tetrámero por centrifugación, para minimizar la tinción de fondo.

A continuación, diluya los tetrámeros en suficiente tampón de tinción, de modo que se puedan añadir 25 microlitros de la mezcla maestra de tetrámeros a cada tubo de citometría de flujo. A continuación, agite los tubos de muestra e incube las soluciones de tetrámero de PBMC en la oscuridad, a temperatura ambiente durante 45 minutos. Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de mezcla maestra de tinción a los tubos de muestra apropiados.

Y mezcle los tubos para el vórtice. Después de 25 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, lave las celdas con tampón de lavado, granule las celdas por centrifugación y decante cuidadosamente los sobrenadantes sin alterar los gránulos. Agite las células en el tampón sobrante en cada tubo y fije las muestras con 250 microlitros de paraformaldehído al 2% por tubo.

Inmediatamente vórtice e incube los tubos en la oscuridad, a 4 grados centígrados. Después de 20 minutos, lave las celdas con un tampón de lavado nuevo. Granular las células por centrifugación y decantar el sobrenadante sin alterar la pellet.

Vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de permeabilización, vórtice e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, lave y granule las células. A continuación, decanta los sobrenadantes como se ha descrito anteriormente.

Proceda a añadir 50 microlitros de mezcla maestra de tinción intracelular a los tubos adecuados. Agite cada muestra e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Una vez finalizada la incubación, lave y granule las células.

Las muestras ya están listas para ser adquiridas en un citómetro de flujo. Los tetrámeros Mamu-B017.01 suelen producir una tinción tenue, que puede mejorarse sustancialmente mediante el tratamiento previo de las células, con un inhibidor de la proteína quinasa. Para evitar la tinción de fondo, las células MHC de clase uno emparejadas que contienen o no la población de células T CD8 positivas para antígeno específico de interés, deben marcarse con el tetrámero correspondiente y múltiples diluciones, para determinar la cantidad óptima que da como resultado la mejor separación entre las células T CD8 positivas y negativas para tetrámeros.

En estos gráficos, se muestra la estrategia de activación utilizada para analizar la magnitud y el fenotipo de memoria de las respuestas de las células T CD8 positivas específicas para Gag CM9 inducidas por la vacuna en un macaco rhesus Mamu-A 01 positivo. Tenga en cuenta que la población de células T CD8 positivas para tetrámeros está bien separada con una tinción de fondo mínima. Y con los subconjuntos de memoria claramente delineados por su expresión de CD28, CCR7 y Granzyme B dentro de la puerta del tetrámero.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar los reactivos correctos a cada mezcla maestra de anticuerpos o tetrámeros, y trabajar con los tubos experimentales cada vez como se demuestra. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la especificidad y el fenotipo de las células T CD8 específicas de antígeno.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar una tinción de tetrámero de clase uno del MHC en el ensayo del modelo de macaco rhesus de la investigación del SIDA VIH-1 humano. No olvide que trabajar con especímenes biológicos de macacos rhesus requiere precauciones especiales, como el uso del equipo de protección personal adecuado durante el procesamiento de las muestras.