Name: Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar células T CD8 específicas contra el virus de la inmunodeficiencia simiana en macacos rhesus mediante tetrámeros de péptido-MHC-I y citometría de flujo. Este método permite evaluar respuestas inmunitarias ex vivo sin reestimulación in vitro.

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Nos gustaría dar las gracias a David Watkins para apoyar los experimentos que permitieron a la optimización de la metodología actual. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyado en parte por una subvención piloto proporcionada por el Centro de Miami para la Investigación del SIDA de los Institutos Nacionales de la Salud con el número P30AI073961 premio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

Las muestras de sangre periférica de células mononucleares (PBMC) utilizados en este manuscrito se obtuvieron de los macacos rhesus de la India con sede en el Centro de Investigación Nacional de Primates de Wisconsin. Estos animales se cuidaron de acuerdo con el Informe Weatherall bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Wisconsin Escuela de Cuidado de Animales y el empleo Comisión 33. Todos los animales procedimientos se realizaron bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento potencial. 1. Tratamiento PKI NOTA: Esto es opcional, pero se recomienda para Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. Ver Resultados y Discusión. <ol><li> Resuspender PBMC en medio R10 a una concentración de 1,6 x 10 7 células / ml. </li><li> Añadir 50 l de esta suspensión de células al flujo correspondiente citometría de tubos. Añadir 50 l de una solución 100 nM de PKI a cada tubo. </li><li> Vórtice cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 30 min. Al final de estepaso, cada tubo debe tener 100 l de una suspensión de células que contiene 8,0 x 10 5 PBMC y 50 nM de PKI. </li><li> Proceder a la etapa de tinción tetrámero pMHC-I. </li></ol> 2. Tinción con marcadas con fluorocromo tetrámeros pMHC-I <ol><li> Antes de preparar el pMHC-I tetrámero mezcla maestra, centrifugar los tubos tetrámero pMHC-I a 20.000 xg durante al menos 15 min a 4 ° C. El objetivo de este paso es para sedimentar los agregados de proteína en la solución de tetrámero pMHC-I que puede aumentar la tinción de fondo. Una vez que la etapa de centrifugación se realiza, evitar de pipeteado de la parte inferior del tubo donde se han acumulado los agregados de proteína. </li><li> Preparar suficiente mezcla maestra tetrámero pMHC-I para teñir todos los tubos experimentales. Preparar un exceso de 15% del volumen total de esta mezcla maestra a la cuenta de error de pipeteo. </li><li> Diluir tetrámeros pMHC-I en tampón de tinción (por ejemplo, la mancha brillante Buffer), de modo que 25 l de la I-pMHC tetrámero mezcla maestra son Added para cada prueba. <ol><li> Etiqueta de PBMC con dos tetrámeros pMHC-I por prueba; uno conjugado con aloficocianina (APC) y la otra a violeta brillante (BV) 421. </li></ol></li><li> Añadir 8,0 x 10 5 PBMC al flujo correspondiente citometría de tubos en un volumen final de 100 l. Si las células se sometieron al tratamiento PKI descrito anteriormente, que ya deben ser resuspendieron en 100 l en este paso. </li><li> Añadir 25 l de pMHC-I tetrámero maestro de la mezcla con el flujo correspondiente citometría de tubos. Al final de este paso, el volumen final en cada tubo debe ser de 125 l. </li><li> Vortex cada tubo con el fin de homogeneizar la suspensión celular. </li><li> Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 min. Preparar el cóctel de mAb tinción de la superficie durante este 45 min de incubación. </li></ol> La tinción 3. Superficie <ol><li> Preparar suficiente mezcla maestra mAb para teñir todos los tubos experimentales. Preparar un exceso de 15% del volumen total de esta mezcla maestra para tener en cuentapara el error de pipeteo. </li><li> Ajustar el volumen de la mezcla maestra con tampón de tinción para que 50 l se añaden por prueba. </li><li> Para la exclusión adecuada de las células T no CD8 + y delineación de subconjuntos de memoria, el uso de cantidades de mAbs dirigidos contra los siguientes moléculas en la mezcla maestra tinción de la superficie valora. NOTA: Los fluorocromos conjugados con cada mAb se proporcionan como referencia: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7, y CCR7 FITC. Tenga en cuenta que los mAb contra CD14, CD16, y CD20 se conjugan con el mismo fluorocromo (es decir, BV 510), ya que se incluirán en la puerta &quot;descarga&quot;. </li><li> Incluir un colorante puede arreglar para discriminar las células muertas de la mezcla maestra tinción de la superficie [es decir, colorante reactivo amina (ARD)]. Asegúrese de que el reactivo de ARD está conjugado a un fluorocromo con un espectro de emisión similar a los utilizados en la puerta &quot;descarga&quot;. En este caso, utilizar ARD Aqua. </li><li> Añadir 50 l dela mezcla maestra de tinción se describe en 3.1 a 3.4 para el flujo correspondiente citometría de tubos. Al final de este paso, el volumen final en cada tubo debe ser de 175 l. </li><li> Vórtice cada tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 25 min. </li><li> Lavar las células con tampón de lavado (solución de PBS que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino y 0,45 g / L NaN 3). PRECAUCIÓN: La azida de sodio es una sustancia tóxica. La exposición a incluso pequeñas cantidades puede causar síntomas. Manejar esta sustancia de acuerdo con las directrices especificadas por la Oficina de Salud Ambiental y Seguridad (EHS) en la institución donde se llevan a cabo estos experimentos. </li><li> tubos de centrifugación a 510 xg durante 5 min. decantar cuidadosamente el sobrenadante en un contenedor de residuos por separado. Asegúrese de no perturbar el sedimento. PRECAUCIÓN: No se decanta el tampón de lavado sobrenadante en depósitos que contienen lejía, ya que puede reaccionar con la azida de sodio presente en el tampón de lavado y dar lugar a la formación de un gas tóxico 34. doONTACTO la Oficina de EHS en la institución donde se llevan a cabo estos experimentos para las instrucciones sobre cómo deshacerse de azida de sodio. </li><li> Después de decantar, vórtice las células en el líquido sobrante retenida en cada tubo. </li></ol> 4. Fijación de la célula <ol><li> Añadir 250 l de una solución de 2% de paraformaldehído (PFA) a todos los tubos para fijar las células. PRECAUCIÓN: PFA es una sustancia tóxica. La exposición a incluso pequeñas cantidades puede causar síntomas. Manejar esta sustancia de acuerdo con las directrices especificadas por la Oficina de EHS en la institución donde se llevan a cabo estos experimentos. <ol><li> Dado que la solución PFA 2% debe ser isotónica a las células, usar PBS para preparar esta solución. Cien mililitros de una solución PFA 2% es suficiente para múltiples experimentos. A fondo el vórtex todos los tubos inmediatamente después de la adición de 2% PFA con el fin de evitar la formación de agregados de células. </li></ol></li><li> Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 20 minutos. </li><li> Wcélulas de ceniza repitiendo los pasos 3.7-3.9. Una vez completado este paso, las células se pueden almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante 24 a 48 hr. Antes de pasar a la fase de permeabilización, vórtice bien los tubos. </li></ol> 5. permeabilización de células <ol><li> Añadir 500 l de tampón de permeabilización. Vortex todos los tubos. </li><li> Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Lavar las células repitiendo los pasos 3.7-3.9. </li></ol> 6. La tinción intracelular <ol><li> Preparar suficiente mezcla maestra mAb para teñir todos los tubos experimentales. </li><li> Ajuste el volumen con PBS o tampón de tinción de modo que se añaden 50 l de la mezcla maestra intracelular mAb por prueba. </li><li> Preparar la mezcla maestra mAb se describe en 6.1 y 6.2 utilizando cantidades de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD3 y Gzm B. titularse NOTA: TCR compromiso por tetrámeros pMHC-I puede dar lugar a la internalización de CD3, lo cual puede interferir con la detección de tetrámero + CD3 + CD8 +Las células T si se añade el anticuerpo anti-CD3 de la mezcla maestra tinción de la superficie. Para evitar esto, añadir el mAb anti-CD3 en esta etapa, que es, después se permeabilizan las células. Los fluorocromos conjugado a cada mAb se enumeran como referencia: CD3 PerCP Cy5.5 y Gzm B PE. </li><li> Añadir 50 l de mAb cóctel para los tubos correspondientes. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar las células repitiendo los pasos 3.7-3.9. Los tubos están listas para ser adquirida en un citómetro de flujo. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

A pocos pasos de este procedimiento de discusión mérito ya que son cruciales para la obtención de resultados óptimos. En primer lugar, ya que la calidad de las muestras biológicas es un fuerte predictor del éxito de cualquier ensayo de citometría de flujo 38, todo se debe tener cuidado para asegurar que las células son viables y en suspensión durante el procedimiento de tinción. Esto es particularmente relevante cuando se trabaja con muestras crioconservadas ya que son más propensos a la formación de grumos y...

Las células T CD8 + comprenden un componente crucial del sistema inmune adaptativo ya que participan en la vigilancia inmune del tumor y contribuyen a la erradicación de patógenos intracelulares 1. En términos simples, las células T CD8 + expresan receptores de células T (TCR) que reconocen específicamente de histocompatibilidad de clase complejo de péptido-major I (pMHC-I) moléculas presentes en la membrana plasmática de las células huésped. Dado que estos péptidos se derivan de la proteólisis de las proteínas sintetizadas endógenamente, pMHC-I de la superficie celular complejos proporcionan una ventana en el medio ambiente intracelular. Tras la infección por el virus, por ejemplo, las células infectadas se mostrarán moléculas MHC-I que contienen péptidos derivados de virus que pueden servir como ligandos para los TCR expresadas por patrullando las células T CD8 +. En el caso de un CD8 + de células T específica del virus se encuentra con una célula infectada presentar su ligando pMHC-I, compromiso TCR resultará en la activación de células T CD8 + y ultiinstancia conducir a la lisis de las células diana. Dada la naturaleza crítica de estas interacciones TCR / pMHC-I, la determinación de la magnitud, la especificidad y el fenotipo de la respuesta de células T CD8 + a menudo puede revelar pistas importantes sobre las enfermedades humanas. Hasta principios de 1990, la cuantificación de las células T CD8 + específicas de Ag-basó en el ensayo técnicamente exigentes dilución limitante (LDA) 2,3. No sólo se le requiere la LDA varios días para completarse, también se pudo detectar células que carecían de potencial proliferativo. Como resultado, la LDA enormemente subestimó la frecuencia real de las células T antígeno (Ag) específicos de CD8 + que participan en una respuesta inmune. Aunque el desarrollo de ELISPOT y ensayos de tinción intracelular de citoquinas mejora en gran medida la capacidad de medir la inmunidad celular, estos métodos aún requieren la estimulación in vitro para la cuantificación de células T específicas de Ag-4. No fue hasta 1996 que Altman, Davis, y coleagues publicaron su artículo de referencia informar el desarrollo de la tecnología de tetrámeros pMHC-I 5. Crítica para el éxito de esta técnica fue la multimerización de las moléculas pMHC-I, que se extendían la vida media de las interacciones TCR / pMHC-I, lo que reduce la probabilidad de tetrámeros pMHC-I que caen fuera durante las etapas de lavado de ensayos de citometría de flujo. La principal ventaja de tetrámeros pMHC-I en los ensayos mencionados anteriormente es la capacidad para detectar con precisión las células T Ag-CD8 + específicas directamente ex vivo sin la necesidad de re-estimulación in vitro en. Por otra parte, la combinación de pMHC-I tinción tetrámero con multi-color de citometría de flujo ha permitido un análisis detallado de la etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación de + células T CD8 específicas de Ag-2-4. A la luz de los recientes avances técnicos para la caracterización de los repertorios de células T CD8 + por pMHC-I tinción multímero 6, la amplitud de las aplicaciones for esta metodología es probable que continúe en expansión. Pocas áreas de la investigación biomédica han beneficiado más de pMHC-I tinción tetrámero que el campo de la inmunología del VIH 7. A pesar de que las células T CD8 + se habían asociado temporalmente con el control inicial de la viremia del VIH en el momento de la publicación por Altman, Davis y sus colegas 8,9, el uso de tetrámeros pMHC-I en los años siguientes se expandió significativamente nuestra comprensión de el VIH-específica respuesta de células T CD8 +. Por ejemplo, pMHC-I tinción tetrámero ayudó a confirmar el tamaño robusta de las respuestas de células T específicas del virus CD8 + en la mayoría de las personas infectadas por el VIH 10-12. Esta metodología también facilitó la caracterización del VIH y las respuestas de células T CD8 + específicas SIV-restringidos por moléculas MHC-I asociados con el control de la replicación viral espontánea en ausencia de terapia antirretroviral, un fenómeno conocido como &quot;control de la élite&quot; <sup&gt; 13-15. Además, tetrámeros pMHC-I fueron instrumental en el establecimiento del eje muerte programada de 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como vía reversible para el fenotipo disfuncional de + específicas del VIH CD8 células T en la infección crónica no controlada 16,17. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la utilidad de tetrámeros pMHC-I para el seguimiento de las respuestas de células T CD8 + contra el virus del SIDA. La infección experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) sigue siendo el mejor modelo animal para la evaluación de las intervenciones inmunológicas contra el VIH / SIDA 18,19. En los últimos 25 años, se ha hecho un progreso sustancial en la identificación y caracterización de las células T SIV-CD8 + específicas en esta especie de monos, incluyendo el descubrimiento de alelos MHC-I y la definición de la unión de péptidos motivos 13,20-27 . Como resultado, tetrámeros pMHC-I se han desarrollado para el análisis de específica SIV + de células T CD8respuestas en este modelo animal 28. La mayoría de estos reactivos se hacen de los productos génicos de cuatro macacos rhesus alelos MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, y Mamu-B * 017: 01. Es de destacar que los macacos rhesus no expresan un locus MHC-C 29. La gran mayoría de los tetrámeros pMHC-I utilizados en los presentes experimentos se produjeron en el Centro de NIH tetrámero Núcleo de la Universidad Emory. Sin embargo, algunos de estos reactivos, incluyendo Mamu-A1 * 001 tetrámeros con destino a la inmuno epítopo Gag CM9, sólo puede obtenerse de fuentes comerciales, debido a los acuerdos de licencia. Utilizando tetrámeros pMHC-I de los cuatro alelos macacos rhesus enumerados anteriormente, hemos registrado con éxito las células T CD8 + contra un total de 21 epítopos SIV (Tabla 1), que fueron inducidos por la vacunación o infección primaria SIV 30,31 (Martins et al., observaciones no publicadas). El presente manuscrito proporciona unaprotocolo de tinción de tetrámero optimizado pMHC-I para la determinación del fenotipo de frecuencia y la memoria de las células T CD8 + específicas de SIV en macacos rhesus. El ensayo comienza con una electiva 30 min de incubación con un inhibidor de la proteína quinasa (PKI; aquí, se utiliza dasatinib) con el fin de disminuir TCR internalización y con ello mejorar pMHC-I tetrámero tinción 32. Como se describe a continuación, este tratamiento es especialmente útil cuando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrámeros. También se proporcionan instrucciones sobre cómo marcar las células con tetrámeros pMHC-I conjugados con fluorocromo y anticuerpos monoclonales (MAB). Este protocolo también incluye una etapa de permeabilización celular para la detección intracelular de la citolisis asociada molécula de granzima B (Gzm B). El mAb contra CD3 se añade en este paso también para mejorar la detección de esta molécula de señalización del TCR. Como referencia, se enumeran todos los fluorocromos utilizados en este panel de tinción.

<table><tbody><tr><td>Dasatinib</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&nbsp; 1392</td><td>Debe resuspenderse en DMSO y almacenarse inmediatamente a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>RPMI con Glutamax</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Debe almacenarse a 4 & ° C&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS inactivado por calor</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Debe almacenarse a 4 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Debe almacenarse a 4 & grados; C&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>5 ml Tubos de polipropileno de fondo redondo</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Tetrámeros de pMHC-I conjugados con fluorocromo</td><td>NIH Tetramer Core o MBL, Inc.</td><td></td><td>Debe almacenarse y mantenerse a 4 &nbsp; 4 &d. C. Centrífuga a 20,000 x g durante 15 min antes de usar. No congelar.</td></tr><tr><td>AcM conjugados con fluorocromo</td><td>Varias empresas</td><td></td><td>Deben almacenarse y mantenerse a 4 &nb;C. No congelar.</td></tr><tr><td>VIVOS/MUERTOS&nbsp; Aqua reparable&nbsp; Muerto&nbsp; Kit de tinción de celda</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>Debe almacenarse a -20 &deg;C. Vuelva a suspender cada alícuota en 50 &mu; l de DMSO antes de su uso.</td></tr><tr><td>Tampón de manchas brillante</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>Debe almacenarse en&nbsp; 4 &nb; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Albúmina Bovina</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>Debe almacenarse a 4 °C. C&nbsp;</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>Conservar a temperatura ambiente. Sustancia tóxica. No mezclar con lejía.</td></tr><tr><td>Lejía</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Químico corrosivo, no se puede mezclar con azida sódica. Maneje con cuidado</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>15714-S</td><td>Reactivo inflamable, corrosivo y tóxico. Manéjelo con cuidado</td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Solución de permeabilización 2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>Reactivo tóxico y corrosivo. Maneje con cuidado</td></tr><tr><td>Sarsdet Tubos 1,5 ml con tapa de rosca</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Tubos de ADN/ARN de baja unión</td><td>Eppendorf 22431048</td><td></td><td>Se prefiere el uso de microtubos estériles&nbsp;</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>A discreción del científico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad &nbsp;</td><td>A discreción del científico</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>el sistema de purificación de agua Milli Q Intergral</td><td>EMD, Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td><td>el agua de grado de biología molecular de cualquier proveedor se puede utilizar</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>A discreción del científico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>A discreción del científico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & deg; C&nbsp; Refrigerador</td><td>A criterio del científico</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td>El citómetro de flujo debe contener láseres y filtros que sean compatibles con el panel de tinción utilizado.</td><td></td></tr>Papel de aluminio para <tr><td>agua</td><td></td><td></td><td></td>desionizada</tr><tr><td></td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td>Debe ser capaz de mantener 37 &deg; C&nbsp; temperatura interna</td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo software versión 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>Se utiliza para analizar archivos FCS generados por el software FACS Diva</td></tr><tr><td>Puntas</td><td></td><td></td><td></td> de micropipeta</tr></tbody></table>

análisis de inmunodeficiencia cd8 simian virus-específica + células t en macacos rhesus por el péptido-mhc-i de tetrámeros la tinción

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

I (pMHC-I) tetrámeros de histocompatibilidad de clase péptido-principal han sido una herramienta muy valiosa para estudiar las respuestas de células T CD8 +. Debido a que estos reactivos se unen directamente a receptores de células T en la superficie de las células CD8 + T-linfocitos, tetrámeros pMHC-I marcados con fluorocromos permiten la detección precisa de antígeno (Ag) + específicos de células T CD8 sin la necesidad de re in vitro -estímulo. Por otra parte, cuando se combina con multi-color de citometría de flujo, pMHC-I tinción tetrámero puede revelar aspectos clave de las células T CD8 + Ag-específicas, incluyendo etapa de diferenciación, fenotipo de memoria, y el estado de activación. Estos tipos de análisis han sido especialmente útiles en el campo de la inmunología del VIH en las células T CD8 + pueden afectar la progresión a SIDA. La infección experimental de macacos rhesus con virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) proporciona una valiosa herramienta para estudiar la inmunidad celular contra el virus del SIDA. Como resultado, progre considerabless se ha hecho en la definición y la caracterización de las respuestas de células T en este modelo animal. Aquí presentamos un protocolo optimizado para el recuento de células T SIV-CD8 + específicas en macacos rhesus por pMHC-I tinción tetrámero. Nuestro ensayo permite la cuantificación y la memoria simultánea fenotipificación de dos poblaciones de células T pMHC-I tetrámero + CD8 + por prueba, que podrían ser útiles para el seguimiento de las respuestas de SIV específicos de células T CD8 + generadas por vacunación o infección SIV. Teniendo en cuenta la relevancia de primates no humanos en la investigación biomédica, esta metodología es aplicable para el estudio de las respuestas de células T CD8 + en múltiples contextos de enfermedades.

El protocolo descrito aquí se ha utilizado para determinar la magnitud y la memoria fenotipo de, las respuestas de células T de la mordaza de CM9 específicos de CD8 + inducidos por la vacuna en un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para este análisis, se utilizó un tetrámero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 conjugado-APC en un panel de tinción de citometría de flujo 8-color. Figura 1A - F muestra la estrategia de compuerta se utiliza para analizar...

A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

El objetivo general de este ensayo es enumerar y caracterizar las poblaciones de células T CD8 positivas específicas del virus de la inmunodeficiencia de simios generadas por vacunación o infección primaria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología de células T, como cuál es la frecuencia de células T CD8 específicas de antígeno inducidas por vacunación o infección. La principal ventaja de esta técnica es que puede cuantificar linfocitos T CD8 específicos de antígeno en muestras biológicas obtenidas directamente ex vivo sin necesidad de reestimulación in vitro.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la evaluación de las células T CD8 específicas de la incisión en el macaco rhesus, y para el estudio de las respuestas de las células T CDB en múltiples entornos de enfermedades. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al conocimiento incompleto disponible para la genética MHC del macaco rhesus, y porque la tinción por citometría de flujo requiere una aplicación precisa de anticuerpos. Comience volviendo a suspender el rhesus PBMC en el medio R10.Añade una concentración de 1,6 por 10 a la sépti

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Demostrar la utilidad de la citometría de flujo multicolor para la caracterización detallada fenotípica y funcional de la total, así como la memoria subconjuntos de células CD4 + y CD8 + T en macacos rhesus, el modelo ideal para estudios de vacunas contra el VIH / SIDA.

Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés...

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Este video muestra un método para caracterizar las células T de memoria CD8+ específicas para el virus de inmunodeficiencia de simio (VIS) utilizando tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor de clase I (PMHC-I). Un tetrámero pMHC-I es un complejo de cuatro moléculas MHC-I unidas a péptidos específicos de SIV y conjugadas a un fluoróforo. Estos tetrámeros se unen selectivamente a los receptores de células T (TCR) en las células T CD8+ específicas del VIS, lo que facilita la...

Una técnica de tinción de tetrámero de péptido-MHC-I para analizar células T de memoria CD8+ específicas de SIV

Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

Descrito es una metodología para cuantificar la expresión de 96 genes y 18 proteínas de la superficie de células ex vivo, lo que permite la identificación de diferencialmente expresan genes y proteínas en células virus-infectadas en comparación con las células no infectadas. Aplicamos el enfoque de estudio CD4 infectados por SIV+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India.

Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

El ensayo de liberación de cromo, un ensayo común para la detección de la actividad de células T citotóxicas, tiene varias limitaciones. El uso de células T CD8 específicas de antígeno y la línea tumoral de cáncer de mama humano, SKBR3, en el presente artículo, un enfoque basado en impedancia se examinó por la capacidad de detección de muerte celular.

La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

Aprende a cuantificar células T CD8 específicas contra el virus de la inmunodeficiencia simiana en macacos rhesus mediante tetrámeros de péptido-MHC-I y citometría de flujo. Este método permite evaluar respuestas inmunitarias ex vivo sin reestimulación in vitro.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción (Video) | JoVE Journal

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