Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

El objetivo general de este procedimiento es identificar y probar rápidamente los posibles límites de dominio dentro de grandes proteínas en espiral para mejorar la probabilidad de encontrar un fragmento intrínseco que cristalice. Este método puede ayudar a los investigadores a agilizar el proceso de cristalización de grandes proteínas en espiral, que pueden ser notoriamente difíciles de cristalizar. La ventaja de esta técnica es que integra métodos experimentales y computacionales para identificar y seleccionar rápidamente a los posibles candidatos para la cristalización, mejorando así sus posibilidades de éxito.

Jenna Zalewski, estudiante de posgrado en mi laboratorio, y Keith O'Conor, investigador de pregrado en mi laboratorio, demostrarán esta técnica. Para empezar, combine los resultados de las herramientas establecidas basadas en la web para generar predicciones de los posibles límites de dominio de bobina enrollada, tal como se describe en el protocolo de texto. Después de generar plásmidos de expresión y probar sus niveles de expresión como se detalla en el texto, comience la purificación de cada cepa que expresó con éxito la proteína marcada con Ruby.

Para lisar las células, primero resuspenda cada pellet de células descongeladas en 1,5 mililitros de tampón de lisis que se ha complementado con inhibidores de la proteasa. Agregue 30 microlitros de lisozima a una concentración de 10 miligramos por mililitro e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego sonicate, siguiendo las instrucciones del instrumento que se está utilizando. Centrifugar la muestra en una centrífuga de mesa durante 30 minutos a 14.000 veces G para pellets de material insoluble o células sin lisar.

Guarde tanto el sobrenadante como el pellet para su posterior análisis a través de SDS-PAGE. Para realizar la purificación por afinidad de níquel, primero incube 100 microlitros de las perlas de NTA de níquel, prelavadas en tampón de lisis con el lisado soluble durante cinco a 10 minutos. Invierte la suspensión varias veces para mezclar las cuentas.

Centrifugar la muestra a 800 veces G durante 30 segundos en una centrífuga de mesa para granular las perlas. A continuación, lave el pellet de tres a cinco veces con tampón de lisis para eliminar los contaminantes no específicos. Por último, eluir la proteína de fusión Ruby de las perlas con tampón de lisis, suplementado con un molar de imidazol.

Utilice un espectrofotómetro ajustado a 280 nanómetros para medir la concentración de la proteína de fusión Ruby, luego evalúe la homogeneidad de la muestra cargando de uno a cinco microgramos de proteína de fusión en un gel PAGE nativo. Ejecute el gel PAGE al 10% nativo a cuatro grados centígrados durante 140 minutos a 175 voltios. Obtenga una imagen del PAGE nativo utilizando un generador de imágenes equipado para visualizar la fluorescencia, observando dónde migra la fusión marcada con Ruby en este ensayo.

Realice una proteólisis limitada para identificar dominios plegados de forma estable incubando primero 95 microlitros de fusión Ruby-Shroom SD2 con cinco microlitros de 0,025 Subtilisina A. Muestree la reacción en puntos de tiempo de cero, 0,5, dos, cinco, 15, 60 y 120 minutos, eliminando 10 microlitros de la reacción para cada punto de tiempo y visualizando el progreso de la reacción a través de SDS-PAGE utilizando un gel de acrilamida al 15%. Tiñe el gel con azul de Coomassie para evaluar si se puede identificar una especie resistente a la proteasa. Integre los datos de la eficiencia de purificación, el comportamiento en PAGE nativo y la proteólisis limitada en las proteínas de fusión mRuby2-Shroom parcialmente purificadas en una evaluación completa del comportamiento general de estas proteínas en solución.

Realice expresiones a gran escala con cultivos de dos litros de mRuby2-Shroom SD2 con el objetivo de lograr de cinco a 20 miligramos de muestra completamente purificada. Después del crecimiento celular, granule las células por centrifugación a 8.000 veces G durante 10 minutos. El pellet de celda resultante se puede almacenar a menos 80 grados centígrados hasta que se necesite.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en aproximadamente ocho mililitros de tampón de lisis por gramo de pellet de célula congelada. Lisar las células resuspendidas con un homogeneizador. Después de la lisis celular, granule los restos celulares mediante centrifugación a 30.000 veces G durante 30 minutos.

A continuación, aglutinar por lotes la fracción soluble con 10 mililitros de resina NTA de níquel prelavada. Vierta la suspensión de perlas en una columna de gravedad adecuada y permita que las proteínas no unidas se drenen, luego lave la resina de tres a cinco veces con 40 mililitros de tampón de lisis, seguido de un lavado con tampón de lisis suplementado con cloruro de sodio molar. Realizar un lavado final de la resina con 40 mililitros de tampón de lisis suplementado con 80 milimolares de imidazol.

Eluir la proteína de fusión Ruby-Shroom con 40 mililitros de tampón de lisis que contiene un molar de imidazol. Fraccionar manualmente la proteína eluida en fracciones de cuatro a 10 mililitros. Confirme las fracciones que contienen proteína de fusión Ruby-Shroom utilizando un gel 10%SDS-PAGE.

Agregue un miligramo de proteasa TEV por cada 25 a 50 miligramos de proteína de fusión para eliminar la etiqueta Ruby. A continuación, dialice las fracciones apropiadas en el tampón de escisión de TEV utilizando un tubo de diálisis de corte de peso molecular de seis a ocho kilodalton. Diálisis la proteína durante la noche a temperatura ambiente con agitación lenta.

Después de la diálisis, repita los pasos de purificación por afinidad de níquel. El dominio Shroom-SD2 debe fluir a través de la fracción no unida, mientras que la etiqueta Ruby permanece unida a la resina. Usando un concentrador de espín, concentre las fracciones pico a aproximadamente 10 miligramos por mililitro, luego realice una cromatografía de exclusión por tamaño analizando las fracciones pico a través de un gel SDS-PAGE al 12%.

Después de agrupar las fracciones máximas, dialice la solución en tampón de cristalización, luego concentre la proteína dializada a 10 miligramos por mililitro antes de la cristalización. Examine una pequeña matriz de 12 condiciones para identificar una concentración óptima de proteínas para los ensayos de cristalización utilizando 24 bandejas de cristalización en gota bien colocadas. Realizar ensayos de cristalización utilizando el método de difusión de vapor.

Primero, pipetee 500 microlitros de cada una de las 12 condiciones en pocillos separados. En cada pedestal, haga gotas que contengan un microlitro de solución de pocillo y un microlitro de muestra de proteína. Selle rápidamente la bandeja con cinta adhesiva transparente, luego muévala a un entorno adecuado con temperatura controlada que esté libre de vibraciones.

Examine las gotas en las bandejas durante los próximos tres días usando un microscopio con un aumento de hasta 100X. Al final del período de tres días, marque cada gota como sin precipitación, precipitación ligera, precipitación fuerte o cristales. Una concentración adecuada de proteínas no debe contener más de seis precipitaciones intensas.

Utilizando la concentración de proteína determinada, cribado una amplia gama de cribados de cristalización disponibles en el mercado. El uso de un robot de manipulación o cristalización de líquidos acelera enormemente este proceso y minimiza el error en las gotas. Requiere mucha menos proteína, lo que permite al usuario detectar más afecciones con una sola muestra.

Mejore las condiciones iniciales identificadas a partir de cribas amplias variando sistemáticamente cada una de las variables dentro de la caída de cristalización utilizando bandejas de cribado de 24 pocillos, como hasta ahora. La proteólisis limitada se utiliza para identificar regiones de la proteína que podrían ser flexibles o más accesibles a la proteasa. Aquí se muestra un patrón de degradación para un dominio SD2 que es proteolíticamente sensible y otro que es bastante estable.

Se realizó una proteólisis limitada en el contexto de las proteínas de fusión Ruby. En este caso, la secuencia del enlazador entre Ruby y el dominio SD2 se escindió rápidamente, como se esperaba, pero los fragmentos Ruby y SD2 resultantes permanecieron en gran medida estables. El análisis mediante PAGE nativo puede revelar rápidamente buenos candidatos para la cristalización.

Cuatro complejos Shroom-Rock con diferentes baterías de proteínas se ejecutaron con geles PAGE nativos. El complejo que contenía la roca 834 a 913 tuvo el mejor comportamiento y cristalizó fácilmente, mientras que los otros solo cristalizaron en la degradación o no lograron cristalizar por completo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un conjunto de límites de dominio potenciales para su proteína de bobina enrollada grande y cómo usar el sistema Ruby para identificar rápida y rápidamente los mejores candidatos para la cristalización.

Si bien la cristalografía sigue siendo un esfuerzo que requiere mucho tiempo, el uso de esta técnica centrará su búsqueda de proteínas que cristalizarán mediante ensayos sencillos para eliminar candidatos deficientes, lo que le permitirá dedicar más tiempo a los candidatos con mejores perspectivas de éxito. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir la mayor cantidad de información posible al seleccionar los posibles límites de dominio. La información que elija seleccionar al utilizar este procedimiento variará para cada proteína.

Si es posible, se deben realizar otros métodos, como ensayos bioquímicos o basados en células, para garantizar que los fragmentos de proteína en cuestión aún contienen la función de interés biológico. Aunque este método se centra en proteínas de bobina enrollada, el marco general podría adaptarse fácilmente para casi cualquier proteína. No olvide que trabajar con ciertos instrumentos y reactivos biológicos puede ser peligroso, y siempre se deben seguir precauciones, como el uso de guantes o gafas protectoras, al realizar este procedimiento.