Análisis cinemático de la división celular y la expansión: La cuantificación de la base celular del crecimiento y el desarrollo en las zonas de muestreo Zea mays Las hojas

Los objetivos generales de este análisis son determinar las bases celulares del crecimiento foliar del maíz y utilizar estos datos para investigar los mecanismos reguladores del crecimiento molecular mediante la realización de estrategias de muestreo específicas para cada etapa del desarrollo. Este método puede ayudar a abordar una pregunta clave en la biología del desarrollo de las plantas. ¿Cómo contribuyen la división y la expansión celular a las diferencias en el crecimiento de todo el órgano?

Este enfoque permite la investigación y el mapeo espacial de los procesos bioquímicos, moleculares y fisiológicos, que subyacen al crecimiento de todo el órgano de la planta. Aunque este sistema puede proporcionar información sobre el crecimiento de las hojas de maíz, la técnica se puede utilizar para otros sistemas. Incluyendo otras especies de gramíneas, y órganos.

La demostración visual de estos métodos es fundamental. En la recolección, la bi-blación de la muestra y los pasos de medición son difíciles de realizar sin esa demostración. Demostrando el procedimiento, estarán Katrien Sprangers y Viktoriya Avramova.

Dos estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para realizar un análisis quenemático completo del crecimiento foliar en monocotiledóneas, cultive al menos 15 plantas para cada tratamiento y genotipo, en condiciones controladas en una sala de crecimiento. Cuando aparezca una hoja de interés, use una regla para medir la longitud de la hoja, es decir, la longitud desde el suelo hasta la punta de la hoja, diariamente hasta que la hoja esté completamente expandida.

En la etapa de desarrollo de interés, corte la parte aérea de la planta de al menos cinco plantas representativas lo más cerca posible de las raíces, para mantener intacta la región merismática. Luego, comenzando por las hojas exteriores, desenrolle suavemente todas las hojas hasta la hoja de interés, una por una. Quitando unos milímetros extra de la base para separar las hojas según sea necesario.

A continuación, retire el ápice y las hojas pequeñas encerradas por la hoja de interés, y corte un segmento de tres centímetros de la hoja, comenzando desde la base en un lado de la vena media. Es crucial cortar la hoja justo donde está conectada al tallo. Como cortar a alto, llevaría a una subestimación del tamaño del meristemo.

Almacene el segmento en un tubo de ensayo de 1,5 mililitros, lleno de tres soluciones de ácido acético de etanol absoluto volumen por volumen, a cuatro grados centígrados durante 24 horas hasta varios meses. Desde el otro lado de la veta, corte un segmento de 11 centímetros de la base y almacene este segmento en un tubo de 15 mililitros lleno de etanol absoluto, a cuatro grados centígrados durante al menos seis horas para eliminar los pigmentos. Después de una segunda ronda de 24 horas en etanol absoluto a cuatro grados Celsius, reemplace el etanol con ácido láctico puro y almacene el segmento a cuatro grados Celsius durante otras 24 horas, o hasta un análisis más detallado.

Para medir el meristemo, primero transfiera el segmento de hoja de tres centímetros a un tampón de enjuague recién preparado durante 20 minutos. Al final de la incubación, transfiera el segmento a un recipiente con solución de tinción Dapi, durante dos a cinco minutos sobre hielo en la oscuridad. Luego, monte rápidamente el tejido en un portaobjetos de microscopio de vidrio y cubra el segmento con un cubreobjetos.

Confirme las fluorescencias de las células epidérmicas bajo un microscopio, utilizando fluorescencia UV. A continuación, monte la muestra en una gota de tampón de enjuague en un nuevo portaobjetos de microscopio con una nueva cubierta de vidrio. Con un aumento de 20 veces, devuelva el segmento al microscopio y desplácese por la muestra para localizar figuras mitóticas proliferativas.

Evite cualquier división celular formativa de los tallos en desarrollo, y luego defina dónde se encuentra la figura mitótica más distal. Usando un programa de software de análisis de imágenes, mida la longitud total del marco de la imagen. En este ejemplo, 645 micrómetros.

A continuación, cuenta el número de fotogramas que cubren toda la longitud del meristemo desde la figura mitótica más distal hasta la base de la hoja, y multiplica este número por la longitud de un fotograma para obtener la longitud completa del meristemo. Para obtener un perfil de longitud de celda, transfiera el segmento de 11 centímetros del ácido láctico al banco y use un bisturí para cortar el tejido en 10 segmentos de un centímetro. Monte los segmentos de hoja resultantes en un solo portaobjetos de microscopio y una pequeña gota de ácido láctico.

Colocando todas las piezas con el mismo lado hacia arriba. Y luego, transfiera el portaobjetos a un microscopio equipado con óptica de contraste de interferencia diferencial. Comenzando con el segmento más cercano a la base de la hoja, utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para medir la longitud de al menos 20 células epidérmicas replicadas y limas directamente adyacentes a las limas madre, para garantizar la selección consistente del mismo tipo de celda en posiciones igualmente espaciadas a lo largo de cada uno de los segmentos.

Tome la posición correspondiente para cada medida a lo largo de la hoja. A continuación, determine la longitud media de la celda en cada milímetro a lo largo del eje de la hoja utilizando un procedimiento de suavizado polinómico local implementado en el script R que está disponible como archivo complementario uno. Tenga cuidado de no alisar demasiado.

El suavizado debe eliminar el ruido en los datos de celdas, pero no afectar a la forma general de la curva. Aquí se muestra una comparación entre plantas bien regadas y plantas sometidas a condiciones de estrés por sequía en cuanto a su crecimiento foliar. La longitud final de las hojas de las plantas testigo fue un 40 por ciento menor que la de las plantas estresadas por sequía, debido a una menor tasa de elongación de las hojas.

La tasa de elongación foliar de las plantas estresadas por la sequía es 73 por ciento menor que la de los controles bien regados, debido a una menor producción de celdas. Lo cual, en el ternero, es causado principalmente por una tasa reducida de división celular. El análisis cinemático proporciona un mapa de la localización de la zona de crecimiento de las hojas, lo que permite la toma de muestras con una resolución subzonal para el análisis molecular y bioquímico.

Por ejemplo, la cuantificación de MDA a lo largo de la zona de crecimiento de la hoja de maíz en plantas sometidas a condiciones de control y sequía bien regadas, demuestra un aumento significativo de este producto de descomposición de lípidos en toda la zona de crecimiento en respuesta a las condiciones de retención de agua. Debido al acortamiento de las hojas en respuesta a la sequía, las zonas de desarrollo no se correspondieron en el testigo y en las plantas estresadas de este experimento. Sin embargo, utilizando el perfil de longitud de las celdas, se puede determinar la longitud de las zonas de desarrollo, lo que permite comparar los niveles de MDA en las zonas individuales.

Una vez dominada, se puede procesar una sola muestra en cuatro horas, si la técnica se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el meristemo intacto durante su recolección. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otras técnicas, como la determinación de parámetros moleculares y bioquímicos, para estudiar su implicación en la regulación del crecimiento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la división celular y la expansión celular en el cultivo de hojas de maíz, determinar el tamaño de las diferentes zonas de crecimiento e interpretar los datos moleculares y bioquímicos en consecuencia. No olvide que trabajar con ácidos láctico, acético y EDTA puede ser peligroso. Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y la limpieza del microscopio en cada etapa después de su uso, al realizar este procedimiento.