Name: El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprende a estimular el nervio vago para estudiar mecanismos antiinflamatorios colinérgicos en respuestas inflamatorias. Este protocolo quirúrgico permite analizar la interacción entre el sistema nervioso e inmune en modelos animales.

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El estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, la Asociación Sueca de Reumatismo, las Fundaciones del Instituto Karolinska, el Consejo del Condado de Estocolmo, la Fundación Wallenberg y la Fundación GV 80 Años para la investigación. Los autores también desean agradecer a Hannah Aucott por la revisión del manuscrito.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales aprobados por el Comité de Ética local en el Instituto Karolinska, Estocolmo. El Comité de Ética local sigue las directrices de la Unión Europea sobre el cuidado de los animales. NOTA: Los principales cambios desde el protocolo original son el tiempo de recuperación después de la cirugía (6 hr frente a 1 hr) y el nivel de LPS inyectados (2 mg / kg frente a 15 mg / kg). De lo contrario, los diferentes ajustes relacionados con la cirugía en sí no se han cambiado. 1. Preparar el material para la estimulación <ol><li> Encender el ordenador y el sistema de adquisición de datos vinculados a la electrodo de estimulación (Figura 1A). </li><li> Abra el programa de Reconocimiento. </li><li> Preparar una solución madre de LPS a una concentración de 5 mg / ml en 1X PBS, alícuota, y almacenarlo a -20 ° C. En el día del experimento, descongelar una alícuota y preparar un ademuestra cuada de LPS (0,5 mg / ml) con el fin de inyectar alrededor de 100 l en el animal, de acuerdo con el peso. </li></ol> 2. Preparación del animal para la anestesia <ol><li> Utilice ratones C57BL / 6. Mantener ellos en condiciones de clima controlado con un ciclo de luz de 12 h / oscuridad, alimentarlos comida estándar para roedores, y darles agua ad libitum. </li><li> Realizar la cirugía en ratones que pesan alrededor de 25 g en el día del experimento. Nota: Cuando se inducen reacciones inflamatorias, es particularmente importante para llevar a cabo revisiones regulares y observaciones de las reacciones clínicos en los animales. Se necesita la eutanasia prematura mediante inhalación de CO2 si la condición animal no cumple los criterios éticos. </li><li> Ajuste la máquina de anestesia. <ol><li> Asegúrese de que el tubo está conectado correctamente y no está dañado de alguna manera. Asegúrese de que el área de ventilación está funcionando correctamente. Conectar el filtro llave de la botella de isoflurano y llene el vaporizer con una cantidad suficiente de isoflurano. </li><li> Abra el suministro de gas (aire y oxígeno) y asegúrese de que las botellas contienen suficiente gas para el experimento. Un conector de tres vías es entonces capaz de enviar el flujo de isoflurano a la cámara de inducción o la máscara. </li></ol></li><li> Gire el conector de tres vías a la cámara de inducción. Elige una ratón de la jaula hogar e insertar el animal en la cámara. Ajuste el regulador de flujo de 1,0 L / min de oxígeno y 1,0 L de aire / min. Ajustar la concentración de isoflurano al 4 - 5%. </li><li> Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, afeitar el área quirúrgica y mover el animal de la cámara a la máscara. Gire el conector de tres vías para el flujo máscara. Ajuste el regulador de flujo de 0,25 L / min de oxígeno y 0.25 L de aire / min. <ol><li> Ajustar la concentración de isoflurano a 1.5 a 2.5%. Comprobar el nivel de anestesia por control reflejo y la frecuencia respiratoria antes de iniciar el procedur quirúrgicomi. </li></ol></li><li> Fije las patas del ratón al banco de trabajo utilizando cinta adhesiva. Asegúrese de que la nariz del animal está siendo cuidadosamente colocado en la máscara. </li></ol> 3. Cirugía y la estimulación del nervio vago <ol><li> Desinfectar el área quirúrgica con 70% de etanol. </li><li> El uso de un escalpelo, incisión cuidadosamente la piel a nivel del cuello (incisión de alrededor de 1 a 1,5 cm). Nota: En el protocolo, el procedimiento de cirugía termina aquí para los animales con operación simulada. De hecho, se ha demostrado que apenas tocando el nervio con una herramienta de metal ya que estimula, en cierta medida. Por lo tanto, para obtener un animal de control cirugía más precisa cuando se utiliza una pequeña cantidad de LPS, detener la cirugía en este paso. </li><li> Con la ayuda de un microscopio (objetivo 12,5X), aislar el nervio vago izquierdo desde la arteria carótida usando fórceps de disección. En primer lugar localizar el músculo esternocleidomastoideo mediante la eliminación de capas de la piel y la grasa, y luego retractarse enfin de poner las pinzas detrás de tanto nervio y la arteria. Nota: El siguiente paso es muy complicado, ya que el nervio y la arteria están estrechamente adheridas entre sí. Por lo tanto, es muy fácil de cortar el vaso y matar al animal. Sin embargo, mediante la colocación de las pinzas con mucho cuidado entre el nervio y la arteria, con el tiempo se separan, y es posible aislar el nervio. </li><li> Coloque el electrodo (Figura 1B) bajo el nervio vago. El electrodo de aguja es bastante largo, por lo que incluso si el nervio se mueve ligeramente durante la estimulación, siempre estará en contacto con el electrodo. </li><li> Realizar una inyección intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) con la ayuda de una jeringa (para la lectura de salida en los niveles de citoquinas, es decir, para medir el efecto de regulación hacia abajo). </li><li> Esperar 5 min antes de comenzar la estimulación. </li><li> Estimular el nervio vago durante 5 min a 5 V y 1 Hz pulsando el botón de inicio en el programa Reconocer. </li><li> Remover el electrodo y suturar la herida del animal con hilo de sutura quirúrgica. </li><li> Rociar una Película Barrera No Irritante (PBNI) sobre la herida con el fin de mejorar la cicatrización y para protegerse de las infecciones. </li></ol> 4. Recuperación de los Animales <ol><li> Después de la cirugía, mover al animal a su jaula para despertar y recuperación. Bajo la luz de infrarrojos con el fin de mantener la temperatura corporal, asegúrese de controlar al animal hasta la plena conciencia se ha recuperado. </li><li> Deje que el animal se recupere en su jaula durante 6 horas antes del sacrificio para el análisis. Nota: El efecto de la estimulación del nervio vago es muy rápido y también se ha demostrado que ser de larga duración (hasta 48 h), por lo que el tiempo de recuperación puede ser establecido por el experimentador de acuerdo con las necesidades del estudio. </li></ol> 5. Sacrificio para su posterior análisis <ol><li> Colocar el animal en una jaula vinculado a un dispositivo de administración de CO 2. </li><li> Permite configurar el dispositivo en un 5ciclo -min de inhalación de CO2. </li><li> Cuando se realiza la eutanasia, recoger los órganos de interés y congelar directamente en hielo seco para análisis adicional (por ejemplo, la medición de los niveles de citoquinas en los extractos de bazo usando un TH1 ratón / TH2 ensayo 9-Plex) 3. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde su descubrimiento en la década de 2000, los mecanismos de la PAC han sido estudiados a fondo. Ahora tenemos una buena imagen de la vía y, en particular, el órgano diana, el bazo, donde NE, las células T de memoria, Ach, y macrófagos trabajo como un equipo muy eficiente para regular a la baja mediadores inflamatorios 2. También hemos publicado recientemente datos sobre la importancia de un sistema de prostaglandina funcional en ratones, en particular, PGE 2, que es obviamente un c...

La inmunidad innata proporciona una primera línea inmediata de defensa contra las infecciones y enfermedades en una amplia gama de organismos. No sólo se inicia la respuesta inmune primaria para eliminar la amenaza, sino que también desempeña un papel fundamental en la activación y educar a la inmunidad adaptativa que lleva a cabo respuestas inmunes secundarias de una manera específica del patógeno. La inflamación está orquestada por una gran cantidad de citocinas y quimiocinas, que a su vez tienen la capacidad de atraer otras células inmunitarias al sitio de la infección y para inducir los signos cardinales de la inflamación, tales como enrojecimiento, hinchazón, dolor, pérdida de función, y la fiebre . La duración y la intensidad de la inflamación dependen de varios factores, pero la resolución de la inflamación y la restauración de la homeostasis es un paso crítico para evitar la aparición de enfermedades inflamatorias crónicas. Los recientes avances en el campo de la neurología y la inmunología han desentrañado los mecanismos neuronales específicos con un inmenso potencial terapéutico para controlar la inflinflamación tanto en el sistema nervioso central y en la periferia. Uno de estos mecanismos es la vía anti-inflamatorio colinérgico (CAP), también conocido como el reflejo inflamatorio, que es accionado por el sistema nervioso autónomo 4, 5. Actualmente se cree que los mediadores inflamatorios activan los nervios sensoriales y envían señales sobre el estado de la inflamación en el sistema nervioso central. Una respuesta refleja se activa a continuación, a través del nervio vago eferente. Un extenso estudio sobre los detalles anatómicos de la PAC ha revelado un modelo parasimpático-simpático compuesto de dos nervios, el nervio vago y el nervio esplénico, respectivamente 6. En el PAC, el colinérgico nervio vago eferente activado termina en el ganglio celíaco-mesentérica, lo que resulta en la activación del nervio esplénico adrenérgico por un mecanismo aún no se ha explorado. El nervio esplénico, activado de este modo, se sabe que internaVate en estrecha proximidad a las células inmunes en la pulpa blanca, de la zona marginal, y la pulpa roja del bazo, el órgano principal y obligatoria de la PAC 7, 8. La norepinefrina (NE) a partir de las terminaciones nerviosas esplénicas se une a los correspondientes receptores adrenérgicos β 2 expresados en los linfocitos T esplénicas. Esto induce la liberación de colina acetil transferasa (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que a su vez activa los receptores nicotínicos de acetilcolina a7 (α7nACh) sobre los macrófagos, lo que limita la producción de citoquinas y la inflamación 2. En consecuencia, ahora está claro que el sistema nervioso es capaz de regular la inflamación en los tejidos periféricos y restaurar la homeostasis inmune local. Como el nombre de la vía sugiere, el sistema de ACh es de importancia fundamental para el funcionamiento de esta vía de regulación neuro-inmune. Curiosamente, los mecanismos implicados en la activación dela PAC parece ser diferente en la periferia y en el sistema nervioso central. Si bien la importancia de los receptores nicotínicos (α7nAChR) en el bazo se ha demostrado anteriormente 9, los receptores muscarínicos (mAChR) son obligatorios para la activación central de la vía 10, 11. Más recientemente, la administración periférica de un agonista muscarínico M1 de acción central suprimió significativamente suero y tumorales bazo factor de necrosis α (TNF) durante la endotoxemia letal murino, una acción que requiere nervio vago intacto y el nervio esplénico de señalización 12. También hemos demostrado recientemente que los ratones que carecen de la prostaglandina E 2 (PGE 2) no fueron capaces de responder a la estimulación del nervio vago y no disminuye la liberación inducida por LPS de citoquinas en el suero y el bazo 3. Por lo tanto, la PAC también puede ser regulada por sistemas distintos de la principal pathw AChsí. El nervio vago ha sido nombrado como tales debido a su curso errante en el cuerpo, que inervan los órganos principales incluyendo el hígado, pulmón, bazo, riñones, y el intestino 13. Teniendo en cuenta este gran inervación y el efecto inmunosupresor muy potente del nervio vago, el potencial terapéutico de la PAC podría cubrir un amplio rango de condiciones inflamatorias. El nervio vago puede ser eléctricamente (o mecánicamente) activado, con el control de la tensión y la frecuencia, y contrariamente al tratamiento convencional, sin fármacos añadidos al cuerpo. Actualmente se están realizando ensayos en pacientes reumáticos, por ejemplo, para probar la significación clínica de la estimulación del nervio vago en el tratamiento de la inflamación crónica 14. En total, la comunicación y la regulación de la inflamación neuro-inmune están actualmente bajo investigación, que proporcionará un tratamiento posible alternativa a la terapia convencional. Por lo tanto, el análisis de la estimulación del nervio vagon efecto en los diferentes órganos inervados, sino también la caracterización del potencial de acción terapéutica en modelos animales de inflamación crónica, sin duda dar ideas y la esperanza de nuevas dianas terapéuticas potenciales. La metodología original desarrollado por Tracey y sus colegas 4 no podía aplicarse a nuestro campo de la investigación debido a la sobre-estimulación de la respuesta inflamatoria (por una dosis letal de LPS) y un intervalo de tiempo demasiado corto entre la activación de la PAC y de la lectura de salida. En el presente trabajo, presentaremos los cambios realizados en el protocolo original, comparar las dos metodologías diferentes en los niveles de citoquinas, y poner de relieve una nueva y opuesta de observación en el órgano diana (bazo).

<table><tbody><tr><td>Computadora</td><td>Toshiba-Cualquier</td><td></td> <td>computadora es realmente compatible</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos MP-150</td><td>Sistemas Biopac</td><td>MP150WSW</td><td></td></tr><tr><td>software de reconocimiento</td><td>Biopac Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones C57Bl/6</td><td>Charles River Máquina</td> anestésica Simtec Engineering <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Botella</td><td>de</td></tr><tr><td>oxígeno médico</td><td>AGA</td><td>107563</td><td></td></tr><tr><td>Botella de aire medicinal&nbsp;</td><td>AGA</td><td>108639</td><td></td></tr><tr><td>Vetflurano (1.000 mg/g)</td><td>Virbac</td><td>137317</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Merck Millipore</td><td>1024060080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Diluido 10 veces para la concentración utilizada</td></tr><tr><td>Jeringa (1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Agujas 23 G</td><td>KD-FINE</td><td></td> 900284 <td>0,6 x 30 mm (azul)</td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección (curvas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica 4-0</td><td>Ethicon</td><td>G667G</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de eutanasia</td><td>Euthanex Smartbox</td><td>EA-32000</td><td></td></tr><tr><td>Cavilon Película</td> <td>de barrera antipicadurasEnsayo 3M Health Care</td><td>3346N</td><td></td></tr><tr><td>TH1/TH2 9-Plex, kit ultrasensible</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15013C-1</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de electrodos estimulantes</td><td>Biopac Systems</td><td>STIMSOC</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Aisis afeitadora</td><td>Agnthos</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>R70</td><td></td><td></td><td>Dieta para roedores de Lantmannen, Estocolmo, Suecia</td></tr></tbody></table>

el aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de lps para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias limited

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

La inflamación es una respuesta local a la infección y al daño tisular mediada por macrófagos activados, monocitos y otras células inmunitarias que liberan citocinas y otros mediadores de la inflamación. Durante mucho tiempo, los mecanismos humorales y celulares se han estudiado por su papel en la regulación de la respuesta inmunitaria, pero los avances recientes en el campo de la inmunología y la neurociencia también han desentrañado mecanismos neuronales específicos con un interesante potencial terapéutico. Se ha descrito que la llamada vía antiinflamatoria colinérgica (CAP) controla las respuestas inmunitarias innatas y la inflamación de una manera muy potente. A principios de la década de 2000, Tracey y sus colaboradores desarrollaron una técnica que estimula el nervio vago e imita el efecto de la vía. La metodología se basa en la estimulación eléctrica del nervio vago a baja tensión y frecuencia, con el fin de evitar cualquier efecto secundario de la sobreestimulación, como la desregulación de la variabilidad de la frecuencia cardíaca. En la actualidad se dispone de dispositivos eléctricos para la estimulación, lo que facilita la puesta en marcha de la metodología en el laboratorio. El objetivo de esta investigación fue investigar la posible implicación de las prostaglandinas en la NAC. Desafortunadamente, basándonos en intentos anteriores, no pudimos utilizar el protocolo original, ya que la respuesta inflamatoria inducida era demasiado alta o no era adecuada para las propiedades del metabolismo enzimático. Los diferentes ajustes del protocolo quirúrgico original permanecieron prácticamente sin cambios, pero las condiciones con respecto a la inducción inflamatoria y el momento antes del sacrificio mejoraron para adaptarse a nuestros propósitos (es decir, para investigar la participación de la NAC en respuestas inflamatorias más limitadas). 
La versión modificada del protocolo original, presentada aquí, incluye un rango de tiempo más largo entre la estimulación del nervio vago y el análisis, lo que se asocia con una menor inducción de respuestas inflamatorias. Además, al mismo tiempo que disminuimos el nivel de lipopolisacáridos (LPS) para inyectar, también encontramos nuevas observaciones sobre las propiedades mecanicistas en el bazo.

Nivel de TNF y la interleucina-1β (IL-1β) después de aumentar la Lapso de tiempo después de la cirugía y la disminución de la dosis de LPS Como se indica anteriormente, utilizando el protocolo original, VNS disminuyó los niveles de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg en SHAM frente a 39,7 ± 10,8 pg / mg en VNS, p &lt;0,001) y la IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg en SHAM frente a 191,7 ± 27,2 pg / mg en VNS, p &lt;0,01) en el bazo después de la...

La estimulación del nervio vago ha demostrado tener una gran eficacia para disminuir la inflamación periférica. Aquí, presentamos un protocolo modificado de estimulación del nervio vago que permite exámenes adicionales de los mecanismos antiinflamatorios colinérgicos en respuestas inflamatorias limitadas.

El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

El objetivo general de esta intervención quirúrgica es observar el efecto de la estimulación del nervio vago en las condiciones inflamatorias. Analizar y comprender los diferentes mecanismos y células implicadas en la denominada vía antiinflamatoria colinérgica. Este método fue desarrollado en el laboratorio de Kevin Tracey en el Instituto Feinstein.El método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología. Como avances recientes se establece una estrecha relación entre el sistema nervioso y el inmunológico. La principal ventaja de esta técnica es que se puede montar fácilmente en un laboratorio.Pero hay que seguir reglas importantes con respecto al cuidado de los animales y el protocolo quirúrgico. El curso errante del nervio vago a través de todo el cuerpo y su capacidad para regular la información en varios modelos animales implica que su estimulación podría ser útil en el tratamiento de muchas enfermedades inflamatorias. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades para identificar y aislar el nervio vago de la arteria carótida bajo observación microscópica.Sin embargo, aunque es complicado al principio, se vuelve más fáci

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Investigación

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La estimulación del nervio vago (VNS) se ha convertido en una herramienta para inducir plasticidad sináptica específica en el cerebro anterior para modificar una serie de comportamientos. Este protocolo describe cómo implementar VNS para facilitar la consolidación de la memoria miedo extinción.

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Estimulación del nervio vago (ENV) ha demostrado ser eficaz como un tratamiento adjunto para la depresión tratamiento-resistente (TRD). VNS conduce a efectos antidepresivos y antisuicidal y mejoras de la calidad de vida. Este protocolo ofrece un paso a paso guía para la gestión y ajuste de un estimulador del nervio vago para el tratamiento eficiente de TRD.

Estimulación del nervio vago como instrumento complementario de neuroestimulación en la depresión tratamiento-resistente

Se describe una descripción metodológica de la técnica, objetivos potenciales y administración adecuada de estimulación transcutánea del nervio del nervio vago auricular (taVNS) en el oído humano.

Laboratorio administración de Auricular del nervio vago estimulación transcutánea (taVNS): técnica, orientación y consideraciones

Los enfoques existentes para la construcción de electrodos nerviosos periféricos crónicamente implantables para su uso en roedores pequeños a menudo requieren equipo especializado y/o personal altamente capacitado. En este protocolo demostramos un enfoque simple y de bajo costo para fabricar electrodos de manguito implantables crónicamente, y demostramos su eficacia para la estimulación nerviosa de vagon (VNS) en ratas.

Preparación de electrodos de estimulación nerviosa periférica para la implantación crónica en ratas

La cirugía modificada es un método simplificado para el modelo de lesión nerviosa sin nervios en ratones o ratas que requiere solo una ligadura y un corte para lesionar los nervios peroneo y sural comunes.

Modelo modificado de cirugía de lesión nerviosa preservada del dolor neuropático en ratones

El presente protocolo describe la técnica quirúrgica para implantar una guía de electrodos en el nervio vago abdominal en ratas, junto con métodos para pruebas de electrofisiología crónica y estimulación con el dispositivo implantado.

Cirugía de implantación para estudios de estimulación y registro del nervio vago abdominal en ratas despiertas

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

La colonización del nasopharynx murine con pneumoniae del estreptococo y la extracción subsecuente de células adherentes o reclutadas se describe. Esta técnica consiste en enjuagar la nasofaringe y la recolección del líquido a través de las narinas y es adaptable para varias lecturas, incluyendo la cuantificación celular diferencial y el análisis de la expresión de ARNm in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

El trasplante de piel de cola es un poderoso modelo para estudiar el rechazo dependiente de las células T y la inducción de tolerancia durante las respuestas inmunes alogénicas en ratones. Las ventajas de este protocolo son la cirugía invasiva menor y la facilidad de seguimiento sin necesidad de sacrificar el ratón receptor.

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

Aprende a estimular el nervio vago para estudiar mecanismos antiinflamatorios colinérgicos en respuestas inflamatorias. Este protocolo quirúrgico permite analizar la interacción entre el sistema nervioso e inmune en modelos animales.

El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited (Video) | JoVE Journal

El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited

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