Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar Drosophila Comportamiento de las larvas de arrastre
26 de noviembre de 2016
La larva de Drosophila es un sistema poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta. Esta publicación describe el uso de canales lineales de agarosa para provocar combates sostenidos de rastreo y métodos lineales para cuantificar la dinámica de las estructuras de larvas durante el rastreo comportamiento repetitivo.
El objetivo general de este procedimiento es observar la etapa larvaria de Drosophila arrastrándose en un canal lineal de agarosa para estudiar el desarrollo de circuitos neuronales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neuroetología y la biología del desarrollo, como la comprensión de los códigos neuronales que generan patrones motores y la identificación de procesos genéticos y celulares clave que afectan a los circuitos neuronales para el control del movimiento. La principal ventaja de esta técnica es que restringe el repertorio de comportamiento de las larvas para que los investigadores puedan estudiar en detalle un solo patrón múltiple.
El encargado de demostrar el procedimiento será Zarion Marshall, un técnico de mi laboratorio. En primer lugar, es importante evaluar la salud de la larva. Tres o cuatro días antes de la grabación, reemplace la placa de recolección de la jaula para adultos.
Proceda a hacer esto diariamente y a la misma hora del día. Cuente los huevos y las larvas recién eclosionadas en el plato. El número esperado de huevos es de entre 500 y 2.000.
Ajuste el número de adultos en la jaula según sea necesario. Examinamos la placa 24 horas después para determinar si las larvas están sanas. La mayoría de los huevos deberían haberse convertido en larvas, y las larvas deberían haberse arrastrado hasta la pasta de levadura.
Los signos de mala salud incluyen una gran cantidad de huevos sin eclosionar, cuerpos de larvas muertas lejos de la pasta de levadura y larvas con manchas inusualmente oscuras en el abdomen, lo que es un indicador de una reacción inmune. Si las larvas parecen poco saludables, cambie la jaula con platos recién preparados y verifique el genotipo de los adultos. Para el experimento, recoja larvas de segundo estadio recién eclosionadas de placas de uno a dos días de edad.
Todas estas etapas se pueden utilizar en el análisis. Para este protocolo, tenga un molde de fundición PDMS de canal lineal. Limpie el molde de fundición con alcohol isopropílico.
Una vez que esté seco, coloca el molde en una tapa de diez centímetros o recipiente similar. Luego llene el molde con un tres por ciento de agarosa enfriada a 55 grados centígrados. Vierta la agarosa con cuidado para evitar atrapar burbujas de aire en el molde.
El molde debe quedar cubierto por la agarosa. Una vez solidificado, retira los canales de agarosa del molde. Recorte los bordes de los canales en forma de disco y luego sumerja los canales en agua.
Pueden almacenarse en agua a cuatro grados centígrados durante un máximo de siete días. Antes de usar los canales, deje que se calienten a temperatura ambiente. Seleccione un canal que coincida con el ancho de la larva.
Los canales van de 100 a 300 micras de ancho y todos tienen 150 micras de profundidad. A continuación, utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar un solo canal del disco preparado. Con pinzas, transfiera el canal a una cubierta de vidrio de tamaño adecuado, enbose o deslice con el lado ranurado hacia arriba.
A continuación, utilice unas pinzas finas para recoger suavemente una larva sin apretarla. Un pincel de punta fina también funciona bien. Si se aprieta, los reflejos de dolor, como rodar o encorvarse, pueden dominar el comportamiento de la larva en el canal.
Ahora lave la larva sumergiéndola brevemente en agua y luego colóquela en el canal cortado moviéndola suavemente en su posición. Una vez en el canal, ajuste la orientación de la larva para que la estructura de interés sea fácil de visualizar. Luego coloque una o dos gotas de agua en cada extremo del canal para llenar el canal con agua.
Si quedan atrapadas burbujas de aire, levante suavemente los lados del canal para eliminarlas. Para ajustar aún más la orientación de la larva, empuje suavemente el canal para hacer rodar la larva. La larva ya está lista para ser fotografiada.
Las larvas en canales lineales realizan episodios sostenidos de rastreo rítmico. Las sondas fluorescentes se examinan fácilmente. Por ejemplo, las larvas que expresan GFP en sus neuronas desde el controlador GAL4 muestran cambios dinámicos en las intensidades fluorescentes que emanan del cordón nervioso durante el ciclo de arrastre.
El SNC se mueve hacia adelante casi al mismo tiempo que la cabeza y la cola de la larva a medida que una onda de contracción muscular pasa a lo largo del eje del cuerpo, el SNC se mueve dentro y fuera del plano de enfoque, lo que hace que cambie la fluorescencia del cordón nervioso. Los cambios en la fluorescencia se cuantificaron a partir de tres zancadas de arrastre para tres larvas. La dinámica de la fluorescencia del cordón nervioso a lo largo del ciclo de zancada siguió un patrón reproducible que podría utilizarse para el fenotipado.
Después de ver este video, debe comprender cómo recolectar larvas para el comportamiento, preparar canales de agarosa y cargar las larvas en los canales para visualizar el comportamiento de rastreo lineal. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las larvas con cuidado.
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Descripción general
Este estudio utiliza larvas de Drosophila como modelo para investigar el control neural del comportamiento mediante el arrastre lineal en canales de agarosa. La metodología permite una observación detallada del movimiento larval y de la dinámica de los circuitos neuronales implicados en el control motor.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neuroetología
- Biología del desarrollo
- Neurociencia
Antecedentes
- Las larvas de Drosophila son modelos eficaces para estudiar el comportamiento.
- Comprender los códigos neuronales es fundamental para la generación de patrones motores.
- La identificación de procesos genéticos y celulares ayuda a trazar circuitos neuronales.
- Restringir el comportamiento permite un estudio enfocado en patrones motores específicos.
Objetivo del estudio
- Observar el comportamiento de arrastre de las larvas en un ambiente controlado.
- Estudiar el desarrollo de circuitos neuronales implicados en el movimiento.
- Responder preguntas clave en neuroetología y biología del desarrollo.
Métodos Utilizados
- Uso de canales de agarosa lineales para la observación del desplazamiento.
- Evaluación de la salud de las larvas antes de los experimentos.
- Cuantificación de la dinámica durante el comportamiento de desplazamiento repetitivo.
- Demuestra el procedimiento un técnico de laboratorio.
Resultados Principales
- Inducción exitosa de episodios sostenidos de arrastre en larvas.
- Observación detallada de la dinámica estructural larval durante el movimiento.
- Conocimientos sobre los mecanismos neuronales que controlan los patrones motores.
- Establecimiento de un método confiable para estudiar el comportamiento larval.
Conclusiones
- El método proporciona una plataforma para estudiar circuitos neuronales en detalle.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión del control del movimiento en Drosophila.
- La investigación futura puede basarse en esta técnica para explorar preguntas adicionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos con canales de agarosa lineales para el arrastre de larvas de Drosophila permiten una disección precisa de la función de los circuitos neuronales subyacentes a los comportamientos motores rítmicos. Este enfoque facilita la validación confiable de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos guiado por la neurobiología. La reproducibilidad del método y sus resultados cuantitativos lo posicionan como una plataforma reutilizable para cribados fenotípicos e investigaciones traslacionales en estudios de neurodesarrollo y control motor.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una interrogación detallada de los mecanismos de circuitos neuronales que controlan los patrones motores.
- Apoya la validación funcional de objetivos al vincular perturbaciones genéticas con fenotipos conductuales cuantificables.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al aislar el arrastre rítmico de conductas confusas.
- Proporciona una plataforma para la exploración basada en hipótesis de las vías del neurodesarrollo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona ensayos conductuales estandarizados y reproducibles para cribados posteriores de compuestos o genéticos.
- Genera lecturas cuantitativas a nivel de segmento y músculo para fenotipado robusto.
- Permite la preparación escalable de sistemas relevantes para enfermedades destinados a análisis de alto contenido.
- Facilita la disponibilidad de ensayos para evaluar moduladores neurales o musculares.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con las estrategias de biomarcadores traslacionales al permitir la imagenología in vivo de la actividad neuronal durante el comportamiento.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica en un modelo manejable.
- Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la vinculación de intervenciones moleculares con resultados funcionales.
- Facilita la reducción predictiva de riesgos para carteras de compuestos neuroactivos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica de dianas neuroconductuales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función de circuitos neuronales y la cartografía de vías en un sistema genéticamente tratable.
- Selección: Proporciona resultados conductuales cuantitativos y reproducibles para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Permite la medición de la dinámica de fluorescencia y de los parámetros del ciclo de zancada para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con el trabajo preclínico al permitir el monitoreo de la actividad neuronal in vivo durante la conducta.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma flexible y agnóstica al genotipo, adaptable a diversas necesidades de investigación y selección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuroconductuales.
- Valor operativo: Estandariza ensayos conductuales para lograr reproductibilidad y escalabilidad entre distintos equipos de investigación.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al proporcionar fenotipificación cuantitativa y robusta.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos e intervenciones neuroactivas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, análisis del comportamiento e imágenes de fluorescencia.
- Necesita acceso a moldes de fundición, plataformas de imagen y herramientas de análisis cuantitativo.
- Exige la estandarización entre equipos de las dimensiones de los canales y los protocolos de adquisición de imágenes.
- Adaptable a diversos genotipos y geometrías de canales diseñadas por el investigador.
- Las limitaciones prácticas incluyen el manejo cuidadoso de las larvas para evitar artefactos inducidos por estrés.
