Name: Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar Drosophila Comportamiento de las larvas de arrastre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende a observar el comportamiento de arrastre en larvas de Drosophila utilizando canales lineales de agarosa. Este método permite estudiar en detalle los circuitos neuronales que controlan los patrones motores en neuroetología.

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Nos gustaría agradecer a Chris Wreden y Michelle Bland por sus comentarios sobre el manuscrito y por su ayuda técnica.

1. Preparación de las larvas <ol><li> Una semana antes de grabar el comportamiento, configure una cruz (mínimo de 25 vírgenes y 5 machos). Mantener todos los cruces y la progenie a 25 ° C. NOTA: La temperatura de las condiciones de cultivo puede ser alterado, pero tendría que ser ajustado para tener en cuenta los cambios en la velocidad del desarrollo de la línea de tiempo se describe a continuación. </li><li> 5 días antes de la grabación, a primera hora de la mañana, colocar la cruz en una jaula de recogida con una cápsula de agar / jugo y un lenguado (0,5-1 ml) de pasta de levadura en el centro de la tapa de agar / jugo. <ol><li> Para hacer una jaula de recogida, hacer agujeros en un 6 oz. polietileno cuadrada botella de Drosophila. </li><li> Para hacer que las tapas agar / jugo, mezclar 18 g de agar con 600 ml de agua en un matraz cónico. En un matraz de mezcla 20 g de sacarosa por separado con jugo de manzana 200 ml. Microondas hasta que los sólidos se disuelven. Combinar y agitar, permitiendo mezcla se enfríe a 60 ° C. Añadir 20 ml de 10% de metil-p-hidroxibenzoato de etanol al 95% y se agita. Añadir 7 ~ml a la media parte inferior de una placa de Petri redonda 35 x 10 mm. Permitir agar / jugo se solidifique durante 1 hora a RT. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Para hacer la pasta de levadura, añadir partes iguales por volumen de levadura seca y el agua. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Comprobar el estado de las colecciones de larvas. <ol><li> Por la mañana, 4 y 3 días antes de la grabación, retire la tapa y coloque una tapa fresca en la jaula. Cambiar las tapas al mismo tiempo cada día para conseguir una colección de 24 horas de los huevos y larvas recién eclosionadas. </li><li> Después se retira cada tapa, examinarlo para ver cuántos huevos la cruz está sentando. Esperar entre 500-2.000 huevos. Ajustar el número de adultos, si es necesario. NOTA: Algunas huevos deberían haber eclosionado en larvas, y las larvas recién nacida se encuentran lejos de la pasta de levadura. </li><li> Envejecer cada tapa durante 24 horas. Volver a examinar la tapa para determinar si las larvas son saludables. NOTA: La mayoría de los huevos deben han eclosionado en larvas, y las larvas deberían haber metido en la ospasta de AST. Los signos de mala salud incluyen un gran número de huevos sin eclosionar, los cuerpos de larvas muertas de distancia de la pasta de levadura, y las larvas con importantes manchas oscuras en el abdomen, lo que indica una reacción inmune. Si las larvas no son saludables, cambiar la jaula, hacer tapas frescas / pasta de levadura, y comprobar el genotipo. </li><li> Desechar las viejas tapas. </li></ol></li><li> Recoger las larvas para las grabaciones de comportamiento. <ol><li> En ambos 2 y 1 día antes de la grabación, retire la tapa y reemplazar con una tapa fresca. </li><li> Etiqueta de cada tapa retirada y mantener a 25 ° C. Esto producirá una serie de etapas de larvas para las grabaciones de comportamiento. Las larvas recién nacidas de (0-4 hr después de la eclosión) a través de segundo instar (24-48 hr después de la eclosión) se puede utilizar en los canales. Guarde los casquillos para las grabaciones en días consecutivos. </li><li> Deseche todos los tapones después de 48 horas. </li><li> Si es necesario, repita los pasos 1.4.1-1.4.3 para un máximo de 5 d adicional. Después de que menos producen huevos fertilizados. </li></ol></li></ol><ol><li> Preparar el PDMS canal lineal (polidimetilsiloxano, un elastómero de silicona) molde de fundición (Figura 1A). PDMS moldes de fundición están disponibles en el laboratorio de Heckscher bajo petición. <ol><li> Limpiar el molde de fundición con alcohol isopropílico. Deje secar al aire, séquelo con toallitas de laboratorio, o usar aire comprimido. </li><li> Colocar el molde de colada en un Petri tapa 10 cm plato u otro recipiente. </li></ol></li><li> Preparar y verter solución de agarosa. <ol><li> Hacer una solución 3% de agarosa en agua (3 g en 100 ml) en el microondas hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Enfriar a 55 ° C, lo que permite burbujas suban a la superficie. </li><li> Verter la mezcla de agarosa en la placa de Petri que contiene el molde de colada de manera que el molde quede cubierto. Deje conjunto de agarosa hasta que se solidifique. </li></ol></li><li> Quitar los canales de agarosa a partir del molde de fundición. Recortar los bordes del disco de agarosa con una hoja de afeitar. <ol><li> Ponga el canals en un plato de 10 cm Petri sumergido en agua. Se pueden conservar a 4 ° C durante 7 días. </li></ol></li></ol> 3. Carga de una larva en un canal de Comportamiento Registro NOTA: Si la memorización de canales a 4 ° C, permiten que los canales que alcanzara la temperatura ambiente antes de usar para la grabación del comportamiento. <ol><li> Utilice una hoja de afeitar limpia para cortar un único canal de los preparado en la Etapa 2 (Figura 2A). </li><li> Use un par de pinzas para colocar el canal ranurado de lado sobre un cubreobjetos de vidrio (Figura 2B). El tamaño y el grosor del cubreobjetos depende del alcance específico utilizado para la imagen. </li><li> Utilice unas pinzas finas para seleccionar una larva de la tapa de agar / jugo preparado en el Paso 1 y el lugar en el canal de corte (Figura 2C). <ol><li> No apriete la larva. Recogerlo suavemente con la punta del diente fórceps. También es posible manipular larva con un pincel con una punta fina. NOTA: Esto es importante ya que las larvas son muy sensitive al tacto. Si no se manejan con cuidado, las respuestas nociceptivas pueden dominar su comportamiento durante los primeros segundos del experimento. </li><li> Lavar las larvas sumergiendo brevemente en agua. </li><li> Después de colocar la larva en el canal de corte, utilice la punta del diente fórceps para burlarse suavemente la larva en el bosque de canal. NOTA: Para la mayoría de las aplicaciones de la anchura de la larva y la anchura del canal deben coincidir. La anchura media de larvas en diferentes etapas de desarrollo de la siguiente manera: 0 horas después de la eclosión - 140 micras, 24 horas después de la eclosión - 180 micras, 48 horas después de la eclosión - 320 micras, 72 horas después de la eclosión - 500 micras, 96 horas después de la eclosión - 750 micras 8. Los canales vienen en los siguientes anchos: 100, 150, 200, 250, y 300 micras, y todos los canales son 150 micras de profundidad. </li><li> Use la punta de un diente con fórceps o un pincel para ajustar la posición de la larva dentro del canal. Se puede orientarse en cualquier dirección: ventralarriba, abajo ventral, ventral a un lado, dependiendo de lo que es la estructura a explorar. </li></ol></li><li> Con unas pinzas, mueva suavemente sobre el canal de tal manera que la larva se encuentra ahora en la cubierta de vidrio. Coloque una o dos gotas de agua en los extremos del canal para que se llena de agua (Figura 2D). <ol><li> levantar suavemente los lados del canal para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Ajustar la orientación de la larva. Para ello, empujar suavemente el canal pero no el vidrio de cubierta para rodar la larva. Si esto no cambia la orientación, retire la cubierta de vidrio y ajustar la posición de las larvas. La larva está listo para ser fotografiado. </li><li> Image el canal / cubreobjetos en un microscopio invertido. Si las imágenes en un microscopio vertical, sólo tiene que invertir el canal / cubreobjetos. </li></ol></li></ol> 4. Medir característica de interés en la grabación del Comportamiento <ol><li> Para una estructura de interés (por ejemplo, cola, CNS), mida una característica de interés (por ejemplo,, La intensidad de fluorescencia, la ubicación) con el tiempo. NOTA: Estructuras tales como la cabeza y la cola se pueden anotar manualmente. Por ejemplo, la cabeza puede ser identificado como que contiene ganchos de la boca en forma de H oscuros, y la cola puede ser identificado como que contiene spiricles traqueal posterior. Este documento se centra en el cordón nervioso. Utilice la línea de GAL4 neuronal elav-GAL4 para conducir un transgén UAS-MYR-GFP (elav&gt; GFP) 9,10 para etiquetar de manera fluorescente del sistema nervioso central (SNC). El SNC contiene dos lóbulos del cerebro anterior conectado al cable de nervio, que se extiende a la parte posterior (Figura 3). </li><li> Medir la intensidad de los píxeles de la cordón nervioso (f (NC)) en cada punto de tiempo (t). A continuación se describe un método manual de anotación, pero este paso podría ser automatizado. <ol><li> En Fiji (o software similar) en el menú &quot;Analizar&quot; utilizar el &quot;conjunto Mediciones ...&quot; cuadro de diálogo para informar el valor de gris medio y SLICposición e. </li><li> Extraer manualmente una caja en el centro del cordón nervioso en el primer fotograma de la película (Figura 3). Este paso también podría automatizarse con segmentación de imágenes y algoritmos de registro. </li><li> Utilice el comando &quot;medida&quot; en el menú &quot;Analizar&quot; para informar de la intensidad media de píxeles en la región en caja de interés. Esto genera una ventana &quot;Resultados&quot;. </li><li> En el siguiente cuadro, vuelva a colocar manualmente el cuadro sin cambiar el tamaño mediante el uso de las teclas de flecha. Utilice el comando &quot;medida&quot; de nuevo. Los resultados actualizados se muestran en la &quot;Resultados&quot; de la ventana. Repita este paso para cada trama de intereses. </li><li> Guarde los &quot;Resultados&quot; utilizando la opción &#39;Guardar como ...&#39; comando desde el menú Archivo. Los resultados se pueden exportar como un archivo .xls. </li></ol></li></ol> 5. Analizar las mediciones <ol><li> Normalizar cada f (NC) valor a un valor entre 0 y 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> En la hoja de cálculo (u otro programa), abra el archivo Results.xls. Este archivo tendrá dos columnas que representan número de cuadro y la intensidad media de fluorescencia. </li><li> Hacer una nueva columna y utilice la fórmula z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) para generar un valor de fluorescencia normalizada correspondiente a cada punto de tiempo. </li></ol></li><li> Determinar el período de paso para cada paso en la grabación. NOTA: Un ciclo de zancada es la unidad de movimiento repetitivo de todo el cuerpo para adelante (y revertir) el rastreo. Por convención se inicia un delantero del paso grande (y termina) con el movimiento de avance de la cola, la cabeza, y otros órganos internos tales como el intestino o el sistema nervioso central 1. <ol><li> Inspeccionar manualmente la grabación del comportamiento y registrar los tiempos de iniciación (i) de cada paso (i (Stride Ciclo [n])). NOTA: En el siguiente ejemplo, el movimiento hacia adelantedel sistema nervioso central como se utilizó el inicio de un ciclo de paso (Figura 3). </li><li> Por cada paso que calcular el periodo: Δ t (ciclo de zancada) = i (Stride Ciclo [n + 1]) -i (Stride Ciclo [n]). </li></ol></li><li> Calcular el porcentaje de ciclo de zancada transcurrido para cada punto de la grabación del tiempo. <ol><li> Hacer una columna adicional en el archivo de hoja de cálculo que representa el tiempo transcurrido desde el inicio de un ciclo de paso (c). Tiempo establecido desde el inicio paso a cero al inicio de cada paso (c (Stride Ciclo [n]) = 0). Ajuste veces después de la iniciación en consecuencia. </li><li> Hacer una columna adicional en el archivo de hoja de cálculo que representa el ciclo ciento zancada transcurrido (ciclo de zancada%) Dividir tiempos ajustados por el período de zancada y se multiplica por 100 para convertir a porcentaje de ciclo de zancada transcurrido:. Ciclo% zancada = (c (Stride Ciclo [n] )) / (Δ t (Ciclo de zancada) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Generar coordenadas polares Parcelas para representar dinámica de las estructuras de interés durante el ciclo de rastreo <ol><li> En MATLAB, utilice el diálogo &quot;Importar datos&quot; en la pestaña Inicio para importar el Results.xls actualizada. </li><li> Hacer una nueva matriz &quot;Theta&quot; valores del ciclo de zancada que contiene ciento (% ciclo de zancada). ( &quot;Theta = Var1&quot; donde Var1 representa ciclo de zancada%). </li><li> Hacer una nueva matriz &quot;Rho&quot; contiene los valores de fluorescencia normalizados (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot; donde Var2 representa z (t)). </li><li> Utilice el comando &#39;PolarPlot&#39; para hacer de coordenadas polares parcelas con el ciclo ciento zancada como el ángulo, y la fluorescencia como el radio ( &quot;PolarPlot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol><li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+rev%22%5BJournal%5D)">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687(1996).</li>
<li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+control+of+swimming+behavior%3A+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li>
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<li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Drosophila+motoneurons%3A+specification+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+cell+devl+bio%22%5BJournal%5D)">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li>
<li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-Skipped%28%2B%29+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li>
<li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Behav%22%5BJournal%5D)">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li>
<li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rover%2FSitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development%2C+Food-Patch+Quality%2C+and+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+%2F+MAPK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTufte%2C+ER+%22The+visual+display+of+quantitative+information%22">The visual display of quantitative information</a>. , Graphics Press. Cheshire, CT. (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un dispositivo de microfluidos se construyó para hacer canales de agarosa lineales que pueden alojar las larvas de Drosophila (Figura 1). Cuando las larvas de Drosophila se colocan en estos canales de agarosa lineales su repertorio de comportamiento se limita a rastreo, que permite la observación detallada de la dinámica de estructuras de larvas durante el ciclo de rastreo. Una grabación exitosa ocurre cuando una larva de realizar una seri...

El objetivo general de este método es el estudio de Drosophila rastreo de larvas en detalle. Los experimentos sobre la locomoción han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías sobre el control del motor 2. Tradicionalmente se ha estudiado la locomoción de los animales acuáticos (por ejemplo, sanguijuela, lamprea, renacuajo) 3. La naturaleza repetitiva de la locomoción en estos animales ha permitido el estudio de rhythmogenesis, para el análisis de los eventos biofísicos locomoción de conducción, y para el seguimiento de los patrones de activación neural que acompañan a la locomoción. El uso de las larvas de Drosophila para los estudios de locomoción presenta una combinación única de ventajas sobre otros sistemas de modelos: genética Facile, desarrollo bien caracterizado, un cuerpo que es ópticamente claro en estadios primero y segundo, y una reconstrucción microscópico electrónico de transmisión en curso de la entera 4-6 sistema nervioso. Sin embargo, Drosophila larval locoel movimiento en superficies planas abiertas es algo complejo que incluye pausas, giros y meandros arrastra 7. Esta publicación presenta un método para utilizar canales de agarosa lineales para guiar el comportamiento locomotor Drosophila larvas de tal manera que las larvas Realizar sostenida, el comportamiento de rastreo rítmica recta. El estudio de comportamiento de las larvas de Drosophila en los canales de agarosa, en lugar de comportamiento en superficies planas abiertas, tiene varias ventajas. En primer lugar, permite a los investigadores para seleccionar específicamente el comportamiento de rastreo de los muchos movimientos que forman parte del repertorio del comportamiento de las larvas. En segundo lugar, mediante el ajuste de la anchura del canal en comparación con el tamaño del cuerpo de las larvas, la velocidad de rastreo se puede ajustar. En tercer lugar, los canales permiten la larva a ser vista desde dorsal, ventral, o en el lado lateral en función de cómo se carga el larva y orientada dentro del canal. Esta versatilidad en la orientación de las larvas permite que cualquier estructura de interés que estar continuamente visibles durante el rastreo. Cuarto,canales son susceptibles para su uso con una amplia variedad de microscopios y objetivos. Por ejemplo, los canales lineales pueden ser utilizados para formación de imágenes de baja resolución en estereoscopios de campo brillante y / o de imágenes de alta resolución en la hilatura de discos microscopios confocales 1. En quinto lugar, este método se puede utilizar en combinación con manipulaciones neuronales optogenética / thermogenetic en cualquier fondo genético. Por último, debido a que tanto el cuerpo de las larvas (en estadios primera y segunda) y los canales de agarosa son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar en el estudio de los movimientos dinámicos, o cambios en la intensidad de fluorescencia de las estructuras de larvas etiquetados por sondas fluorescentes codificadas genéticamente. El método descrito es apropiado para estudios detallados de cinemáticas primera y segunda instar Drosophila comportamiento de las larvas. Esta publicación analiza los cambios dinámicos en la intensidad fluorescente de la CNS durante el rastreo larval hacia adelante para demostrar el uso de los canales y como un precursor de neuRonal imágenes de calcio.

<table><tbody><tr><td>Botella cuadrada de Drosophila de 6 oz</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>jugo</td><td></td><td></td><td>de manzana no concentrado</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>metil-p-hidroxibenzoato</td></tr><tr><td>35 x 10 mm placa de Petri redonda</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>levadura</td><td></td><td></td><td></td>de panadería</tr><tr><td>molde de fundición PDMS</td><td>FlowJem</td><td></td><td>se puede solicitar a los autores</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>toallitas de laboratorio</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>aire enlatado</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 10 cm</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr> hoja <tr><td>de afeitar</td><td>pinza Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>FST</td><td></td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cubreobjetos, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (versión 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; drosophila</em&gt; comportamiento de las larvas de arrastre

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila rastreo de las larvas se está convirtiendo en un poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta sensoriomotriz. Sin embargo, el comportamiento de rastreo de larvas en las superficies planas abiertas es complejo, incluyendo: hacer una pausa, girando, y meandros. Esta complejidad en el repertorio de movimiento dificulta el análisis detallado de los acontecimientos que ocurren durante un solo ciclo de rastreo zancada. Para superar este obstáculo, se hicieron canales de agarosa lineales que limitan el comportamiento de las larvas al sostenida, arrastre de la recta, rítmica. En principio, porque los canales de agarosa y el cuerpo de la larva de Drosophila son tanto ópticamente transparente, el movimiento de las estructuras de larvas marcadas por las sondas fluorescentes codificadas genéticamente se puede controlar en, las larvas se mueven libremente intacta. En el pasado, las larvas se colocaron en canales lineales y arrastrándose a nivel de todo el organismo, segmento, y el músculo se analizaron 1. En el futuro, las larvas que se arrastra en los canales se puede utilizar para imágenes de calcio para controlar neurola actividad final. Además, estos métodos se pueden utilizar con larvas de cualquier genotipo y con cualquier canal investigador-diseñado. Así, el protocolo se presenta a continuación es ampliamente aplicable para los estudios que utilizan la larva de Drosophila como un modelo para comprender el control motor.

Este artículo describe un método para guiar el comportamiento de las larvas de Drosophila utilizando canales de agarosa y para medir la dinámica de estructuras de larvas en un ciclo de rastreo. Las larvas en los canales lineales realizar combates sostenidos de rastreo rítmica (Figura 3). Debido a que tanto las larvas y los canales son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar con larvas expresar sondas fluorescentes expresados ​​en cualquier estructura d...

La larva de Drosophila es un sistema poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta. Esta publicación describe el uso de canales lineales de agarosa para provocar combates sostenidos de rastreo y métodos lineales para cuantificar la dinámica de las estructuras de larvas durante el rastreo comportamiento repetitivo.

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamiento de las larvas de arrastre

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

El objetivo general de este procedimiento es observar larvas de Drosophila en etapa larval desplazándose en un canal lineal de agarosa para estudiar el desarrollo de circuitos neuronales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neuroetología y la biología del desarrollo, como comprender los códigos neuronales que generan patrones motores e identificar los procesos genéticos y celulares clave que delimitan los circuitos neuronales para el control del movimiento. La principal ventaja de esta técnica es que restringe el repertorio de comportamiento larval, de modo que los investigadores pueden estudiar un solo patrón múltiple en detalle.La persona que demostrará el procedimiento será Zarion Marshall, un técnico de mi laboratorio. Primero, es importante evaluar la salud de la larva. De tres a cuatro días antes de la grabación, reemplace la placa de recolección de la jaula de adultos.Proceda a hacer esto diariamente y a la misma hora del día. Cuente los huevos y las larvas recién eclosionadas en la placa. El número esperado de huevos está entre 500 y 2.000.Ajuste el número de adultos en la jaula según sea necesario. Examinamos la placa 24 horas después para determinar si las larvas están sanas. La mayoría de los huevos deberían haber eclosionado en larvas, y las larvas deberían haberse desplazado hacia la pasta de levadura.Los signos de mala salud incluyen un gran número de huevos no eclosionados, cuerpos larvales muertos alejados de la pasta de levadura y larvas con manchas inusualmente oscuras en el abdomen, lo cual indica una reacción inmunitaria. Si las larvas parecen estar en mal estado, cambie la jaula utilizando placas recién preparadas y verifique el genotipo de los adultos. Para el experimento, recolecte larvas de segundo estadio recién eclosionadas de placas de uno a dos días de antigüedad.Todas estas etapas pueden utilizarse en el análisis. Para este protocolo, tenga un molde de fundición de PDMS con canal lineal. Limpie el molde de fundición con alcohol isopropílico.Una vez que esté seco, coloque el molde en una tapa de diez centímetros o un recipiente similar. Luego, llene el molde con agarosa al tres por ciento enfriada a 55 grados Celsius. Vierta la agarosa con cuidado para evitar atrapar burbujas de aire en el molde.El molde debe quedar apenas cubierto por el agarosa. Una vez solidificado, retire los canales de agarosa del molde. Recorte los bordes de los canales con forma de disco y luego sumerja los canales en agua.Se pueden almacenar en agua a cuatro grados Celsius durante hasta siete días. Antes de usar los canales, déjelos calentar a temperatura ambiente. Seleccione un canal que coincida con el ancho de la larva.Los canales tienen un ancho que varía de 100 a 300 micrómetros y todos tienen una profundidad de 150 micrómetros. Luego, utilice una cuchilla limpia para cortar un solo canal del disco preparado. Con pinzas, transfiera el canal a una laminilla de vidrio o portaobjetos de tamaño adecuado, colocándolo con la cara ranurada hacia arriba.A continuación, use pinzas finas para tomar suavemente una larva sin ejercer presión sobre ella. También puede utilizarse un pincel de punta fina. Si se ejerce presión, reflejos de dolor como enrollarse o encorvarse pueden dominar el comportamiento de la larva en el canal.Ahora lave la larva sumergiéndola brevemente en agua y luego colóquela en el canal cortado, manipulándola suavemente para colocarla en posición. Una vez dentro del canal, ajuste la orientación de la larva para facilitar la obtención de imágenes de la estructura de interés. A continuación, coloque una o dos gotas de agua en cada extremo del canal para llenarlo de agua.Si quedan atrapadas burbujas de aire, levante suavemente los lados del canal para eliminarlas. Para ajustar aún más la orientación de la larva, empuje suavemente el canal para hacer rodar la larva. Ahora la larva está lista para ser observada mediante imágenes.Las larvas en canales lineales realizan episodios sostenidos de locomoción rítmica. Es fácil examinar las sondas fluorescentes. Por ejemplo, las larvas que expresan GFP en sus neuronas mediante el conductor GAL4 muestran cambios dinámicos en las intensidades fluorescentes provenientes de la cuerda nerviosa durante el ciclo de desplazamiento.El SNC se mueve hacia adelante casi al mismo tiempo que la cabeza y la cola larval, a medida que una onda de contracción muscular avanza a lo largo del eje corporal; el SNC entra y sale del plano de enfoque, lo que provoca cambios en la fluorescencia de la cuerda nerviosa. Los cambios en la fluorescencia se cuantificaron a partir de tres zancadas de locomoción de tres larvas. La dinámica de la fluorescencia de la cuerda nerviosa durante el ciclo de la zancada siguió un patrón reproducible que podría utilizarse para la fenotipificación.Después de ver este video, debería tener una comprensión de cómo recolectar larvas para observar su comportamiento, preparar canales de agarosa y cargar las larvas en los canales para visualizar su comportamiento de arrastre lineal. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las larvas con cuidado.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Hemos desarrollado un sistema de seguimiento de vídeo de tasa microscopio que puede registrar y...

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

Este video describe cómo rastrear moscas que caminan libremente para evaluar su capacidad general de locomoción. El protocolo presentado demuestra la configuración del ensayo y el análisis de datos mediante software de seguimiento de vídeo.

Seguimiento de moscas que caminan libremente: un método para evaluar la locomoción en Drosophila

Este video muestra un estudio del comportamiento de navegación de las larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de las neuronas sensoriales olfativas (ORNs). Las larvas transgénicas de Drosophila que expresan canales iónicos sensibles a la luz en los ORN se colocan en agarosa dentro de un campo de comportamiento. La estimulación optogenética con luz abre los canales, provocando una afluencia de cationes que desencadena la transmisión de la señal al cerebro, y se registra...

Comportamiento de navegación de larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de neuronas sensoriales olfativas

El circuito de alimentación en larvas de Drosophila melanogaster sirve un modelo simple pero potente que permite a los cambios en la tasa de alimentación que se correlacionan con las alteraciones en los circuitos neurales stomatogastric. Este circuito se compone de las neuronas serotoninérgicas centrales que envían proyecciones a los ganchos de la boca así como el intestino anterior.

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila</i

Aquí se describe una técnica de microscopía simple y ampliamente accesibles para la adquisición de vídeo digital de alta calidad de Drosophila adulta y fenotipos mutantes larvas desde una perspectiva lateral.

Adquisición de vídeo de alta calidad digital de Drosophila Comportamientos larvas y adultos desde una perspectiva lateral

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de longitud de trayectoria de forrajeo de Drosophila melanogaster. Discutimos la preparación y el manejo de los animales de prueba, cómo realizar el ensayo y analizar los datos.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

Este protocolo introduce un ensayo de punto ligero para investigar el comportamiento fototáctico larvario de Drosophila. En este ensayo, se genera un punto de luz como estimulación de la luz, y el proceso de evitación de la luz larval es registrado por un sistema de imágenes basado en luz infrarroja.

Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

Aprende a observar el comportamiento de arrastre en larvas de Drosophila utilizando canales lineales de agarosa. Este método permite estudiar en detalle los circuitos neuronales que controlan los patrones motores en neuroetología.

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar

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