Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar un recipiente de cultivo continuo, en el que la respuesta a la iluminación de los microbios optogenéticos se pueda medir con un microscopio automáticamente en tiempo real y durante varios días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular e ingeniería metabólica, como cómo la expresión génica dinámica puede provocar respuestas que difieren de la expresión génica estática. La principal ventaja de este método es que el cultivo continuo permite recoger mediciones durante varios días.

Para comenzar, suelde la línea de tierra, la línea de datos y la línea de voltaje positivo del termómetro digital a la placa de circuito impreso. Recorte un pin de un cabezal hembra de tres pines y recorte los dos pines restantes. Suelde esto en el par de orificios etiquetados como R2 y conecte los dos pines soldados insertando una resistencia de 4,7 kilogramos de ohmios en el cabezal del pin.

A continuación, conecte los componentes restantes a la placa de circuito. Superponga la placa de circuito al microcontrolador. Configure el gabinete a prueba de luz e instale todo el software como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Primero, coloque el extremo largo del puerto de aluminio a través de la junta en el recipiente de cultivo y atornille la tapa. Cubra una salida de puerto de aluminio corta con un tubo de silicona de diámetro medio. Conecte el extremo de destilación insertando un bloqueo Luer hembra y luego conectando un enchufe de bloqueo Luer macho.

Este tomacorriente es complementario y no se utilizará. Conecte dos segmentos cortos de tubo de silicona de diámetro medio con cerraduras Luer macho y hembra. Luego conecte un extremo a un tomacorriente de puerto de aluminio corto y conecte el extremo de destilación.

El vaso será inoculado a través de este tubo. A continuación, conecte dos tubos medianos a los extremos del tubo peristáltico de diámetro medio y los conectores. Conecte un extremo a un puerto corto de aluminio y conecte el otro.

Posteriormente, se conectará al matraz de medios. Conecte un tubo de silicona de diámetro medio al puerto de aluminio más largo. El tubo debe ser lo suficientemente largo como para alcanzar el matraz de medios.

Conecte otro segmento corto de unas pocas pulgadas de largo hasta el extremo y luego insértelo en el tapón de goma en el matraz de medios. Sujete el tubo. Cuando se desengancha más tarde, esta conexión permite que el cultivo se mezcle, se airee y se mantenga a una presión positiva por las burbujas entrantes.

Inserte un tubo de diámetro medio lo suficientemente largo como para llegar al fondo del matraz en el tapón a través del cual se transferirá el medio. Conecte otro tubo de diámetro mediano a este, y luego un tubo de diámetro ancho en el extremo. Tapona el extremo de destilación.

Llene el tercer orificio en el tapón con un segmento corto de tubería de diámetro mediano, conectado a otros dos segmentos de tubería de diámetro mediano y taponado en el extremo de destilación. Este se conectará a una bomba de vacío y, más tarde, a una bomba de acuario. Inserte un bloqueo Luer macho en un segmento de tubo de silicona de diámetro estrecho y luego inserte firmemente el tubo de PTFE.

A continuación, fije una cerradura luer hembra a un tubo de diámetro medio. Enrosque la cerradura hembra a lo largo del tubo de PTFE para conectar las cerraduras y la otra a un puerto corto de aluminio. Asegúrese de que el tubo de PTFE dentro del recipiente de cultivo cuelgue por debajo del segundo tubo de aluminio más largo y por encima del fondo.

Recorte según sea necesario. Los medios se muestrearán desde aquí hasta el canal de imágenes, y el tubo estrecho minimiza el volumen intermedio. A continuación, conecte el tubo de silicona estrecho expuesto al tubo peristáltico estrecho y a los conectores.

A esto se conectan tres segmentos de tubería de diámetro estrecho y dos segmentos de tubería de PTFE, alternándolos. Conéctelo al matraz de efluente, a través de una tubería de diámetro medio. Luego conecte un extremo de un tubo de silicona de diámetro medio al segundo tubo más largo del puerto de aluminio en el otro extremo del matraz de efluentes.

Este tubo de aluminio establece el volumen de cultivo y el exceso de cultivo se desborda en el contenedor de efluentes. Envuelva las tapas del matraz con papel de aluminio y luego autoclave el ensamblaje durante 30 minutos a 121 grados Celsius y 15 PSI. Conecte el filtro de vacío a una botella de 100 mililitros.

Retire la tapa de la tetina y luego retire el tapón blanco de la boquilla del filtro de vacío con pinzas estériles. Conecte el tubo ancho de silicona a la tetina, el otro tubo libre del matraz de medios a una bomba de vacío, y asegúrese de que el tercer tubo que conecta el matraz de medios al recipiente de cultivo esté cerrado. Llene el filtro con medios, encienda la bomba de vacío y, a continuación, filtre el resto de los medios.

Sujete el tubo de silicona medio conectado a la aspiradora y apague la bomba de vacío. Retire los luers del segmento intermedio del tubo de silicona medio conectado a la bomba de vacío e inserte el extremo azul de un filtro de aire de jeringa estéril en este tubo. A continuación, sujete el tubo de silicona ancho y desconecte el luer macho de él.

Desconecte el tapón del luer hembra del tubo de entrada de medios del recipiente de cultivo. Conecte estos luers para permitir que los medios se bombeen al recipiente de cultivo. Luego, retire el filtro de la botella de 100 mililitros y coloque la tapa de la botella.

Utilice este medio para preparar un cultivo iniciador. Coloque el conjunto de cultivo continuo cerca de un microscopio con el matraz de medios más alto que el recipiente de cultivo y el matraz de efluente más bajo que el recipiente de cultivo para evitar el reflujo. Tape firmemente los tapones de goma en los medios y matraces de efluentes.

A continuación, desconecte los extremos del tubo de PTFE del tubo de silicona estrecho que los conecta y conecte estos extremos a la entrada y salida de un dispositivo microfluídico preparado. A continuación, empuje los medios en el recipiente de cultivo, conectando el extremo blanco del filtro de aire de la jeringa a la bomba del acuario. Cuando el medio alcanza el nivel del puerto de efluente, envuelva el tubo de entrada del medio y los conectores alrededor de la bomba peristáltica lenta, y el tubo de salida de muestra estrecho y los conectores alrededor de la bomba peristáltica rápida.

Airee el medio soltando el tubo de aire entre el matraz y el recipiente de cultivo. Luego, pegue con cinta adhesiva la almohadilla térmica y el termómetro al recipiente de cultivo para que se pueda controlar su temperatura. Enrolle el tubo del medio alrededor del recipiente de cultivo, de modo que el medio de entrada esté a la misma temperatura que el recipiente.

A continuación, inserte el recipiente de cultivo en la carcasa de espuma negra sobre la matriz LED y asegúrese de que los tubos no estén apretados. Utilice el complemento del controlador del biorreactor para configurar la bomba de medios lentos durante una décima parte de cada intervalo de 30 segundos. El caudal será muy bajo, pero mayor que la tasa de evaporación.

Sujete el tubo de aire entrante entre el matraz de medios y el recipiente de cultivo. Utilice una pipeta para inocular el recipiente de cultivo con un mililitro de un cultivo iniciador. A continuación, sujete el extremo de destilación de este tubo y suelte el tubo de aire.

Deja que la cultura crezca de la noche a la mañana. Cubra la carcasa para que no entre luz. Al día siguiente, utilice el complemento del controlador del biorreactor para configurar las bombas peristálticas para que giren durante una mayor proporción de tiempo, lo que corresponde a los medios deseados y a los caudales de muestreo.

Deje que la densidad de cultivo se equilibre durante la noche. Al día siguiente, rellene la lista de posiciones de la etapa y el micro administrador con un conjunto de posiciones no superpuestas donde las células bombeadas al canal microfluídico estarán en el plano focal. A continuación, abra el plugin del controlador del biorreactor.

Seleccione el curso de tiempo de la matriz LED deseado, los canales de imagen y otras configuraciones experimentales de las indicaciones y, a continuación, comience a recopilar datos. Este aparato se utilizó para estimular un cultivo de saccharomyces cerevisiae, que expresa proteína fluorescente amarilla en respuesta a la luz azul a través de un sistema de transcripción optogenética inducible. Se adquirieron contraste de base e imágenes fluorescentes del canal microfluídico.

Los contornos celulares se identificaron a partir de las imágenes de contraste de fase, se mapearon a las imágenes fluorescentes, y las imágenes fluorescentes se registraron en tiempo real. El mapa de calor aquí muestra la distribución de fluorescencia de un cultivo debido a la producción de proteína fluorescente amarilla tras la activación del sistema optogenético. Se analizó la fluorescencia de aproximadamente 170.000 células a partir de más de 30.000 imágenes, adquiridas de 28 posiciones de etapa durante 70 horas.

Durante este estudio, el cultivo fue expuesto a diferentes intensidades de luz azul durante intervalos de seis horas, seguidas de seis horas de oscuridad total. Las células habían estado expuestas a la luz antes de la primera medición, por lo que su intensidad de fluorescencia está disminuyendo durante el primer período de oscuridad. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho horas, en el transcurso de tres días, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es muy importante utilizar una técnica estéril. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el control de retroalimentación en tiempo real, para controlar la concentración de proteínas. Esta técnica permitirá estudiar dinámicamente organismos con constructos optogenéticos, durante períodos de tiempo más largos, más de lo que es posible mediante el cultivo en placas o por lotes.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo integrar un aparato de cultivo continuo, una luz y un microscopio para estimular y estudiar los microbios optogenéticos.