Name: Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a diseñar un sistema automatizado de iluminación y cultivo continuo para estudiar respuestas ópticas en microorganismos. Este método permite medir la expresión génica dinámica en tiempo real durante varios días.

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Nos gustaría reconocer Molly Lazar y Verónica Delgado para la asistencia en la prueba del protocolo, Kieran Sweeney útil para los debates y la edición, y Taylor Scott, My An-adirekkun, y Stephanie Geller para la lectura crítica del manuscrito. Megan Nicole McClean, Ph.D. posee una concesión de carrera en la interfaz de la Ciencia del Fondo Burroughs Wellcome.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
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<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
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<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
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<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
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<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
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<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos diseñado este aparato pensando en la flexibilidad. Todo el código utilizado es libre y de código abierto. El proceso de análisis de imagen por defecto en las células del segmento es simple y funciona rápidamente. Análisis personalizado podría ser implementado mediante el registro de entrada del usuario, mientras que el análisis de una imagen representativa con la interfaz gráfica de usuario FIJI, la conversión de la entrada a un guión beanshell y después configurar el plugin para llamar al script. Cuando se le lla...

Sistemas Optogenética utilizan la luz para controlar una lista creciente de procesos celulares que incluyen la expresión génica, 1, 2, 3, 4, 5 la localización de proteínas, actividad de la proteína 6, 6, 7, 8 la proteína de unión, 8, 9, 10 y degradación de proteínas. 11 Un método para el cultivo de células en un entorno controlado con la estimulación óptica programada y para medir su respuesta en escalas de tiempo biológicamente relevantes es necesario para explotar el potencial de estas herramientas para la investigación en biología celular y biotecnología. Nuestro método se aprovecha de chemostasis para mantener una tasa de crecimiento constante de celda en un bien mezclada, aeclasificar y recipiente de cultivo de vidrio de temperatura controlada 12, 13 que está expuesto a la iluminación programado. Nosotros imagen células individuales en el efluente de cultivo con un microscopio invertido para medir la respuesta de la cultura a la iluminación programado. El cultivo, toma de muestras, imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas de manera que la intensidad de fluorescencia y la morfología celular del cultivo celular efluente se pueden medir a través de múltiples días sin intervención del usuario. Este protocolo se puede implementar en la mayoría de laboratorios familiarizados con creciente cultivo celular y microscopía, y el aparato utilizado es barato y está hecho de componentes fácilmente disponibles. Un recipiente de cultivo transparente se coloca por encima de una matriz de diodos emisores de luz (LED) capaces de emitir 1 mW / cm 2 -10 mW / cm 2 de la luz. Los microbios se cultivan en el recipiente de cultivo de forma continua; una bomba peristáltica se utiliza para agregar los medios de comunicación en eltasa de dilución, otro se usa para retirar de cultivo a una tasa menor para el microscopio, y la diferencia se escapa a través de una salida de rebosamiento. Una almohadilla de calefacción mantiene la temperatura. Se bombea aire continuamente en el recipiente de cultivo para mantener una presión positiva, así como para mezclar y airear el cultivo. A excepción de la bomba de aire, la energía a estos dispositivos está regulado por un microcontrolador que también recibe la entrada desde un termómetro y un ordenador de sobremesa conectado. El cultivo celular efluente se bombea a un dispositivo de microfluidos de la etapa de un microscopio invertido. No fluorescente y las imágenes fluorescentes se adquieren automáticamente. Las células en las imágenes se caracterizan por un algoritmo que localiza cada célula como una región de interés (ROI) y mide las propiedades de cada ROI. Para demostrar una aplicación de este protocolo, se midió la respuesta a diferentes intensidades de luz de células de Saccharomyces cerevisiae ingeniería con una responsa de luz azulve sistema optogenético que controla la transcripción de la proteína fluorescente. S. cerevisiae, comúnmente conocida como la levadura de panadero, se seleccionó debido a múltiples sistemas optogenética para controlar la expresión génica en este sistema ya existen 14, 15, 16. Además, este organismo modelo se utiliza comúnmente para estudios en la biología de sistemas 17 y como un chasis para aplicaciones biotecnológicas 18, 19, 20. Nuestros resultados representativos demuestran que este protocolo se puede utilizar para controlar la transcripción de un cultivo durante varios días mediante la variación de las intensidades de luz de entrada y la medición de la producción de un indicador fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Extenso manual de laboratorio</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Un extenso manual de laboratorio actualizado periódicamente está disponible en el " Archivos de Quimiostatos Optogenéticos" Repositorio de GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Esto también incluye una descripción del molde microfluídico utilizado para generar los resultados representativos.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>El software gratuito y de código abierto para ver y editar los diseños de placas de circuito tipo .fzz está disponible en "http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - ensamblado)</td><td>Microcontrolador Adafruit</td><td>50</td><td>. 1 requerido.</td></tr><tr><td>Kit de cabezales apilables Arduino</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Cabezales de pines hembra para conectar PCB al microcontrolador. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Soldador ajustable 30W 110V - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>Para realizar conexiones eléctricas a la PCB. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Soporte para soldador</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>Para realizar conexiones eléctricas a la placa de circuito impreso. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Mini carrete de soldadura - 60/40 plomo soldadura con núcleo de colofonia 0.031" de diámetro - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>Para realizar conexiones eléctricas a la PCB. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>0.1 &mu; Condensador F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Estabiliza el voltaje en PCB. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>10 &mu; Condensador F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Estabiliza el voltaje en PCB. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG Controlador de pantalla LED de matriz / dígitos - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>controlador LED. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>8 pines IC Socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 requeridos. Estos se apilarán uno encima del otro para soportar el recipiente de cultivo por encima de la matriz de LED.</td></tr><tr><td>Zócalo IC de 24 pines</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Opcional. Utilícelo para conectar de forma reversible el controlador MAXIM 7219CNG a la placa de circuito impreso.</td></tr><tr><td>Multímetro digital</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>Para la resolución de problemas electrónicos. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Cabezales de ruptura - 40 pines macho (centro largo, PTH, 0.1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Cabezales de pin macho para conectar una matriz de LED a una placa de circuito impreso. Los extremos se pueden recortar con cortadores de alambre. Se requiere 1 juego.</td></tr><tr><td>Cortacables diagonales enrasados</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>Para recortar cabezales de clavijas largas y cortar cables de alimentación. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Cables de puente hembra/hembra premium - 40 x 12" (300 mm)</td>Cinta de alambre <td>Adafruit</td><td>793</td><td>para conectar la placa de pruebas a la matriz LED. Se puede conectar de extremo a extremo con cabezales de clavija macho para que sea más largo. 1 obligatorio.</td></tr><tr><td>Placa de pruebas de tamaño medio</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>La matriz LED se conectará a ella y el recipiente de cultivo descansará sobre ella.</td></tr><tr>Fuente de luz <td>en miniatura 8x8 Blue LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>. La longitud de onda dominante es de 470 nm (azul). 1 obligatorio. Las matrices LED en miniatura alternativas del mismo proveedor están disponibles con longitudes de onda dominantes: 624 nm (rojo), 588 nm (amarillo), 525 nm (verde), 572 nm (amarillo-verde) y blanco.</td></tr><tr><td>Cabezal apilable-3 pines</td><td>Se requiere SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8.</td></tr><tr><td>Kit de resistencias - 1/4W (500 en total)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>Para electrónica. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>&nbsp; IRL520N MOSFET</td><td>International Rectificar</td><td>IRL520N</td><td>Interruptor de regulación de voltaje para controlar la corriente continua. Se requieren 4.</td></tr><tr><td>Cable de conexión - Surtido (núcleo sólido, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Cable para electrónica. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación conmutada de 5 V 2 A (2000 mA) - Listada por UL</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Fuente de alimentación para la almohadilla térmica y Arduino. Se requieren 2.</td></tr><tr><td>Adaptador de corriente de conmutación regulada de 12 VDC 1000mA - Aprobado por UL</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>Para bombas peristálticas. Se requieren 2.</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica eléctrica - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>Para calentar el biorreactor. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de caudal variable de bajo caudal</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>Para medios de bombeo. Se requiere 1</td></tr><tr><td>bomba peristáltica de caudal variable de caudal medio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Para el cultivo de bombeo. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Adaptador de alimentación conmutada regulado de 9 VDC 1000mA - Adafruit</td><td></td><td>63</td> listado <td>por UL Para fuente de alimentación de microcontrolador. Orden 1.</td></tr><tr><td>Alta temperatura Resistente al agua DS18B20 Sensor de temperatura digital + extras</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Termómetro para el biorreactor. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>El software de control de microscopio gratuito y de código abierto está disponible en "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>El software de análisis de imágenes gratuito y de código abierto está disponible en "http://fiji.sc/"</td></tr><tr><td>Arduino Integrated Development Environment</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>El IDE gratuito y de código abierto está disponible en "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>Código personalizado</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>El código de microcontrolador personalizado y el complemento "Bioreactor Controller" están disponibles en el " Archivos de Quimiostatos Optogenéticos" Repositorio de GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Cable USB A a B - 6 pies</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Se utiliza para descargar datos al microcontrolador. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>La ventaja de cargar los valores de la matriz de LED desde un archivo CSV es que el complemento puede llamar a un programa para actualizar esos valores en función de los resultados del análisis de imágenes, y esos valores se pueden volver a cargar en el microcontrolador, lo que permite el control de retroalimentación. Está disponible en el " Archivos de Quimiostatos Optogenéticos" Repositorio de GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Geles Tota-frost (papel de difusión)</td><td>B& H B</td><td>& H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>Para matriz LED. 1 requerido.</td></tr><tr><td>Hoja de kitting Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Espuma negra para el recinto de la vasija de cultivo. Se requieren 4.</td></tr><tr><td>Sensor de potencia de fotodiodo estándar, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Para medir la intensidad de la luz. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Cinta de etiquetado</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>Para etiquetar y asegurar componentes sueltos. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Consola compacta de medidor de potencia y energía, LCD digital de 4"</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Para medir la intensidad de la luz. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Botella de vidrio de hibridación GL45 de 100 ml</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Recipiente del biorreactor. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Ensamblaje de seis puertos</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Personalizado&nbsp;</td><td>Para la vasija del biorreactor. Especificaciones del tubo: .125" OD x .055" ID. Puerto A: 1.0" de largo por encima del taco de la tapa y hasta la parte inferior del tubo. Puertos B, C, E, F: 1.0" de largo por encima del taco de la tapa, 33 mm de largo por debajo. Puerto D: 1.0" de largo por encima del taco de la tapa, 65 mm&nbsp; muy por debajo. 1 obligatorio. Incluye tapón de rosca abierto de polipropileno de 45 mm de diámetro y una junta de silicona blanca para garantizar un sellado hermético entre el tapón y la embarcación.</td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 pulgadas, Pack de 3</td><td>Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>Cinta adhesiva transparente. Esto está disponible en muchos otros proveedores. Se utiliza para cubrir las marcas en el recipiente de cultivo y para asegurar el cubreobjetos con el canal PDMS al marco de soporte de aluminio.</td></tr><tr><td>1/16" de diámetro interno x 3/16" de diámetro exterior x 1/16" de pared Tygon Tubo de silicona sanitario</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Tubos. ~25' requeridos.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Tapón de goma blanca Twistit, tamaño 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Tapón de matraz de medios y tapón de matraz de efluentes. Se requieren 2.</td></tr><tr><td>Matraz de laboratorio de 2 litros</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Matraz de medios y matraz de efluentes. Se requieren 2.</td></tr><tr><td>Llave de pinza de día</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>Para pellizcar tubos cerrados. Se requieren 3.</td></tr><tr><td>Conjunto de tubería de repuesto 1/16" ID</td><td>Productos trazables</td><td>3372</td><td>Las bombas peristálticas vienen con un juego de tubos, pero se desgastan después de semanas de uso.</td></tr><tr><td>Conjunto de tubería de repuesto 1/50" ID</td><td>Productos trazables</td><td>3371</td><td>Las bombas peristálticas vienen con un juego de tubos, pero se desgastan después de semanas de uso.</td></tr><tr><td>Luer macho con anillo de bloqueo x lengüeta de manguera de 1/16", nylon, 25/pk</td><td>Conectores Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>. Se requieren ~ 10 luers.</td></tr><tr><td>Luer macho con anillo de bloqueo x lengüeta de manguera de 1/8", Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Conectores. Se requieren 5, uno para cada orificio del tapón de goma para llenar con tubo.</td></tr><tr><td>Adaptador de lengüeta de manguera luer hembra x 1/16", nylon, 25/pk</td><td>Conectores Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>. ~ 10 luers requeridos.</td></tr><tr><td>Luer hembra x Adaptador de lengüeta de manguera de 3/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Conectores. ~ 10 luers requeridos.</td></tr><tr><td>Accesorio Luer Cole-Parmer, Tapa Luer Hembra, Nylon, 25/PK</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Accesorio Luer, Tapón de Bloqueo Luer Macho, Nylon, 25/PK</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PTFE Microcalibre, 0.022" de diámetro interno x 0.042" de diámetro exterior, 100 pies/rollo</td> Tubo <td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>. Se requiere 1 rollo.</td></tr><tr><td>Tubo de silicona curado con platino Masterflex, L/S 13,</td> tubo <td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td> de 25 <td>pies. ~25' requerido.</td></tr><tr><td>3/16" de diámetro interno x 1/4" de diámetro exterior x 1/32" de pared Tygon Tubo de silicona sanitario</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Tubos. ~1' requerido.</td></tr><tr><td>Filtro de vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>Filtro de vacío Nalgene para medios filtrantes estériles.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Bomba de aire de flujo ajustable de doble diafragma para airear y mezclar medios. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>0.2 &mu; m filtro de jeringa para poros</td><td>Corning International 431229</td><td></td><td>Esto asegura que el aire de la bomba del acuario no contamine el aparato. 1 requerido.</td></tr><tr><td>Slygard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>Para dispositivo microfluídico. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar de seguridad americana GEM Scientific Hojas de afeitar de un solo filo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>Para cortar tubos y PDMS. Se requiere 1 hoja.</td></tr><tr><td>Perforadora Harris Uni-Core 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>Para perforar entradas/salidas en dispositivos microfluídicos. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos para microscopio 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Para dispositivo microfluídico. Se requiere 1.</td></tr><tr><td>Marco rectangular de aluminio con ventana cuadrada</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td>Para soportar el canal microfluídico. Dimensiones exteriores: 3 pulgadas x 1,25 pulgadas. Dimensiones interiores (parte recortada): 7/8 pulgadas x 7/8 pulgadas Grosor: ~1/32 pulgadas</td></tr></tbody></table>

diseño e implementación de un sistema automatizado de iluminador, cultivo y sistema de muestreo para aplicaciones microbiana optogenética

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

optogenética sistemas utilizan proteínas codificadas genéticamente que cambian la conformación en respuesta a longitudes de onda específicas de luz para alterar los procesos celulares. Hay una necesidad para el cultivo y la medición de los sistemas que incorporan programados iluminación y la estimulación de los sistemas de optogenética. Se presenta un protocolo para la construcción y el uso de un aparato de cultivo continuo para iluminar las células microbianas con las dosis programadas de la luz, y automáticamente adquirir y analizar imágenes de las células en el efluente. El funcionamiento de este aparato como un quimiostato permite que la tasa de crecimiento y el medio ambiente celular para ser estrechamente controlados. El efluente del cultivo celular continua se muestrea regularmente y las células se imágenes de microscopía de múltiples canales. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas de la intensidad de la fluorescencia y la morfología celular de células de la muestra del efluente de la cultura se miden a través de múltiples díassin intervención del usuario. Se demuestra la utilidad de este aparato de cultivo mediante la inducción de la producción de proteínas de forma dinámica en una cepa de Saccharomyces cerevisiae con un sistema de ingeniería optogenético que activa la transcripción.

Este aparato se utiliza para estimular un cultivo de S. cerevisiae que expresa la proteína fluorescente amarilla (YFP) en respuesta a la luz azul a través de un sistema de transcripción optogenético inducible basado en el par de proteínas CRY2 / CIB1 30. Las células fueron cultivadas en medios limitados chemostatically-fosfato con una tasa de dilución media de 0,2 ± 0,008. Limitación de fosfato se utiliza comúnmente en experimentos de S. cerevisiae</e...

Se diseñó un aparato de cultivo continuo para uso con sistemas de optogenética para iluminar cultivos de microbios y periódicamente celdas de imagen en el efluente con un microscopio invertido. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas a la iluminación pueden ser medidos durante varios días.

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar un recipiente de cultivo continuo, en el que la respuesta a la iluminación de los microbios optogenéticos se pueda medir con un microscopio automáticamente en tiempo real y durante varios días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular e ingeniería metabólica, como cómo la expresión génica dinámica puede provocar respuestas que difieren de la expresión génica estática. La principal ventaja de este método es que el cultivo continuo permite recoger mediciones durante varios días.Para comenzar, suelde la línea de tierra, la línea de datos y la línea de voltaje positivo del termómetro digital a la placa de circuito impreso. Recorte un pin de un cabezal hembra de tres pines y recorte los dos pines restantes. Suelde esto en el par de orificios etiquetados como R2 y conecte los dos pines soldados insertando una resistencia de 4,7 kilogramos de ohmios en el cabezal del pin.A continuación, conecte los componentes restantes a la placa de circuito. Superponga la placa de circuito al microcontrolador. Configure el gabinete a prueba de luz e instale todo el software como se describe en el protocolo de texto ad

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optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

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Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

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