Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones In Situ Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas
10 de diciembre de 2016
A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.
El objetivo general de este experimento es visualizar y cuantificar las interacciones de las mitocondrias del retículo endoplásmico utilizando un ensayo de ligadura de proximidad in situ en células fijas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico para analizar mejor las interacciones de las mitocondrias del RE en células fijas utilizando una técnica de inmunofluorescencia simple. Esperemos que sugiera nuevas estrategias de tratamiento. La principal ventaja de esta técnica es que podemos visualizar y cuantificar las interacciones de las mitocondrias del RE en células fijas y esta técnica se puede aplicar a las biopsias de tejido incluido en parafina de los pacientes. Utilizando el ensayo de ligadura de proximidad in situ demostrado en este vídeo, un anticuerpo primario de ratón dirigido contra VDAC1 en la membrana mitocondrial externa y un anticuerpo primario de conejo dirigido contra IP3R1 en la membrana del retículo endoplásmico se combinan con sus epítopos en proximidad en la interfaz de membrana mitocondrial asociada. Se agregan sondas de ligadura de proximidad que tienen colas en los extremos del ADN unidas y que se dirigen contra la IgG de ratón y conejo y pueden formar plantillas para la ligadura de oligonucleótidos conectores y se pueden amplificar y visualizar utilizando oligonucleótidos rojos de Texas. Esto solo puede ocurrir si las dos proteínas objetivo están a una distancia inferior a 40 nanómetros. De acuerdo con la distancia entre ambas membranas orgánulas, en la interfase mitocondrial asociada a la membrana. Para fijar y bloquear las células para el ensayo de ligadura de proximidad in situ, coloque las células H7 humanas en placas de 150.000 células por plato de fondo de vidrio no codificado de 35 mm. Al día siguiente, retire el medio de cultivo y use 1 mL de PBS para lavar las células. A continuación, aspire el tampón y añada 1 ml de formaldehído al diez por ciento. Incubar las placas a temperatura ambiente con agitación durante 10 minutos para fijar las células. Para detener la reacción, agregue 1 mL de glicina 1 M y mezcle las placas por rotación. Retire la solución de glicina y agregue 1 mL de 1XPBS. A continuación, agite brevemente las placas y aspire el tampón. A continuación, agregue 1 mL de 100 mM de glicina a las células. Incubar las placas a temperatura ambiente con agitación durante 15 minutos. Después de aspirar la solución, permeabilice las células añadiendo 1 mL de 0,1%triton-X100 en PBS. Y repetir la incubación. Aspire el detergente y agregue 1 mL de PBS para lavar las celdas. Después de retirar el tampón, agregue 40 microlitros de solución de bloqueo a cada placa de células e incube las muestras en una cámara húmeda a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, golpee la solución de bloqueo de los platos, tratando de obtener volúmenes residuales iguales de tampón para cada portaobjetos sin permitir que los portaobjetos se sequen. Para llevar a cabo el ensayo de ligadura de proximidad, utilice PBS para diluir los anticuerpos primarios. Vortex y agregue la solución a los platos. Incubar las muestras a las 4
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Resumen
Este artículo presenta un procedimiento para visualizar y cuantificar las interacciones entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células fijadas con alta sensibilidad. El método utiliza un ensayo de ligación in situ optimizado para dirigirse a complejos proteicos específicos en la interfaz de la membrana asociada a mitocondrias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Bioquímica
Antecedentes
- El retículo endoplásmico y las mitocondrias desempeñan funciones cruciales en el metabolismo celular.
- Comprender sus interacciones es esencial para elucidar las funciones celulares.
- Los ensayos de ligación por proximidad proporcionan un método sensible para estudiar las interacciones proteicas.
- Este estudio se centra en un complejo proteico específico implicado en estas interacciones.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para visualizar las interacciones entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias.
- Cuantificar estas interacciones con alta sensibilidad.
- Mejorar la comprensión del metabolismo celular y la señalización.
Métodos Utilizados
- Ensayo de ligación de proximidad in situ
- Dirigimiento al receptor de inositol 1,4,5-trifosfato
- Participación de la proteína regulada por glucosa 75
- Análisis del complejo del canal aniónico dependiente de voltaje y ciclofilina D
Resultados Principales
- Visualización exitosa de las interacciones entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias.
- Cuantificación de complejos proteicos en la interfaz de la membrana.
- Demuestran alta sensibilidad en la detección de interacciones.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado permite el estudio detallado de las interacciones celulares.
- Los conocimientos obtenidos pueden contribuir a la comprensión de los procesos metabólicos.
- Este método puede aplicarse a diversas áreas de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de las interacciones endógenas entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias es fundamental para reducir los riesgos de las hipótesis iniciales relacionadas con la señalización celular y la regulación metabólica. El ensayo de ligación de proximidad in situ permite la detección sensible y multiplexada de los sitios de contacto entre orgánulos sin sobreexpresión proteica, lo que fortalece la confianza predictiva en sistemas relevantes para la enfermedad. Esta capacidad refuerza las decisiones estratégicas en la intersección entre la validación de dianas y el análisis mecanicista de vías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa y la cuantificación de los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias a nivel molecular.
- Apoya la desvinculación mecanicista al confirmar la proximidad de proteínas endógenas en células fijadas y biopsias de tejidos.
- Facilita la validación funcional de dianas para vías que implican la señalización del calcio y la comunicación entre orgánulos.
- Mejora la confianza predictiva para el avance de dianas implicadas en trastornos metabólicos y de señalización.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para cuantificar interacciones proteína-proteína con resolución suborganular.
- Permite pruebas en múltiples condiciones para evaluar el impacto de compuestos o perturbaciones genéticas en los contactos entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias.
- Genera resultados cuantitativos adecuados para análisis comparativos entre diferentes brazos experimentales.
- Facilita la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para iniciativas más amplias de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al permitir el análisis en biopsias de tejido derivadas de pacientes.
- Mantiene la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de objetivos de interacción de orgánulos.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar evidencia mecanicista del compromiso de la vía.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este ensayo de ligación por proximidad in situ conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica al permitir la cuantificación robusta de las interacciones entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células y tejidos fijados.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en los mecanismos de comunicación entre orgánulos.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para campañas de selección de compuestos o genéticas.
- Análisis: Permite la detección sensible de la proximidad entre proteínas inferior a 40 nm, posibilitando la comparación estadística de las frecuencias de interacción.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la validación mecanicista en muestras relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para diversos estudios de interacción proteica en múltiples programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Estandariza la detección de interacciones proteicas endógenas con alta sensibilidad y especificidad.
- Valor estratégico: Permite tomar mejores decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos mecanicistas sólidos desde las primeras etapas del proceso.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas con perfiles de interacción organular validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunofluorescencia y protocolos de ensayo de ligación por proximidad.
- Necesita acceso a anticuerpos de alta calidad e infraestructura de imagen de fluorescencia.
- Exige estandarización entre equipos para una cuantificación reproducible entre estudios.
- Adaptable tanto a líneas celulares como a biopsias de tejido embebido en parafina, con relevancia traslacional.
- Limitado a muestras fijadas; no adecuado para estudios de interacciones dinámicas en células vivas.
