Name: Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas en neuronas corticales excitadoras de forma rápida y controlada. Este método permite medir la actividad de redes neuronales en matrices de micro-electrodos para estudiar trastornos neurológicos.

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Los autores agradecen a Jessica Classen por realizar los experimentos de fijación de parches de células completas. Las hiPSCs utilizadas en nuestros experimentos fueron amablemente proporcionadas por Huiqing Zhou y Willem van den Akker de la Universidad Radboud de Nimega. Los vectores de transferencia utilizados en este protocolo fueron amablemente proporcionados por Oliver Brüstle, Philipp Koch y Julia Ladewig del Centro Médico de la Universidad de Bonn.

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<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
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<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
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<li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181(2016).</li>
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<li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li>
<li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocomputing%22%5BJournal%5D)">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li>
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<li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li>
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<li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays%3A+an+innovative+in+vitro+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí hemos puesto en marcha un protocolo de hiPSC-diferenciación eficiente publicado por Zhang et al. (2013) 12 para medir la actividad de la red de redes neuronales derivadas de hiPSC en los AMA. Hemos adaptado el protocolo original mediante la creación de una línea hiPSC -positivo rtTA / Ngn2 antes de inducir la diferenciación neuronal. Este paso adicional que nos permite controlar la densidad de las células neuronales en el MEA. El control de la densidad neuronal fue un importante requisito previo para adaptar el protocolo de los AMA y para garantizar la coherencia. Para medir la actividad de las redes neuronales utilizando los AMA, las neuronas necesitan para formar redes densas directamente en la parte superior de los electrodos MEA 17,18. Esto necesariamente requiere un estricto control sobre la densidad de placas de las neuronas. La línea de hiPSC -positivo rtTA / Ngn2 permite el control de la densidad de las neuronas debido a esta táctica no depende de transducción lentiviral agudos de hiPSCs antes de la diferenciación;la línea hiPSC -positivo rtTA / Ngn2 por lo tanto casi elimina cualquier variación en el rendimiento final debido a, por ejemplo, la toxicidad y la eficacia lentiviral infección variable. Otro paso crítico del procedimiento experimental es el número de los astrocitos de rata que se cocultivaron con las hiPSCs diferenciadores. Los astrocitos contribuyen activamente al refinamiento de desarrollo de circuitos neuronales mediante el control de la formación de sinapsis, mantenimiento y eliminación, todos los cuales son procesos importantes para el funcionamiento neuronal. El protocolo presentado en este documento es altamente dependiente de astrocito-: que madurar y formar sinapsis funcionales, las neuronas necesitan el apoyo de los astrocitos. Hemos experimentado que el número de astrocitos debe ser aproximadamente igual al número de neuronas derivadas de hiPSC para apoyar la maduración de las neuronas y la formación de redes neuronales que muestran actividad espontánea. Desde nuestros rendimientos de protocolo de astrocitos cul célula primariaras con una vida útil limitada, el aislamiento de astrocitos de rata se tiene que realizar regularmente. Nuestra adaptación del protocolo publicado por Zhang et al. (2013) 12 para su uso con la tecnología de MEA es probable que mejorar significativamente nuestra capacidad para estudiar la actividad de la red de redes derivadas de hiPSC. Anteriormente, los protocolos utilizados para el estudio de las redes neuronales derivadas de hiPSC de los AAM se basó en los procedimientos de diferenciación que consumen mucho tiempo 13-16. El protocolo de Zhang et al. (2013) proporciona una alternativa rápida, y nuestra modificación elimina una fuente de variabilidad, lo que hace ahora más factible el uso de neuronas derivadas de hiPSC en combinación con la tecnología de MEA, especialmente en alto rendimiento o estudios farmacológicos. Además, debido a que el método publicado por Zhang et al. (2013) 12 produce una población homogénea de la capa superior neuronas corticales, nuestro protocolo adaptado hace posible estudios concentrados en la red de unactividad de este subconjunto neuronal particular. Sin embargo, este enfoque tiene también varias limitaciones. En primer lugar, la homogeneidad de los cultivos también se puede considerar una desventaja, debido a que los cultivos son menos probable que se asemejan en redes in vivo, donde las diferentes clases de neuronas (es decir, neuronas inhibitorias y excitatorias) constituyen una red heterogénea. Para mejorar aún más el uso de las neuronas derivadas de hiPSC con la tecnología de MEA, será importante desarrollar rápidos protocolos de diferenciación (a base de transgén) para otras poblaciones de células neuronales. Si se dispone de protocolos, las redes in vitro imitarían redes in vivo más de cerca. En segundo lugar, en la actualidad, astrocitos de rata se debe añadir a las neuronas derivadas de hiPSC para el apoyo del crecimiento, y por lo tanto la red neuronal resultante no es un neuronal stricto sensu red humana. protocolos fiables para diferenciar hiPSCs en astrocitos puede en el futuro de solve este problema 26. En tercer lugar, las redes neuronales de dos dimensiones, tal como se describe aquí, son un modelo para el estudio limitado tridimensionales redes neuronales complejas en vivo. Afortunadamente, los protocolos que describen tridimensionales cultivos de neuronas de rata primaria en combinación con la tecnología de MEA ya están disponibles 27,28. Prospectiva, la combinación de protocolos de diferenciación rápidos para la obtención de neuronas y astrocitos derivados de hiPSC con técnicas de cultivo en tres dimensiones y la tecnología de MEA debería proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos biológicos subyacentes trastornos neurológicos.

El desarrollo de origen humano pluripotentes células madre (hiPSCs) protocolos de diferenciación para generar neuronas humanas in vitro ha proporcionado una nueva y poderosa herramienta para el estudio de los trastornos neurológicos. Hasta hace poco, el estudio de estos trastornos se vio gravemente obstaculizada por la falta de sistemas de modelos que utilizan las neuronas humanas. Aunque los roedores pueden ser utilizados para estudiar los trastornos neurológicos, los resultados de estos estudios no se pueden traducir fácilmente a los seres humanos 1. Dadas estas limitaciones, neuronas derivadas de hiPSC son un modelo alternativa prometedora que puede ser utilizado para elucidar los mecanismos moleculares subyacentes y trastornos neurológicos para la detección de drogas in vitro. En la última década, varios protocolos para convertir hiPSCs en neuronas han sido desarrollados 2-8. Sin embargo, estos protocolos son todavía limitados en muchos sentidos. En primer lugar, los protocolos son a menudo mucho tiempo: la generación de neuronas con la maduración adecuada (es decir, synapformación se) y la actividad funcional requiere meses de procedimientos de cultivo, lo que hace estudios a gran escala difíciles 9. Además, la eficiencia de conversión de hiPSC a la neurona es baja. Protocolos a menudo producen una población heterogénea de las neuronas, y por lo tanto no permiten estudios de subconjuntos específicos de células neuronales. Por otra parte, los protocolos no son reproducibles, obteniéndose resultados diferentes para diferentes líneas de IPSC 10,11. Por último, la etapa de maduración y propiedades funcionales de las neuronas resultantes también son variables 10. Para hacer frente a estos problemas, Zhang et al. (2013) 12 desarrollado un protocolo que genera rápidamente y de manera reproducible neuronas humanas de hiPSCs mediante la sobreexpresión del factor de transcripción neurogenina-2. Según lo informado por los autores, la diferenciación se produce con relativa rapidez (sólo 2 - 3 semanas después de la inducción de la expresión de neurogenina-2), el protocolo es reproducible (propiedades neuronales son independientes de los starting línea hiPSC), y la conversión-hiPSC a la neurona es muy eficiente (casi el 100%). La población de neuronas generadas con su protocolo es homogénea (que se asemeja de capa superior neuronas corticales), lo que permite la investigación de las contribuciones específicas de tipo celular a trastornos neuronales. Además, sus neuronas derivadas de hiPSC exhiben propiedades maduras (por ejemplo, la capacidad de formar sinapsis y actividad funcional sólido) después de sólo 20 d. La caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas derivadas de hiPSC a nivel de red es un requisito previo importante antes de la tecnología hiPSC puede ser explotado para el estudio de enfermedades humanas. Por esta razón, muchos grupos de investigación han comenzado recientemente a investigar neuronas derivadas de las células madre en el nivel de red utilizando disposición de micro-electrodo (MEA) dispositivos (sistemas multicanal, Reutlingen, Alemania) 13-16. Los electrodos de un MEA están incrustadas en un sustrato sobre el que se pueden cultivar las células neuronales.MEAs se pueden utilizar para explorar las propiedades electrofisiológicas de las redes neuronales y el desarrollo in vitro de su actividad. En la actualidad, los AMA sólo se utilizan en combinación con protocolos de diferenciación que tardan varios meses para producir redes maduras. Por lo tanto, la combinación de los AMA con un protocolo de diferenciación rápida debe facilitar el uso de esta tecnología en estudios a gran escala de trastornos neurológicos. A continuación, presentamos una modificación de la Zhang et al. (2013) 12 de protocolo y adaptarlo para su uso en los AMA. En particular, en lugar de confiar en una transducción lentiviral aguda, que en vez creado líneas que expresan de forma estable hiPSC rtTA / Ngn2 antes de inducir la diferenciación. Hicimos esto principalmente para tener un control reproducible sobre la densidad de las células neuronales, ya que la densidad de las células neuronales es crítica para la formación de la red neuronal, y para un buen contacto entre las neuronas y los electrodos de la MEA 17,18. Although la Zhang et al. protocolo es muy eficiente con respecto a la conversión de hiPSCs transducidas, es inherentemente variable con respecto al rendimiento final de las neuronas a partir del número de hiPSCs plateado inicialmente (véase la Figura 2E en Zhang et al.) 12. Con una línea estable, eliminamos muchos problemas que causan la variabilidad, como la toxicidad y la eficacia lentiviral infección. A continuación, hemos optimizado los parámetros que producen de forma fiable las redes neuronales derivadas de hiPSC en los AMA, la obtención de la maduración de la red (por ejemplo, eventos sincrónicos que implican la mayoría de los canales) por la tercera semana. Este protocolo rápido y fiable debería permitir comparaciones directas entre las neuronas derivadas de diferentes líneas hiPSC (es decir, específica del paciente), así como proporcionar consistencia sólida para estudios farmacológicos.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz's L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de alta glucosa</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Suero fetal bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 vector de empaquetamiento lentiviral</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vector de empaquetamiento lentiviral</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #12259</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Solución de desconexión de células</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 medio</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>inhibidor de ROCK</td><td>Gibco A2644501</td><td>&nbsp;</td><td>Alternativamente, se pueden usar inhibidores de ROCK como la tiazovivina.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>MEAs de 6 pocillos</td><td>Sistemas multicanal</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, recombinantes</td> <td>humanosPromokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, recombinante humano</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-arabinofuranósido&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas rectas de punta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de punta fina&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Las neuronas derivadas de origen humano células madre pluripotentes (hiPSCs) proporcionan una nueva herramienta prometedora para el estudio de los trastornos neurológicos. En la última década, se han desarrollado muchos protocolos para la diferenciación de las neuronas en hiPSCs. Sin embargo, estos protocolos son a menudo lento con alta variabilidad, baja reproducibilidad, y baja eficiencia. Además, las neuronas obtenidos con estos protocolos son a menudo inmaduros y carecen de actividad funcional adecuada, tanto a nivel de una sola célula y de red a menos que las neuronas se cultivan durante varios meses. En parte debido a estas limitaciones, las propiedades funcionales de las redes neuronales derivadas de hiPSC todavía no están bien caracterizados. Aquí, adaptar un protocolo recientemente publicado que describe la producción de neuronas humanas de hiPSCs por expresión forzada del factor de transcripción neurogenina-2 12. Este protocolo es rápido (lo que supondría neuronas maduras dentro de 3 semanas) y eficiente, con una eficiencia de conversión de casi el 100% de transduced células (&gt; 95% de las células DAPI-positivas son MAP2 positivo). Por otra parte, el protocolo se obtiene una población homogénea de las neuronas excitatorias que permitirían la investigación de las contribuciones células específicas del tipo de los trastornos neurológicos. Hemos modificado el protocolo original mediante la generación de células transducidas de forma estable hiPSC, que nos da el control explícito sobre el número total de neuronas. Estas células se utilizan entonces para generar redes neuronales derivadas de hiPSC en matrices de micro-electrodos. De esta manera, la actividad electrofisiológica espontánea de redes neuronales derivadas de hiPSC se puede medir y se caracteriza, al tiempo que conserva la consistencia interexperimental en términos de la densidad celular. El protocolo presentado es ampliamente aplicable, especialmente para estudios mecánicos y farmacológicos sobre redes neuronales humanas.

Aquí se ha modificado con éxito un protocolo en el que se diferencian hiPSCs directamente en neuronas corticales por la sobre-expresión del factor de transcripción neurogenina 2-12 y lo hemos adaptado para el uso de los AMA. Este enfoque es rápido y eficiente que nos permite obtener neuronas funcionales y actividad de la red, ya durante la tercera semana después de la inducción de la diferenciación. Durante el curso del protocolo de diferenciación, las células morfológicamente comenzaron a parecerse a las neuronas: se formaron pequeños procesos y las neuronas comenzaron conectar entre sí (Figura 1A). Hemos establecido un perfil neurofisiológico de las neuronas derivadas de una línea hiPSC-control sano, mediante la medición de su morfología neuronal y las propiedades sinápticas durante el desarrollo. neuronas derivadas de hiPSC se tiñeron para MAP2 y sinapsina-1/2 en diferentes días después del iniciode la diferenciación (Figura 2A). Las neuronas derivadas muestran la morfología neuronal maduro ya 3 semanas después de la inducción de la diferenciación. El número de sinapsina medio puntos lagrimales (una medida para el número de sinapsis) se cuantificó en base a la sinapsina-1/2 tinciones de inmunocitoquímica. El número de puntos lagrimales sinapsina media aumentó con el tiempo, lo que sugiere que el nivel de conectividad neuronal también está aumentando (Figura 2B). El número de sinapsina medio puntos lagrimales 23 días después de la inducción de la diferenciación fue similar en dos líneas independientes de IPS (Figura 2C). En 23 DIV más synapsin1 / 2 puntos lagrimales se yuxtapone a PSD-95 puntos lagrimales, que es indicativo de las sinapsis funcionales (Figura 2D). Consistente con los resultados descritos por Zhang et al., Generamos una población de capa superior neuronas corticales excitatorios, confirmado por m cortical pan-neuronal y el subtipo específico de arkers como Brn2 y SATB2 (capa II / III). No observamos neuronas que fueron positivos para las neuronas de la capa profunda Ctip2 (capa V) o Foxp2 (la capa VI) (Figura 2 E y F) Para caracterizar la actividad electrofisiológica de las neuronas derivadas de hiPSC, utilizamos actual de célula completa y grabaciones tensión de la abrazadera, es decir, las propiedades intrínsecas y excitatorios de entrada en estas neuronas fueron medidos durante el desarrollo. Las neuronas fueron capaces de generar potenciales de acción ya una semana después de la de la diferenciación y el porcentaje de clavar células fue aumentando con el tiempo (Figura 2G y H). Por otra parte, las neuronas reciben de entrada sináptica excitatoria ya una semana después de la inducción de la diferenciación: la frecuencia y la amplitud de la entrada sináptica excitatoria aumentaron durante el desarrollo (Figura 2I - K). nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; Para comprender mejor cómo la actividad de una sola célula se combina para formar funciones a nivel de red, es esencial para estudiar cómo las neuronas funcionan en concierto in vitro redes neuronales cultivadas en los AMA. constituye un modelo experimental valiosa para el estudio de la dinámica neuronal. Se registraron 20 min de actividad de la red electrofisiológico de neuronas derivadas de una línea hiPSC-control sano cultivadas en 6 pocillos AMMA (Figura 2 M). Pocas semanas después de la inducción de la diferenciación, las neuronas derivado de hiPSCs y controles sanos formado redes neuronales funcionalmente activos, mostrando eventos espontáneos (0,62 ± 0,05 punto / s; Figura 2 N). En esta etapa del desarrollo (es decir, 16 días después del inicio de la diferenciación) hay eventos sincrónicos que participen todos los canales . de los AMA son detectados (Figura 2O) el nivel de actividad de la red se incrementó durante el desarrollo: durante la cuarta semana después de t que la inducción de la diferenciación, las redes neuronales mostró alto nivel de actividad espontánea (2,5 ± 0,1 espiga / s; Figura 2 N) en todos los pocillos del dispositivo. Las redes también exhibieron ráfagas síncronos de red (4,1 ± 0,1 ráfaga / min, Figura 2O) con larga duración (2.100 ± 500 ms). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> Figura 1: hiPSC diferenciación en neuronas. A. Tres puntos de tiempo de hiPSCs diferenciación en neuronas en cubreobjetos. B. Chapado de hiPSCs en los AMA. C. Los astrocitos en el 100% de confluencia en el matraz T75 (tenga en cuenta que las células forman una monocapa de mosaico). Barras de escala: 150 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> Figura 2. hiPSC derivado de neuronas de caracterización. Neuronas derivadas de hiPSC A. se tiñeron para MAP2 (verde) y sinapsina medio (rojo) en diferentes días después del inicio de la diferenciación. Barra de escala: 10 micras. B. Cuantificación de puntos lagrimales sinapsina en dos experimentos independientes. En cada uno de los experimentos se analizaron al menos 10 células. C. Cuantificación de puntos lagrimales sinapsina en DIV23 en neuronas derivadas de dos líneas de IPS independientes. Neuronas derivadas de hiPSC D. se tiñeron para PSD-95 (verde) y / 2 (rojo) 23 días 1 sinapsina después del inicio de la diferenciación. sinapsina puntos lagrimales se yuxtaponen al PSD-95 puntos lagrimales. Neuronas derivadas de E. hiPSC se tiñeron para MAP2 (verde) y Brn2 (rojo) o SATB2 (rojo) 23 d después del inicio de la diferenciación. F. El porcentaje de células positivas que MAP2fueron positivos para los marcadores indicados. G. representativos clamp grabaciones de corriente que muestran que los potenciales de acción se pueden generar tan pronto como 7 d después del inicio de la diferenciación. H. Porcentaje de células en diferentes días después de la inducción de la diferenciación que muestran uno o más potenciales de acción. I. trazas representativas de las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) recibidas por neuronas derivadas de hiPSC en diferentes días después de la diferenciación. J. frecuencia de las corrientes excitatorios postsinápticos durante el desarrollo. K. amplitud de las corrientes excitatorios postsinápticos durante el desarrollo. L. Representante traza de grabaciones EPSC sin (control) y con CNQX (CNQX). M. neuronas derivadas de una línea hiPSC se cultivaron en un MEA de 6 pocillos y se muestra la actividad de red para redes neuronales derivadas de hiPSC 16 y 23 d después de la inducción de la diferenciación. La actividad registrada desdecada uno (frecuencia de muestreo de 10 kHz) también se indica con un color diferente (5 min de los 20 minutos de la grabación se muestra). N. tasa de disparo 16 y 23 d después de la inducción de la diferenciación. O. tasa de ruptura 16 y 23 d después de la inducción de la diferenciación. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Dados los resultados, la calidad de las neuronas hiPSC derivados resultantes puede evaluarse haciendo un perfil neurofisiológico de las células. Es decir, tres a cuatro semanas después del inicio de la diferenciación, la morfología, sinapsina medio de expresión y la electrofisiología de las neuronas pueden evaluarse. En ese punto de tiempo, se espera que las neuronas derivadas de hiPSC para mostrar una morfología de tipo neuronal, para ser MAP2, sinapsina / PSD-95 inmunocitoquímica positiva cuando se realizan, y para exposit actividad electrofisiológica espontánea (tanto en el de una sola célula y el nivel de red).

Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

El objetivo general de este protocolo de diferenciación neuronal es generar redes neuronales a partir de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano que crecen en matrices de microelectrodos de forma rápida y controlada. Este método se puede utilizar para abordar preguntas clave en los campos de la neurociencia. Se puede utilizar para estudiar los mecanismos biológicos que subyacen a los trastornos neurológicos, pero también se puede utilizar para abordar cuestiones neurobiológicas más fundamentales.La principal ventaja de esta técnica es la rápida diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas en neuronas de forma controlada. El primer día, caliente el medio DMEM/F12, CDS y E8 con estreptomicina al 1% a temperatura ambiente. A continuación, agregue doxiciclina al medio E8 para hacer una concentración final de cuatro microgramos por mililitro y luego agregue inhibidor de rocas a la mezcla.Aspire el medio gastado de las RTTANGN2 hiPSC positivas y agregue un mililitro de CDS a las células. Posteriormente, incube las células durante tres a cinco minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Bajo el microscopio, compruebe si las células se están separando unas de otras.A continuación, añade dos mililitros DMEM/F12 en el pocillo. Suspenda suavemente las células con una pipeta de 1.000 microlitros y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. A continuación, añade siete mililitros de DMEM/F12 a la suspensión celular y haz girar las células a 200 x g durante cinco minutos.Pasados cinco minutos, aspirar el sobrenadante y añadir dos mililitros del medio E8 preparado. Disocie las hiPSC colocando la punta de una pipeta de 1.000 microlitros contra el lateral del tubo de 15 mililitros y resuspendiendo las células suavemente. Bajo el microscopio, verifique si las células están disociadas.Luego, determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro. Para los MEA de seis pocillos, diluya las células para obtener una suspensión celular de 7,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro. Para los cubreobjetos, diluya las celdas para obtener una suspensión celular de cuatro veces 10 a la cuarta celdas por mililitro.Aspire la laminina diluida de los cubreobjetos y de los MEA de los seis pocillos. Para los MEA de seis pocillos, recubra las celdas agregando 100 microlitros de suspensión de celda al área del electrodo activo en cada pocillo. A continuación, coloque las células añadiendo 500 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 24 pocillos.A continuación, coloque los MEA de seis pocillos o la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Después de dos horas, agregue cuidadosamente 500 microlitros del medio E8 preparado a cada pocillo de los seis pocillos MEA. Posteriormente, coloque los MEA de seis pocillos durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.Al tercer día, caliente 0,05% de tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Calentar DPBS y DMEM/F12 con estreptomicina al 1% de penicilina a 37 grados centígrados. A continuación, aspire el medio gastado del cultivo de astrocitos de rata.Lave el cultivo agregando cinco mililitros de DPBS y agítelo suavemente. A continuación, aspire DPBS y añada cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05%. Agite suavemente la tripsina-EDTA.Luego incube las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. Posteriormente, verifique bajo el microscopio para examinar si las células están desprendidas. Separe las últimas celdas golpeando el matraz unas cuantas veces.A continuación, añada cinco mililitros de DMEM/F12 al matraz. Trate de clasificar suavemente las células dentro del matraz con una pipeta de 10 mililitros. Después, recoge la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros.Girar el tubo a 200 x g durante ocho minutos. Después de eso, aspire el supernatent y vuelva a suspender las células en un mililitro de DMEM/F12. Determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro.A continuación, agregue 7,5 por 10 al cuarto astrocito a cada pozo de los seis POM de pocillos. Y agregue dos veces 10 al cuarto astrocito a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Incube las células durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.Adquiera los datos a 1.200 veces la amplificación y muestree la señal a 10 kilohercios utilizando la tarjeta de adquisición de datos MCS. Registre 20 minutos de actividad electrofisiológica de neuronas derivadas de hiPSC cultivadas en MEAs. Durante el registro, mantenga la temperatura a 37 grados centígrados y evite la evaporación del medio y los cambios de pH mediante la entrega de un flujo lento y constante de gas humidificado a los MEA.Después de eso, analice los datos utilizando un paquete de software personalizado. En esta figura se muestran los cambios en la expresión de los marcadores neuronales MAP2 en la sinapsina durante el proceso de diferenciación, lo que indica la maduración neuronal. Este gráfico muestra que la expresión de sinapsina se mide para células individuales aumentadas durante el proceso de diferenciación.La sinapsina que se expresa en las células después de tres semanas de diferenciación colocalizada con PSD-95, lo que indica la presencia de sinapsis funcionales. Aquí, se realizó una pinza de parche de célula completa en diferentes puntos de tiempo durante el proceso de diferenciación para medir la actividad electrofisiológica de las células. Las células fueron capaces de generar potenciales de acción en los diferentes puntos temporales.Y el porcentaje de células de pico que aumentan con el tiempo muestra que la mayoría de las células son capaces de generar potenciales de acción, incluso en la etapa temprana de diferenciación. También se utilizó una pinza de parche para medir las corrientes postsinápticas excitatorias recibidas por las células. El número de entradas que reciben las células aumentó durante el proceso de diferenciación.Tanto la frecuencia como la amplitud de las corrientes postsinápticas excitadoras aumentaron durante el proceso de diferenciación. Durante el proceso de diferenciación se midió la actividad electrofisiológica de las células diferenciadas en matrices de microelectrodos. Aquí, la actividad de la red neuronal aumentó durante el proceso de diferenciación y mostró eventos sincrónicos después de 23 días.Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para diferenciar células madre pluripotentes inducidas en redes neuronales funcionales en tres o cuatro semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar de manera estéril y tratar las células con cuidado. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como las pruebas farmacológicas, para rescatar el fenotipo, observado en las líneas celulares de los pacientes.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la neurociencia estudiaran oficialmente los defectos de la actividad de la red en los trastornos neurológicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar, inducir células madre pluripotentes en las neuronas de manera rápida y controlada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Construcción de redes neuronales tridimensionales acopladas a matrices de microelectrodos

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Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en neuronas en matrices de microelectrodos

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Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente

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Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos (Video) | JoVE Journal

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

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