Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos
8 de enero de 2017
Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.
El objetivo general de este protocolo de diferenciación neuronal es generar redes neuronales a partir de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano que crecen en matrices de microelectrodos de forma rápida y controlada. Este método se puede utilizar para abordar preguntas clave en los campos de la neurociencia. Se puede utilizar para estudiar los mecanismos biológicos que subyacen a los trastornos neurológicos, pero también se puede utilizar para abordar cuestiones neurobiológicas más fundamentales.
La principal ventaja de esta técnica es la rápida diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas en neuronas de forma controlada. El primer día, caliente el medio DMEM/F12, CDS y E8 con estreptomicina al 1% a temperatura ambiente. A continuación, agregue doxiciclina al medio E8 para hacer una concentración final de cuatro microgramos por mililitro y luego agregue inhibidor de rocas a la mezcla.
Aspire el medio gastado de las RTTANGN2 hiPSC positivas y agregue un mililitro de CDS a las células. Posteriormente, incube las células durante tres a cinco minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Bajo el microscopio, compruebe si las células se están separando unas de otras.
A continuación, añade dos mililitros DMEM/F12 en el pocillo. Suspenda suavemente las células con una pipeta de 1.000 microlitros y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. A continuación, añade siete mililitros de DMEM/F12 a la suspensión celular y haz girar las células a 200 x g durante cinco minutos.
Pasados cinco minutos, aspirar el sobrenadante y añadir dos mililitros del medio E8 preparado. Disocie las hiPSC colocando la punta de una pipeta de 1.000 microlitros contra el lateral del tubo de 15 mililitros y resuspendiendo las células suavemente. Bajo el microscopio, verifique si las células están disociadas.
Luego, determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro. Para los MEA de seis pocillos, diluya las células para obtener una suspensión celular de 7,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro. Para los cubreobjetos, diluya las celdas para obtener una suspensión celular de cuatro veces 10 a la cuarta celdas por mililitro.
Aspire la laminina diluida de los cubreobjetos y de los MEA de los seis pocillos. Para los MEA de seis pocillos, recubra las celdas agregando 100 microlitros de suspensión de celda al área del electrodo activo en cada pocillo. A continuación, coloque las células añadiendo 500 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 24 pocillos.
A continuación, coloque los MEA de seis pocillos o la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Después de dos horas, agregue cuidadosamente 500 microlitros del medio E8 preparado a cada pocillo de los seis pocillos MEA. Posteriormente, coloque los MEA de seis pocillos durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.
Al tercer día, caliente 0,05% de tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Calentar DPBS y DMEM/F12 con estreptomicina al 1% de penicilina a 37 grados centígrados. A continuación, aspire el medio gastado del cultivo de astrocitos de rata.
Lave el cultivo agregando cinco mililitros de DPBS y agítelo suavemente. A continuación, aspire DPBS y añada cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05%. Agite suavemente la tripsina-EDTA.
Luego incube las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. Posteriormente, verifique bajo el microscopio para examinar si las células están desprendidas. Separe las últimas celdas golpeando el matraz unas cuantas veces.
A continuación, añada cinco mililitros de DMEM/F12 al matraz. Trate de clasificar suavemente las células dentro del matraz con una pipeta de 10 mililitros. Después, recoge la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros.
Girar el tubo a 200 x g durante ocho minutos. Después de eso, aspire el supernatent y vuelva a suspender las células en un mililitro de DMEM/F12. Determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro.
A continuación, agregue 7,5 por 10 al cuarto astrocito a cada pozo de los seis POM de pocillos. Y agregue dos veces 10 al cuarto astrocito a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Incube las células durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.
Adquiera los datos a 1.200 veces la amplificación y muestree la señal a 10 kilohercios utilizando la tarjeta de adquisición de datos MCS. Registre 20 minutos de actividad electrofisiológica de neuronas derivadas de hiPSC cultivadas en MEAs. Durante el registro, mantenga la temperatura a 37 grados centígrados y evite la evaporación del medio y los cambios de pH mediante la entrega de un flujo lento y constante de gas humidificado a los MEA.
Después de eso, analice los datos utilizando un paquete de software personalizado. En esta figura se muestran los cambios en la expresión de los marcadores neuronales MAP2 en la sinapsina durante el proceso de diferenciación, lo que indica la maduración neuronal. Este gráfico muestra que la expresión de sinapsina se mide para células individuales aumentadas durante el proceso de diferenciación.
La sinapsina que se expresa en las células después de tres semanas de diferenciación colocalizada con PSD-95, lo que indica la presencia de sinapsis funcionales. Aquí, se realizó una pinza de parche de célula completa en diferentes puntos de tiempo durante el proceso de diferenciación para medir la actividad electrofisiológica de las células. Las células fueron capaces de generar potenciales de acción en los diferentes puntos temporales.
Y el porcentaje de células de pico que aumentan con el tiempo muestra que la mayoría de las células son capaces de generar potenciales de acción, incluso en la etapa temprana de diferenciación. También se utilizó una pinza de parche para medir las corrientes postsinápticas excitatorias recibidas por las células. El número de entradas que reciben las células aumentó durante el proceso de diferenciación.
Tanto la frecuencia como la amplitud de las corrientes postsinápticas excitadoras aumentaron durante el proceso de diferenciación. Durante el proceso de diferenciación se midió la actividad electrofisiológica de las células diferenciadas en matrices de microelectrodos. Aquí, la actividad de la red neuronal aumentó durante el proceso de diferenciación y mostró eventos sincrónicos después de 23 días.
Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para diferenciar células madre pluripotentes inducidas en redes neuronales funcionales en tres o cuatro semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar de manera estéril y tratar las células con cuidado. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como las pruebas farmacológicas, para rescatar el fenotipo, observado en las líneas celulares de los pacientes.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la neurociencia estudiaran oficialmente los defectos de la actividad de la red en los trastornos neurológicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar, inducir células madre pluripotentes en las neuronas de manera rápida y controlada.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo modificado para la diferenciación rápida de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) en neuronas corticales excitadoras. El método permite un control de la densidad celular neuronal y es compatible con matrices de microelectrodos para medir propiedades electrofisiológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de Células Madre
- Electrofisiología
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) pueden diferenciarse en diversos tipos neuronales.
- Comprender las redes neuronales es fundamental para estudiar los trastornos neurológicos.
- Las matrices de microelectrodos (MEAs) facilitan la medición de la actividad neuronal.
- Los protocolos de diferenciación rápida mejoran la eficiencia de la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para generar redes neuronales a partir de células iPS humanas.
- Permitir el estudio de los mecanismos neurobiológicos y de los trastornos neurológicos.
- Proporcionar un protocolo que mantenga el control sobre la densidad celular.
Métodos Utilizados
- Preparación de medios de cultivo y técnicas de disociación celular.
- Siembra de células iPS humanas en matrices de microelectrodos.
- Seguimiento de marcadores de diferenciación y maduración neuronales.
- Grabaciones electrofisiológicas para evaluar la actividad neuronal.
Resultados principales
- Diferenciación exitosa de células iPS humanas en neuronas funcionales.
- Aumento de la expresión de marcadores neuronales durante la diferenciación.
- Actividad de potenciales de acción y sináptica demostrada en neuronas diferenciadas.
- La actividad de la red neuronal aumentó con el tiempo, lo que indica maduración.
Conclusiones
- El protocolo modificado permite la generación eficiente de redes neuronales.
- Esta técnica puede aplicarse para estudiar diversas preguntas neurobiológicas.
- Mantener condiciones estériles y un manejo cuidadoso es crucial para el éxito.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación rápida y controlada de células iPS humanas en redes neuronales funcionales aborda un cuello de botella crítico en el descubrimiento de fármacos centrado en neurobiología. Este protocolo permite la generación reproducible de neuronas humanas maduras y excitadoras, adecuadas para ensayos electrofisiológicos de alto contenido, lo que respalda la confianza predictiva en investigaciones de trastornos neurológicos en etapas iniciales. El enfoque mejora la toma de decisiones en carteras al proporcionar modelos humanos escalables y relevantes para enfermedades, destinados a interrogatorios mecanicistas y farmacológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de mecanismos neuronales relevantes para enfermedades mediante neuronas excitatorias derivadas de humanos.
- Apoya la validación funcional de dianas al medir salidas electrofisiológicas a nivel de red.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante poblaciones neuronales homogéneas y controladas.
- Mejora la confianza predictiva en la selección y triaje de dianas neurológicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona cultivos neuronales estandarizados y reproducibles para la selección de compuestos posteriores.
- Ofrece lecturas electrofisiológicas cuantitativas mediante matrices de microelectrodos.
- Permite la escalabilidad del ensayo y la comparabilidad entre estudios mediante el control explícito de la densidad celular.
- Facilita la evaluación confiable de intervenciones farmacológicas en redes neuronales humanas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la actividad de las redes neuronales in vitro con puntos finales funcionales relevantes para la enfermedad.
- Conecta el descubrimiento y la validación preclínica al permitir estudios mecanicistas en líneas derivadas de pacientes.
- Reduce el riesgo de traslación al modelar disfunciones en redes neuronales humanas observadas en trastornos neurológicos.
- Facilita el descubrimiento de biomarcadores mediante mediciones electrofisiológicas longitudinales.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico al permitir la generación rápida de redes neuronales humanas funcionales para la validación de objetivos, cribado y estudios mecanicistas.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en sistemas neuronales humanos.
- Selección: Proporciona cultivos neuronales reproducibles y listos para ensayos, con salidas cuantitativas de actividad en red.
- Análisis: Ofrece mediciones electrofisiológicas y análisis estadísticos para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con mecanismos de enfermedad y posibles biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y reutilizable para diversos programas de investigación neurológica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas neurológicas.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos neuronales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la generación robusta de datos en etapas tempranas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas para trastornos neurológicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, diferenciación neuronal y análisis electrofisiológico.
- Necesita acceso a instrumentación de matriz de microelectrodos y software personalizado para análisis de datos.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para las densidades celulares y los protocolos de diferenciación.
- Puede ser necesario adaptar el procedimiento para distintas líneas de hiPSC o modelos de enfermedad.
- Las limitaciones incluyen la necesidad de técnicas estériles y un manejo cuidadoso de las células para garantizar la reproducibilidad.
