Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

El objetivo general de este protocolo de diferenciación neuronal es generar redes neuronales a partir de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano que crecen en matrices de microelectrodos de forma rápida y controlada. Este método se puede utilizar para abordar preguntas clave en los campos de la neurociencia. Se puede utilizar para estudiar los mecanismos biológicos que subyacen a los trastornos neurológicos, pero también se puede utilizar para abordar cuestiones neurobiológicas más fundamentales.

La principal ventaja de esta técnica es la rápida diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas en neuronas de forma controlada. El primer día, caliente el medio DMEM/F12, CDS y E8 con estreptomicina al 1% a temperatura ambiente. A continuación, agregue doxiciclina al medio E8 para hacer una concentración final de cuatro microgramos por mililitro y luego agregue inhibidor de rocas a la mezcla.

Aspire el medio gastado de las RTTANGN2 hiPSC positivas y agregue un mililitro de CDS a las células. Posteriormente, incube las células durante tres a cinco minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Bajo el microscopio, compruebe si las células se están separando unas de otras.

A continuación, añade dos mililitros DMEM/F12 en el pocillo. Suspenda suavemente las células con una pipeta de 1.000 microlitros y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros. A continuación, añade siete mililitros de DMEM/F12 a la suspensión celular y haz girar las células a 200 x g durante cinco minutos.

Pasados cinco minutos, aspirar el sobrenadante y añadir dos mililitros del medio E8 preparado. Disocie las hiPSC colocando la punta de una pipeta de 1.000 microlitros contra el lateral del tubo de 15 mililitros y resuspendiendo las células suavemente. Bajo el microscopio, verifique si las células están disociadas.

Luego, determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro. Para los MEA de seis pocillos, diluya las células para obtener una suspensión celular de 7,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro. Para los cubreobjetos, diluya las celdas para obtener una suspensión celular de cuatro veces 10 a la cuarta celdas por mililitro.

Aspire la laminina diluida de los cubreobjetos y de los MEA de los seis pocillos. Para los MEA de seis pocillos, recubra las celdas agregando 100 microlitros de suspensión de celda al área del electrodo activo en cada pocillo. A continuación, coloque las células añadiendo 500 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 24 pocillos.

A continuación, coloque los MEA de seis pocillos o la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Después de dos horas, agregue cuidadosamente 500 microlitros del medio E8 preparado a cada pocillo de los seis pocillos MEA. Posteriormente, coloque los MEA de seis pocillos durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.

Al tercer día, caliente 0,05% de tripsina-EDTA a temperatura ambiente. Calentar DPBS y DMEM/F12 con estreptomicina al 1% de penicilina a 37 grados centígrados. A continuación, aspire el medio gastado del cultivo de astrocitos de rata.

Lave el cultivo agregando cinco mililitros de DPBS y agítelo suavemente. A continuación, aspire DPBS y añada cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05%. Agite suavemente la tripsina-EDTA.

Luego incube las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. Posteriormente, verifique bajo el microscopio para examinar si las células están desprendidas. Separe las últimas celdas golpeando el matraz unas cuantas veces.

A continuación, añada cinco mililitros de DMEM/F12 al matraz. Trate de clasificar suavemente las células dentro del matraz con una pipeta de 10 mililitros. Después, recoge la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros.

Girar el tubo a 200 x g durante ocho minutos. Después de eso, aspire el supernatent y vuelva a suspender las células en un mililitro de DMEM/F12. Determine el número de células por mililitro usando un hemocitómetro.

A continuación, agregue 7,5 por 10 al cuarto astrocito a cada pozo de los seis POM de pocillos. Y agregue dos veces 10 al cuarto astrocito a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Incube las células durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados.

Adquiera los datos a 1.200 veces la amplificación y muestree la señal a 10 kilohercios utilizando la tarjeta de adquisición de datos MCS. Registre 20 minutos de actividad electrofisiológica de neuronas derivadas de hiPSC cultivadas en MEAs. Durante el registro, mantenga la temperatura a 37 grados centígrados y evite la evaporación del medio y los cambios de pH mediante la entrega de un flujo lento y constante de gas humidificado a los MEA.

Después de eso, analice los datos utilizando un paquete de software personalizado. En esta figura se muestran los cambios en la expresión de los marcadores neuronales MAP2 en la sinapsina durante el proceso de diferenciación, lo que indica la maduración neuronal. Este gráfico muestra que la expresión de sinapsina se mide para células individuales aumentadas durante el proceso de diferenciación.

La sinapsina que se expresa en las células después de tres semanas de diferenciación colocalizada con PSD-95, lo que indica la presencia de sinapsis funcionales. Aquí, se realizó una pinza de parche de célula completa en diferentes puntos de tiempo durante el proceso de diferenciación para medir la actividad electrofisiológica de las células. Las células fueron capaces de generar potenciales de acción en los diferentes puntos temporales.

Y el porcentaje de células de pico que aumentan con el tiempo muestra que la mayoría de las células son capaces de generar potenciales de acción, incluso en la etapa temprana de diferenciación. También se utilizó una pinza de parche para medir las corrientes postsinápticas excitatorias recibidas por las células. El número de entradas que reciben las células aumentó durante el proceso de diferenciación.

Tanto la frecuencia como la amplitud de las corrientes postsinápticas excitadoras aumentaron durante el proceso de diferenciación. Durante el proceso de diferenciación se midió la actividad electrofisiológica de las células diferenciadas en matrices de microelectrodos. Aquí, la actividad de la red neuronal aumentó durante el proceso de diferenciación y mostró eventos sincrónicos después de 23 días.

Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para diferenciar células madre pluripotentes inducidas en redes neuronales funcionales en tres o cuatro semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar de manera estéril y tratar las células con cuidado. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como las pruebas farmacológicas, para rescatar el fenotipo, observado en las líneas celulares de los pacientes.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la neurociencia estudiaran oficialmente los defectos de la actividad de la red en los trastornos neurológicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar, inducir células madre pluripotentes en las neuronas de manera rápida y controlada.