Name: Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende a medir fuerzas mecánicas en el complejo nuclear LINC mediante microscopía FRET y biosensores específicos para Nesprin-2G en células NIH 3T3 vivas. Este método permite cuantizar dinámica de fuerzas en mecanotransducción celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Thomas F. Miller y Kate Jeffress Memoria Trust (DEC) y el NIH subvención R35GM119617 (DEC). La formación de imágenes de microscopio confocal se realizó en la Instalación de VCU Nanomateriales Caracterización Core (NCC).

1. Obtener ADN Sensor nesprin-2G y otro ADN plásmido <ol><li> Obtener nesprin-2G TS (sensor de tensión) de control, nesprin-2G HL (sin cabeza), mTFP1, venus, y TSmod de una fuente comercial. Propagar todos los plásmidos de ADN y purificarlos usando cepas estándar de E. coli, tales como DH5-α, como se ha descrito previamente 12, 13. </li></ol> 2. Las células transfectar con nesprin-2G y otro ADN plásmido <ol><li> Se cultivan las células de fibroblastos NIH 3T3 a 70-90% de confluencia en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un incubador de cultivo celular estándar con la temperatura (37 ° C) y la regulación de CO 2 (5%). Para el medio de crecimiento celular, utilice medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%. </li><li> En una campana de cultivo celular, se elimina el medio y enjuague cada pocillo con aproximadamente 1 ml de un medio de células de suero reducido. Añadir 800! L de medio de células de suero reducido a cada pocilloy colocar la cámara de 6 pocillos en la incubadora. </li><li> Pipetear 700 l de medio de células de suero reducido en un tubo de 1,5 ml con 35 l de solución de vehículo lipídico para formar el &quot;lipomix&quot;. Mezclar con la pipeta. Etiquetar el tubo con una &quot;L&quot; </li><li> Reunir seis tubos de 1,5 mL y los etiquetar 1 a 6. Pipetear 100 l de medio de células de suero reducido en cada tubo. <ol><li> Uso de la concentración de plásmido de ADN de la etapa 1, una pipeta 2 g de nesprin 2G-TS en los tubos 1 y 2. Pipetear 2 g de nesprin-HL en tubos 3 y 4. pipeta de 1 g de MTFP en el tubo 5. Pipetear 1 g de mVenus en el tubo 6. no vuelva a usar las puntas de pipeta en el pipeteado de diferentes tipos de ADN. </li></ol></li><li> Pipetear 100 l de la lipomix desde el tubo de &quot;L&quot; en cada tubo marcado (1-6) y mezclar mediante pipeteo repetido. Usar una pipeta limpia para cada tubo. Incubar durante 10-20 min. </li><li> Añadir 200! L de cada tubo marcado a un bien en la cámara de 6 pocillos con 70-90% de confluenciaCélulas. Etiqueta de la parte superior de cada pocillo con el ADN correspondiente añadió. Coloque la cámara de 6 pocillos en un incubador durante 4-6 h. </li><li> Aspirar el medio y añadir 12 ml de medio de células de suero reducido para enjuagar. Aspirar el medio de células de suero reducido, añadir 2 ml de tripsina a cada pocillo, y colocar la placa de 6 pocillos en la incubadora (5-15 min). </li><li> Mientras que las células se desprenden en la incubadora, capa 6 de vidrio con fondo de la visualización de los platos con una capa de fibronectina a una concentración de 20 mg / ml disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Permitir los platos para recubrir la superficie en la campana de cultivo de células (aproximadamente 20 min). </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM una vez que se separan las células. </li><li> La transferencia de los contenidos de cada pocillo a un tubo de centrífuga de 15 ml etiquetados y girar hacia abajo en 90 xg durante 5 min en una centrífuga de rotor de balanceo. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender cada sedimento celular en 1.000 l de DMEM por mezcla pipeta. </li><li> Aspirar la mezcla de fibronectina a partir de laplatos de vidrio y pipeta de 1.000 l de cada suspensión celular en los platos de vidrio. </li><li> Después de que las células se depositan en el fondo de las placas de vidrio (~ 15 min), añadir otro 1 ml de DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep a cada pocillo y colocar en el incubador de células. Dejar que las células se unan y expresan sensor durante al menos 18-24 h. NOTA: Las células se transfectaron utilizando reactivos de transfección de lípidos catiónicos comerciales (véase la Tabla de Materiales). Alternativamente, las líneas celulares estables se pueden seleccionar mediante el uso de un plásmido con un gen que confiere resistencia a una toxina (los plásmidos pcDNA para nesprin-TS y -HL están disponibles en un sitio web repositorio de ADN (véase la Tabla de Materiales) proporcionar células que expresan la resistencia a geneticina ). Además, los métodos de infección viral (lentivirus, retrovirus, o adenovirus) se pueden utilizar para expresar el sensor en las células que son difíciles de transfectar. </li><li> Además de nesprin-TS, transfectar células adicionales con el nesprin HL cero porde control CE, tal como se describe en los pasos 2.1-2.12; TSmod también se puede utilizar como un control de fuerza cero y debe exhibir FRET similar a nesprin-HL. </li><li> células transfectar con mTFP1 y venus para generar huellas espectrales (ver paso 4). NOTA: mTFP1 y venus típicamente expresan en niveles más altos que nesprin-TS, y como tal, pueden necesitar ser transfectadas para lograr niveles similares de expresión cantidades menores de ADN. </li></ol> 3. Verificar la eficacia de transfección <ol><li> Aproximadamente 18-24 h después de completar la transfección, usar un microscopio de fluorescencia invertida para examinar la eficacia de la transfección mediante la comparación del número de células fluorescentes para el número total de células en vista (por lo general 5-30%). <ol><li> Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una frecuencia de excitación cerca de 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venus) y un filtro de emisión centrada cerca de 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venus). NOTA: Como alternativa, GFP conjuntos de filtros capturará una combinación de mTFP1 y cinconus emisiones y permitirán la confirmación de la eficacia de transfección. </li></ol></li><li> células vivas imágenes dentro de 48 horas después de la transfección. <ol><li> Alternativamente, fijar las células en paraformaldehído al 4% (en PBS con calcio y magnesio) durante 5 min, tienda en PBS, y la vista después de 48 h 8. NOTA: Más allá de 48 h, la calidad de la señal y la fuerza decae. La fijación de las células conserva su estado, incluyendo la FRET ser expresado 8; sin embargo, las células sólo deben ser reflejados en PBS, como medio de montaje puede afectar FRET 14. Las células fijadas sólo pueden ser comparadas con otras células fijas, ya que puede haber un cambio en la expresión. Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Usar los equipos de protección personal (EPP) apropiado. </li></ol></li></ol> 4. Captura de Huellas dactilares espectral de mTFP1 y Venus fluoróforos de desmezcla espectral <ol><li> En una campana de cultivo de células, sustituir el medio celular con mediu de formación de imágenesm (HEPES-tamponada) suplementado con suero bovino fetal al 10%. </li><li> Colocar las cápsulas de visión en un (37 ° C) platina del microscopio confocal de temperatura controlada. </li><li> Coloque el plato de visualización de cristal con células transfectadas con mTFP1 sobre el objetivo de aceite a 60X de ampliación con una apertura numérica de 1,4. NOTA: El aceite se utiliza en un microscopio de barrido láser en el objetivo 60X para parecerse estrechamente el índice de refracción del sustrato de vidrio. El aceite se coloca en la parte superior de la lente objetivo y entra en contacto directo con el cubreobjetos de vidrio. </li><li> Localizar mTFP1 células que expresan con una fuente de excitación 458 nm y un filtro de paso de banda de emisión centrada a 500 nm. </li><li> Con una célula fluorescente en el campo de visión, seleccionar el modo de detección espectral ( &quot;Modo Lambda&quot; en el software utilizado aquí) y capturar la imagen espectral (Figura 3-1); incluir todas las frecuencias más allá de 458 nm utilizando incrementos de 10 nm (Figura 3-3). Seleccionar un brillante FLUORESCregión ENT (ROI) en la celda (radio de 20 píxeles). NOTA: La forma espectral de la mTFP1-expresión de ROI debe permanecer relativamente constante a través de la célula. Si la forma varía considerablemente, vuelva a ajustar el láser y obtener la configuración para mejorar la relación señal-ruido. </li><li> Añadir significa el retorno de la inversión fluorescente, intensidad normalizada a la base de datos espectral haciendo clic en &quot;guardar espectros a la base de datos.&quot; </li><li> Optimizar la potencia del láser y ganancia de tal manera que se consigue una buena relación señal-ruido. Ajustes variarán para diferentes equipos. El uso de células no fluorescentes, no transfectadas como referencia de fondo, aumentar la ganancia y la potencia hasta que las células son brillantes, pero no más allá del rango dinámico del detector (punto de saturación). células de fondo no deben tener fluorescencia detectable después de promediar. </li><li> Repetir el proceso para las células transfectadas con venus con las siguientes excepciones: <ol><li> Asegúrese de que la frecuencia de excitación es a 515 nm y que el filtro de paso de banda es centered cerca de 530 nm cuando la localización de las células venus-expresan. </li><li> En &quot;Modo espectral,&quot; utilizar una frecuencia de excitación de 515 nm en lugar de 458 nm. </li></ol></li></ol> 5. Capturar imágenes sin mezclar <ol><li> Cambiar el modo de captura a &quot;Spectral desmezcla.&quot; </li><li> Añadir las huellas espectrales de venus y mTFP1 en los canales de desmezcla (Figura 3, Arrow-2). </li><li> Ajuste el láser de excitación de nuevo a una fuente de argón 458 nm. </li><li> Coloque el plato de visión nesprin-TS encima del objetivo aceite de 60X. </li><li> Después de centrarse en una célula fluorescente con la expresión suficientemente brillante, ajustar la potencia de ganancia y láser para optimizar la relación señal-ruido. NOTA: Dado que la eficiencia de FRET de nesprin-TS es cerca de 20%, la imagen venus sin mezclar debe ser sustancialmente dimmer la imagen mTFP1 sin mezclar que. Una vez que el ajuste de la potencia y la ganancia aceptable se han determinado de forma iterativa, estos parámetros deben permanecer constantes para todas las imágenes captured. </li><li> Captura de un mínimo de 15-20 imágenes de células nesprin-TS con brillo relativamente similar y evitar la saturación excesiva pixel (todos los píxeles saturados se eliminan durante el procesamiento de imágenes). </li><li> Repetir el proceso de captura de imagen con células nesprin-HL utilizando parámetros de imagen idénticos. </li></ol> 6. Procesamiento y Análisis de Imágenes Relación imagen <ol><li> Usando el software de fuente abierta ImageJ (Fiji) (http://fiji.sc/), abiertos imágenes de formato nativo utilizando BioFormats Reader. </li><li> Pre-proceso de las imágenes y calcular el ratio de imágenes utilizando protocolos previamente establecidos 15. </li></ol>

<ol><li>Conway, D. E., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+cellular+mechanotransduction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis.</a> J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Austen, K., Ringer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+rigidity+sensing+by+talin+isoform-specific+mechanical+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages.</a> Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).</li>
<li>Meng, F., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dynamic+cytoplasmic+forces+with+a+compliance-matched+FRET+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor.</a> J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).</li>
<li>Borghi, N., Sorokina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+under+constitutive+actomyosin-generated+tension+that+is+increased+at+cell-cell+contacts+upon+externally+applied+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).</li>
<li>Cai, D., Chen, S. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Feedback+through+E-Cadherin+Promotes+Direction+Sensing+during+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration.</a> Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Shear+Stress+on+Endothelial+Cells+Modulates+Mechanical+Tension+across+VE-Cadherin+and+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio+CB%22%5BJournal%5D)">Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1.</a> Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).</li>
<li>Brenner, M. D., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact%2C+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li>
<li>Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282499670_Controlling_Cell_Geometry_Affects_the_Spatial_Distribution_of_Load_Across_Vinculin">Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).</li>
<li>Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+molecular+interactions+of+linker+of+nucleoskeleton+and+cytoskeleton+%28LINC%29+complex+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins.</a> J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> J Vis Exp. (6), e247(2007).</li>
<li>Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+mounting+and+sealing+with+nail+polish+of+cell+specimens+lead+to+incorrect+FRET+measurements+using+acceptor+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching.</a> Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).</li>
<li>Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+activity+in+live+embryos+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).</li>
<li>Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+deformation+of+the+nucleus+in+micropipette+aspiration+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment.</a> J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).</li>
<li>Wang, N., Naruse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).</li>
<li>Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+stabilize+the+position+of+intranuclear+DNA+through+mechanical+connection+with+the+nucleus+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells.</a> FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).</li>
<li>Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+arrays+of+nuclear+envelope+proteins+harness+retrograde+actin+flow+for+nuclear+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement.</a> Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+imaging%2C+and+analysis+of+FRET-based+tension+sensors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells.</a> Methods Cell Biol. , (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un método y la demostración de imágenes de células vivas de la tensión mecánica a través de nesprin-2G, una proteína en el complejo nuclear de LINC, se esbozó anteriormente. Antes de este trabajo, varias técnicas, tales como la aspiración de micropipeta, magnético en perlas de citometría, y microscópica láser de ablación, se han utilizado para aplicar tensión en el núcleo de la célula y para medir sus propiedades de material a granel 16, 17, <sup clas...

Sensible a la Fuerza, los sensores FRET codificados genéticamente han surgido recientemente como una herramienta importante para la medición de fuerzas de tracción a base de en células vivas, proporcionando información sobre cómo las fuerzas mecánicas son aplicada a través de proteínas de 1, 2, 3, 4. Con estas herramientas, los investigadores pueden tomar imágenes de forma no invasiva fuerzas intracelulares en células vivas utilizando microscopios fluorescentes convencionales. Estos sensores consisten en una FRET-par (proteínas donantes y fluorescentes aceptor, más frecuentemente un donante azul y el aceptor de color amarillo) separados por un péptido elástico 3. En contraste con C- o etiquetado N-terminal, este sensor se inserta en un sitio interno de una proteína para medir la fuerza mecánica transmitida a través de la proteína, comportándose como un medidor de deformación molecular. Aumento de la tensión mecánica a través de los resultados del sensor en un aumento de la distancia entre la FRET-paire, resultando en la disminución de FRET 3. Como resultado, la FRET es inversamente proporcional a la fuerza de tracción. Estos sensores a base de fluorescentes han sido desarrollados para las proteínas de adhesión focal (vinculina 3 y talina 4), proteínas del citoesqueleto (α-actinina 5), y proteínas de unión célula-célula (E-cadherina 6, 7, VE-cadherina 8, y PECAM 8). El engarce elástico usado con más frecuencia y bien caracterizado en estos biosensores se conoce como TSmod y consiste en una secuencia repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) 8, que se deriva de la flagelliform proteína de seda de araña. TSmod se ha demostrado que comportarse como un nano-resorte elástico lineal, con la capacidad de respuesta de FRET a 1 a 5 pN de fuerza de tracción 3. Diferentes longitudes de flagelliform se pueden utilizar para alterar la dinámica range de sensibilidad TSmod FRET-fuerza 9. Además de flagelliform, espectrina repite 5 y vilina péptido pieza de cabeza (conocido como HP35) 4 se han utilizado como los péptidos elásticos entre FRET pares en biosensores fuerza similar 4. Por último, un informe reciente mostró que TSmod también se puede utilizar para detectar las fuerzas de compresión 10. Recientemente hemos desarrollado un sensor de fuerza para el enlazador de la núcleo-citoesqueleto (LINC) complejo de proteínas Nesprin2G utilizando TSmod inserta en una proteína truncada Nesprin2G desarrollado previamente conocida como mini-Nesprin2G (Figura 2C), que se comporta de manera similar a endógena nesprin-2G 11. El complejo LINC contiene múltiples proteínas que conducen desde el exterior hacia el interior del núcleo, que une el citoesqueleto citoplásmico de la lámina nuclear. Nesprin-2G es vinculante una proteína estructural tanto a lacitoesqueleto de actina en el citoplasma y a las proteínas de sol en el espacio perinuclear. Utilizando nuestro biosensor, hemos sido capaces de demostrar que nesprin-2G está sujeta a la tensión actomyosin depende en fibroblastos NIH3T3 2. Esta fue la primera vez que la fuerza se midió directamente a través de una proteína en el complejo LINC nuclear, y es probable que se convierta en una herramienta importante para entender el papel de la fuerza en el núcleo en mecanobiología. El protocolo a continuación proporciona una metodología detallada de cómo utilizar el sensor de fuerza nesprin-2G, incluyendo la expresión del sensor de tensión nesprin (nesprin-TS) en células de mamífero, así como la adquisición y análisis de imágenes de FRET de células que expresan Nesprin- TS. El uso de un microscopio confocal invertido equipado con un detector espectral, una descripción de cómo medir la emisión sensibilizada FRET usando desmezcla espectral y está provisto de imágenes FRET radiométrica. Las imágenes radiométricas de salida pueden ser usados ​​para hacer qua relativacomparaciones de fuerza ntitative. Mientras que este protocolo se centra en la expresión de nesprin-TS en los fibroblastos, es fácilmente adaptable a otras células de mamífero, incluyendo las dos líneas celulares y células primarias. Además, este protocolo que se refiere a la adquisición de imágenes y el análisis FRET puede adaptarse fácilmente a otros biosensores de fuerza basados ​​en FRET que han sido desarrollados para otras proteínas.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS ADN</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/68127/</td></tr> <tr><td>Nesprin-HL ADN</td><td>Addgene</td><td>68128</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/68128/</td></tr> <tr><td>mTFP1</td><td>ADN Addgene</td><td>54613</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/54613/</td></tr> <tr><td>mVenus ADN</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>Recuperar de https://www.addgene.org/27793/</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>Recuperar de</td></tr> <tr><td>células https://www.addgene.org/26021/ competentes Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medios LB líquidos</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>10855001 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>Placas de cultivo bacteriano LB sólido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US</td></tr><tr>Espectrofotómetro de<td>ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>cubeta de cuarzo</td><td>Biorad</td><td>1702504</td><td>Cubeta para SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>kit de aislamiento de ADN</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>Multipocillo Placa de cultivo de polistrene de 6 pocillos</td></tr><tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco, (DMEM) medios celulares</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>Suero bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>Medios celulares de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Medio de suero reducido, lipídico "optimem"</td></tr><tr><td> Carrier Solution</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reactivo lipídico, "Lipofectamine 2000"</td></tr><tr><td>1,5 mL tubo de plástico estéril</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td></tr><tr><td>plato de visualización para microscopio con fondo de vidrio</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Plato de 35 mm con pozo de fondo de 20 mm #1.5 vidrio</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>fibronectina proteína humana, plasma</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td> Tubo de centrífuga estéril <td>de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td></tr><tr><td>15 mL</td> Centrífuga de rotor oscilante <td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>Rotor oscilante thermo electron 236</td></tr><tr><td>campana de bioseguridad para cultivos celulares</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de cultivos celulares climatizados</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente de campo amplio LED invertido</td><td>Life technologies</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Clear HEPES Medios de imagen tamponados</td><td>Sondas moleculares</td><td></td><td></td>A14291DJ</tr><tr><td>Suero fetal bovino Serum</td><td>Life technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Confocal invertido con temperatura controlada con fuentes láser de 458 y 515 nm&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 710-w/detector espectral META</td><td></td></tr><tr><td>Medios de crecimiento externo</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Fibroblastos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para el uso de transferencia de energía de resonancia de förster (fret) y forzar biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de linc

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Se ha planteado la hipótesis de que el complejo LINC es la estructura crítica que media la transferencia de fuerzas mecánicas desde el citoesqueleto hasta el núcleo. Nesprin-2G es un componente clave del complejo LINC que conecta el citoesqueleto de actina con las proteínas de membrana (proteínas de dominio SUN) en el espacio perinuclear. Estas proteínas de membrana se conectan a las láminas dentro del núcleo. Recientemente, se clonó una sonda de fuerza de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster en mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (sensor de tensión)) y se utilizó para medir la tensión a través de Nesprin-2G en fibroblastos NIH3T3 vivos. Este artículo describe el proceso de uso de Nesprin-TS para medir las fuerzas del complejo LINC en fibroblastos NIH3T3. Para extraer información FRET de Nesprin-TS, también se presenta un esquema de cómo mezclar espectralmente imágenes espectrales sin procesar en canales fluorescentes aceptores y donantes. Mediante el uso de software de código abierto (ImageJ), las imágenes se preprocesan y se transforman en imágenes radiométricas. Finalmente, se presentan los datos FRET de Nesprin-TS, junto con estrategias sobre cómo comparar datos entre diferentes grupos experimentales.

Siguiendo el protocolo anterior, el plásmido de ADN fue adquirido desde el repositorio de ADN y se transformó en células de E. coli. E. coli que expresan el DNA sensor fueron seleccionados de placas LB / ampicilina y se amplificaron en un caldo LB líquido. Después de la amplificación de los vectores, los plásmidos de ADN se purificaron en tampón Tris-EDTA utilizando un estándar, disponible comercialmente kit de aislamiento de ADN. El uso de un espectrofotómetro, el ADN ...

Recientemente se han desarrollado varios biosensores de fuerza basados en FRET, que permiten la resolución de la fuerza intracelular específica de la proteína. En este protocolo, demostramos cómo uno de estos sensores, diseñado para el enlazador de la proteína del complejo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, se puede utilizar para medir las fuerzas de actomiosina en el complejo nuclear LINC.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar las fuerzas sobre el enlazador del citoesqueleto del nucleoesqueleto, o complejo LINC, a través de la microscopía FRET en células vivas a través de un biosensor diseñado para la proteína del complejo LINC, nesprin-2G. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecanotransducción, como las fuerzas ejercidas sobre las proteínas en el núcleo de las células vivas, y cómo estas fuerzas cambian en condiciones variantes. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para medir niveles muy pequeños de fuerza sobre proteínas y células vivas.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para capturar imágenes. Optimizar la potencia y la ganancia del láser del microscopio para recibir una buena señal entre todos los grupos experimentales es difícil. Para empezar, cultive células blast de fibra NIH 3T3 hasta una confluencia de entre el 70 % y el 90 % en una placa de cultivo celular de seis pocillos en una incubadora de cultivo celular estándar con regulación de temperatura y CO2.En una campana de cultivo celular, retire el medio y enjuague cada pocillo con aproximadamente 1 mililitro de un medio de células séricas reducido. Agregue 800 microlitros de medio de células séricas reducido a cada pocillo y coloque la cámara de seis pocillos en la incubadora. A continuación, pipetee 700 microlitros de medio de células séricas reducidas en un tubo de 1,5 mililitros marcado como L con 35 microlitros de solución portadora de lípidos para formar la mezcla lipo.Mezclar la suspensión mediante pipeteo. A continuación, pipetee 100 microlitros del medio de células séricas reducidas en cada uno de los seis tubos de 1,5 mililitros etiquetados del uno al seis. Pipetear el ADN plasmático para el sensor de tensión nesprin, el control de fuerza cero sin cabeza nesprin, mTFP1 y venus en los tubos del uno al seis, como se describe en el protocolo de texto.No reutilice las puntas de pipeta al pipetear diferentes tipos de ADN. A continuación, pipetee 100 microlitros de la mezcla lipo del tubo L en cada tubo etiquetado y mezcle mediante pipeteo repetido, utilizando una pipeta limpia para cada tubo. Incuba la suspensión durante 10 a 20 minutos.A continuación, agregue 200 microlitros de cada tubo marcado a un pocillo de la cámara preparada de seis pocillos que contiene celdas. Etiquete la parte superior de cada pocillo con el ADN correspondiente agregado. Luego, coloque la cámara de seis pocillos en una incubadora durante cuatro a seis horas.Después de la incubación, aspire el medio y agregue de uno a dos mililitros de medio de células séricas reducidas para enjuagar. Aspire el medio de células séricas reducido y agregue dos mililitros de tripsina a cada pocillo antes de colocar el plato de seis pocillos en la incubadora durante cinco a 15 minutos. Mientras las células se desprenden en la incubadora, cubra seis platos de visualización con fondo de vidrio con una capa de fibronectina a una concentración de 20 microgramos por mililitro disueltos en solución salina tamponada con fosfato.Deje que los platos cubran la superficie con la campana de cultivo celular. Neutralizar la tripsina añadiendo dos mililitros de DMEM una vez que se hayan desprendido las células. Luego, transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros etiquetado y gire a 90 veces g durante cinco minutos en una centrífuga de rotor oscilante.Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet de celda en 1.000 microlitros de DMEM con una pipeta. Aspirar la mezcla de fibronectina de las placas de vidrio y pipetear 1.000 microlitros de cada suspensión celular en las placas. Después de que las células se asienten en el fondo de los platos de vidrio, agregue otro mililitro de medio a cada pocillo.Permita que las células se conecten y expresen el sensor en la incubadora de células durante al menos 18 a 24 horas. Para verificar la eficiencia de la transfección, utilice un microscopio fluorescente equipado con una frecuencia de excitación cercana a los 462 nanómetros para mTFP1, o 525 nanómetros para venus. Utilice un filtro de emisión centrado cerca de 492 nanómetros para mTFP1, o de 525 nanómetros para venus.Aproximadamente de 18 a 24 horas después de completar la transfección, use un microscopio fluorescente invertido para examinar la eficiencia de la transfección comparando el número de células fluorescentes con el número total de células a la vista. Si no se pueden obtener imágenes de células vivas dentro de las 48 horas posteriores a la transfección, fije las células en paraformaldehído al 4% durante cinco minutos. Permita que las células expresen el sensor durante 24 a 48 horas antes de la fijación.Guarde las celdas en PBS y véalas después de 48 horas. En una campana de cultivo celular, reemplace el medio celular con un medio de imagen complementado con suero bovino fetal al 10%. Coloque las antenas de visualización en una platina de microscopio confocal con temperatura controlada.Coloque la antena de visualización de vidrio con celdas transfectadas mTFP1 sobre el objetivo de aceite con un aumento de 60X con una apertura numérica de 1,4. Localice las células que expresan mTFP1 en modo fluorescente de campo amplio. Con una célula fluorescente en el campo de visión, seleccione el modo de detección espectral y capture la imagen espectral.Incluya todas las frecuencias más allá de 458 nanómetros usando incrementos de 10 nanómetros. Seleccione una región fluorescente brillante en la celda. Agregue la media del ROI fluorescente como la intensidad normalizada a la base de datos espectral haciendo clic en Guardar espectros en la base de datos.Optimice la potencia y la ganancia del láser de modo que se logre una buena relación señal/ruido. La configuración variará para diferentes equipos. Repita el proceso para las células que expresan Venus y permanezca en modo espectral.Utilice una frecuencia de excitación de 488 nanómetros en lugar de 458 nanómetros. Ajuste la configuración de energía según sea necesario, pero no cambie las frecuencias de emisión. Seleccione un ROI fluorescente brillante de alrededor de un radio de 20 píxeles.Agregue la media del ROI fluorescente como la intensidad normalizada a la base de datos espectral, haciendo clic en Guardar espectros en la base de datos. Para capturar las imágenes sin mezclar, primero cambie el modo de captura a desmezcla espectral. Agregue las huellas espectrales de Venus y mTFP1 a los canales de desmezcla.Vuelva a colocar el láser de excitación en una fuente de argón de 458 nanómetros. Coloque el plato de visualización del sensor de tensión nesprin sobre el objetivo de aceite 60X. Después de enfocar una celda fluorescente con una expresión suficientemente brillante, ajuste la ganancia y la potencia del láser para optimizar la relación señal/ruido.Capture un mínimo de 15 a 20 imágenes de celdas del sensor de tensión nesprin con un brillo relativamente similar y evite la saturación excesiva de píxeles. Repita el proceso de captura de imágenes con celdas sin cabeza nesprin utilizando parámetros de imagen idénticos. Aquí se muestra una imagen representativa ampliada 10X de fibroblastos 3T3 transfectados con el sensor de tensión nesprin utilizando un portador mediado por lípidos.Normalmente, solo se transfecta una fracción de las células en un campo de visión determinado. Aquí se muestra un par representativo de dos núcleos 3T3 que expresan nesprin-TS en los canales de Venus y mTFP espectralmente no mezclados. En el panel de la derecha se muestra una imagen en color combinada de los dos canales.A continuación se muestra una muestra representativa de núcleos enmascarados de nesprin-TS de células MDCK que expresan de forma estable en sustratos con y sin patrones. Las imágenes de relación se definen como la relación del canal de Venus dividida por el canal mTFP y se pueden utilizar para hacer comparaciones de fuerzas cuantitativas relativas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas ocho horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar etiquetar cuidadosamente los tubos de ADN durante la transfección y mantener constantes los parámetros de imagen mientras se capturan imágenes de resultados espectrales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar células con el sensor de tensión nesprin y capturar imágenes resueltas espectralmente en el índice FRET de la computadora que se correlaciona con la fuerza en el sensor de tensión. Aunque en este caso, se utiliza un sensor FRET para nesprin, también se puede aplicar a otras proteínas de la célula donde se desea medir la fuerza.

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este artículo se describe el uso de pinzas magnéticas para estudiar el efecto de la fuerza en la proteólisis enzimática a nivel sola molécula de una manera altamente paralelizable.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Los celulosomas son complejos multienzimáticos diseñados para digerir la celulosa. Se utilizó SMFS basado en AFM para estudiar las propiedades mecánicas y la configuración de plegamiento de los ensamblajes de proteínas asociados al celulosoma. Presentamos un flujo de trabajo completo para la inmovilización de proteínas, la adquisición de datos y el análisis de datos para estudiar las interacciones de los complejos receptor-ligando individuales involucrados en el ensamblaje del celulosoma.

Investigación de sistemas receptores-ligandos del celulosoma con espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM

Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.

FIBS habilitadas no invasiva perfiles metabólicos

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

En este protocolo, se describe un método de la micropipeta para aplicar directamente una fuerza controlada al núcleo en una célula viva. Este ensayo permite interrogatorio de nucleares propiedades mecánicas en la célula viva, adherente.

Un sondeo de la fuerza directa para medir la integración mecánica entre el núcleo y el citoesqueleto

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

La espectroscopia de fuerza de conjunto (EFS) es una técnica robusta para el despliegue mecánico y la detección en tiempo real de un conjunto de estructuras biomoleculares en campos biofísicos y biosensibles.

Espectroscopía de fuerza de conjunto por fuerzas de cizallamiento

Aprende a medir fuerzas mecánicas en el complejo nuclear LINC mediante microscopía FRET y biosensores específicos para Nesprin-2G en células NIH 3T3 vivas. Este método permite cuantizar dinámica de fuerzas en mecanotransducción celular.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC (Video) | JoVE Journal

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Explorar más videos