Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

El objetivo general de este procedimiento es determinar las fuerzas sobre el enlazador del citoesqueleto del nucleoesqueleto, o complejo LINC, a través de la microscopía FRET en células vivas a través de un biosensor diseñado para la proteína del complejo LINC, nesprin-2G. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecanotransducción, como las fuerzas ejercidas sobre las proteínas en el núcleo de las células vivas, y cómo estas fuerzas cambian en condiciones variantes. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para medir niveles muy pequeños de fuerza sobre proteínas y células vivas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para capturar imágenes. Optimizar la potencia y la ganancia del láser del microscopio para recibir una buena señal entre todos los grupos experimentales es difícil. Para empezar, cultive células blast de fibra NIH 3T3 hasta una confluencia de entre el 70 % y el 90 % en una placa de cultivo celular de seis pocillos en una incubadora de cultivo celular estándar con regulación de temperatura y CO2.

En una campana de cultivo celular, retire el medio y enjuague cada pocillo con aproximadamente 1 mililitro de un medio de células séricas reducido. Agregue 800 microlitros de medio de células séricas reducido a cada pocillo y coloque la cámara de seis pocillos en la incubadora. A continuación, pipetee 700 microlitros de medio de células séricas reducidas en un tubo de 1,5 mililitros marcado como L con 35 microlitros de solución portadora de lípidos para formar la mezcla lipo.

Mezclar la suspensión mediante pipeteo. A continuación, pipetee 100 microlitros del medio de células séricas reducidas en cada uno de los seis tubos de 1,5 mililitros etiquetados del uno al seis. Pipetear el ADN plasmático para el sensor de tensión nesprin, el control de fuerza cero sin cabeza nesprin, mTFP1 y venus en los tubos del uno al seis, como se describe en el protocolo de texto.

No reutilice las puntas de pipeta al pipetear diferentes tipos de ADN. A continuación, pipetee 100 microlitros de la mezcla lipo del tubo L en cada tubo etiquetado y mezcle mediante pipeteo repetido, utilizando una pipeta limpia para cada tubo. Incuba la suspensión durante 10 a 20 minutos.

A continuación, agregue 200 microlitros de cada tubo marcado a un pocillo de la cámara preparada de seis pocillos que contiene celdas. Etiquete la parte superior de cada pocillo con el ADN correspondiente agregado. Luego, coloque la cámara de seis pocillos en una incubadora durante cuatro a seis horas.

Después de la incubación, aspire el medio y agregue de uno a dos mililitros de medio de células séricas reducidas para enjuagar. Aspire el medio de células séricas reducido y agregue dos mililitros de tripsina a cada pocillo antes de colocar el plato de seis pocillos en la incubadora durante cinco a 15 minutos. Mientras las células se desprenden en la incubadora, cubra seis platos de visualización con fondo de vidrio con una capa de fibronectina a una concentración de 20 microgramos por mililitro disueltos en solución salina tamponada con fosfato.

Deje que los platos cubran la superficie con la campana de cultivo celular. Neutralizar la tripsina añadiendo dos mililitros de DMEM una vez que se hayan desprendido las células. Luego, transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros etiquetado y gire a 90 veces g durante cinco minutos en una centrífuga de rotor oscilante.

Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet de celda en 1.000 microlitros de DMEM con una pipeta. Aspirar la mezcla de fibronectina de las placas de vidrio y pipetear 1.000 microlitros de cada suspensión celular en las placas. Después de que las células se asienten en el fondo de los platos de vidrio, agregue otro mililitro de medio a cada pocillo.

Permita que las células se conecten y expresen el sensor en la incubadora de células durante al menos 18 a 24 horas. Para verificar la eficiencia de la transfección, utilice un microscopio fluorescente equipado con una frecuencia de excitación cercana a los 462 nanómetros para mTFP1, o 525 nanómetros para venus. Utilice un filtro de emisión centrado cerca de 492 nanómetros para mTFP1, o de 525 nanómetros para venus.

Aproximadamente de 18 a 24 horas después de completar la transfección, use un microscopio fluorescente invertido para examinar la eficiencia de la transfección comparando el número de células fluorescentes con el número total de células a la vista. Si no se pueden obtener imágenes de células vivas dentro de las 48 horas posteriores a la transfección, fije las células en paraformaldehído al 4% durante cinco minutos. Permita que las células expresen el sensor durante 24 a 48 horas antes de la fijación.

Guarde las celdas en PBS y véalas después de 48 horas. En una campana de cultivo celular, reemplace el medio celular con un medio de imagen complementado con suero bovino fetal al 10%. Coloque las antenas de visualización en una platina de microscopio confocal con temperatura controlada.

Coloque la antena de visualización de vidrio con celdas transfectadas mTFP1 sobre el objetivo de aceite con un aumento de 60X con una apertura numérica de 1,4. Localice las células que expresan mTFP1 en modo fluorescente de campo amplio. Con una célula fluorescente en el campo de visión, seleccione el modo de detección espectral y capture la imagen espectral.

Incluya todas las frecuencias más allá de 458 nanómetros usando incrementos de 10 nanómetros. Seleccione una región fluorescente brillante en la celda. Agregue la media del ROI fluorescente como la intensidad normalizada a la base de datos espectral haciendo clic en Guardar espectros en la base de datos.

Optimice la potencia y la ganancia del láser de modo que se logre una buena relación señal/ruido. La configuración variará para diferentes equipos. Repita el proceso para las células que expresan Venus y permanezca en modo espectral.

Utilice una frecuencia de excitación de 488 nanómetros en lugar de 458 nanómetros. Ajuste la configuración de energía según sea necesario, pero no cambie las frecuencias de emisión. Seleccione un ROI fluorescente brillante de alrededor de un radio de 20 píxeles.

Agregue la media del ROI fluorescente como la intensidad normalizada a la base de datos espectral, haciendo clic en Guardar espectros en la base de datos. Para capturar las imágenes sin mezclar, primero cambie el modo de captura a desmezcla espectral. Agregue las huellas espectrales de Venus y mTFP1 a los canales de desmezcla.

Vuelva a colocar el láser de excitación en una fuente de argón de 458 nanómetros. Coloque el plato de visualización del sensor de tensión nesprin sobre el objetivo de aceite 60X. Después de enfocar una celda fluorescente con una expresión suficientemente brillante, ajuste la ganancia y la potencia del láser para optimizar la relación señal/ruido.

Capture un mínimo de 15 a 20 imágenes de celdas del sensor de tensión nesprin con un brillo relativamente similar y evite la saturación excesiva de píxeles. Repita el proceso de captura de imágenes con celdas sin cabeza nesprin utilizando parámetros de imagen idénticos. Aquí se muestra una imagen representativa ampliada 10X de fibroblastos 3T3 transfectados con el sensor de tensión nesprin utilizando un portador mediado por lípidos.

Normalmente, solo se transfecta una fracción de las células en un campo de visión determinado. Aquí se muestra un par representativo de dos núcleos 3T3 que expresan nesprin-TS en los canales de Venus y mTFP espectralmente no mezclados. En el panel de la derecha se muestra una imagen en color combinada de los dos canales.

A continuación se muestra una muestra representativa de núcleos enmascarados de nesprin-TS de células MDCK que expresan de forma estable en sustratos con y sin patrones. Las imágenes de relación se definen como la relación del canal de Venus dividida por el canal mTFP y se pueden utilizar para hacer comparaciones de fuerzas cuantitativas relativas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas ocho horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar etiquetar cuidadosamente los tubos de ADN durante la transfección y mantener constantes los parámetros de imagen mientras se capturan imágenes de resultados espectrales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar células con el sensor de tensión nesprin y capturar imágenes resueltas espectralmente en el índice FRET de la computadora que se correlaciona con la fuerza en el sensor de tensión. Aunque en este caso, se utiliza un sensor FRET para nesprin, también se puede aplicar a otras proteínas de la célula donde se desea medir la fuerza.