Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

El objetivo general de este procedimiento es administrar células tumorales directamente al hígado murino para el modelado experimental de la metástasis hepática del cáncer de mama. Este método se puede utilizar para estudiar las etapas posteriores de la cascada metastásica en el hígado murino. Incluyendo la extravasación de células de cáncer de mama, la siembra, la muerte, la proliferación y las decisiones de latencia, así como el excrecencia.

La principal ventaja de esta técnica es que administra las células tumorales directamente al hígado sin la extirpación del bazo ni la metástasis multiorgánica concomitante. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la inyección de la vena porta requiere manipulaciones precisas que se basan en la vigilancia anatómica directa. Alexandra Quackenbush, estudiante de posgrado en el laboratorio de Pepershadine, me ayudará con este procedimiento.

Antes de comenzar el procedimiento, limpie todas las superficies del área quirúrgica con lejía al 10%. Una hora antes de las inyecciones, trate a ratones hembra balb/c de ocho a 15 semanas de edad con 100 microlitros de analgesia por vía subcutánea para controlar el dolor. Aplica ungüento en los ojos del animal.

A continuación, coloque a los ratones en posición supina y confirme el nivel adecuado de sedación mediante un pellizco con los dedos de los pies. A continuación, desinfecte las áreas quirúrgicas y circundantes del animal, incluida la cola, con tres toallitas estériles alternas empapadas en gasa al 2% con clorhexidina y dos toallitas con almohadillas de preparación con alcohol. Después de la última toallita con clorhexidina, use un bisturí estéril para hacer una incisión de una pulgada en la piel entre los planos mediano y sagital en el lado izquierdo del ratón, comenzando justo debajo de las costillas y terminando por encima del cuarto pezón inguinal de la glándula mamaria, seguido de una incisión similar de una pulgada a través del peritoneo.

Ahora pipetea las células tumorales hacia arriba y hacia abajo varias veces para volver a suspender la solución celular, y carga una jeringa de aguja removible de 25 microlitros, equipada con una aguja de calibre 32, con 10 microlitros de las células. Presione el émbolo hasta que las células estén en la punta de la aguja y el émbolo esté al volumen adecuado para la inyección. Limpie el exterior de la aguja cargada con una almohadilla con alcohol estéril para eliminar cualquier célula tumoral externa, teniendo cuidado de evitar pinchazos con la aguja.

Luego, sosteniendo la piel y el revestimiento peritoneal del lado mediano de la incisión con las pinzas, use un hisopo de algodón estéril para mover cuidadosamente los intestinos grueso y delgado sobre una gasa estéril, empapada en solución salina estéril. Cubra los órganos internos con la gasa empapada en solución salina para mantener la humedad interna y la esterilidad. Cuando la vena porta sea visible, pídale a un asistente que sostenga suavemente los intestinos para exponer la vena porta con un hisopo de algodón estéril e inserte la aguja de tres a cinco milímetros en la vena porta, aproximadamente 10 milímetros por debajo del hígado, en un ángulo de menos de 5 grados, con el bisel hacia arriba.

Inyecte lentamente el volumen completo de células tumorales, permitiendo que la sangre fluya más allá de la cabeza de la aguja durante varios segundos para evitar un reflujo de las células tumorales fuera de la vena. Dado que la visualización, el acceso y la inyección adecuados en la vena porta son esenciales, tómese el tiempo necesario para asegurarse de que la posición de la vena porta, en relación con la aguja, sea satisfactoria antes de intentar la inyección. Cuando se hayan inyectado todas las células, retire la aguja mientras aplica simultáneamente una presión suave sobre la vena con un aplicador estéril de punta de algodón.

A continuación, utilice un nuevo aplicador estéril de punta de algodón para sujetar un trozo cuadrado de gasa hemostática de 0,5 a un centímetro sobre el lugar de la inyección. Después de cinco minutos, levante con cuidado la gasa para evaluar el cierre de la vena. Cuando el flujo sanguíneo haya cesado por completo, retire la gasa y regrese los intestinos a la cavidad abdominal.

Utilizando un patrón de sutura simple continuo o interrumpido, cierre el revestimiento peritoneal con la sutura estéril de cuatro cero vicryl y la conicidad. Después de cerrar la piel de la misma manera, inyecte 100 microlitros de anestésico local a lo largo del sitio de la incisión, seguido de la administración subcutánea de 0,5 mililitros de solución salina estéril. La identificación anatómica precisa de la vena porta y el éxito de la inyección intraportal pueden confirmarse practicando el protocolo de inyección con tinta china o un colorante similar.

Con una correcta inyección a través de la vena porta, lo que hace que la tinta llegue de forma inmediata y específica al hígado sin extenderse al pulmón. Usando células tumorales de memoria de ratón marcadas con GFP, la dispersión de las células tumorales por todo el hígado es evidente a los 90 minutos después de la inyección, lo que confirma una entrega exitosa de la vena porta al hígado. Las células tumorales se encuentran dentro de los sinusoides, así como dentro del parénquima hepático muy cerca de las tríadas portales, donde la sangre de la vena porta ingresa al hígado, lo que sugiere que la extravasación activa de células tumorales está teniendo lugar en este momento.

Como lo demuestran estas curvas de supervivencia, la transferencia adoptiva de la vena porta de líneas celulares tumorales mamarias agresivas da como resultado tasas de supervivencia sin metástasis más cortas en comparación con los ratones inyectados con una línea celular tumoral menos agresiva. Las metástasis de estos animales pueden confirmarse mediante el corte a través del hígado en niveles de 250 micras y el posterior análisis de H&E de las muestras. Además, el análisis de inmunofluorescencia es útil para el análisis de lesiones micro y macro metastásicas de líneas singénicas no marcadas, como la línea tumoral D2A1, que son CD45 negativas, Heppar-1 negativas y CK18 positivas, como se demuestra en estas imágenes representativas.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 12-14 minutos por ratón, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse el tiempo necesario para visualizar y acceder adecuadamente a la vena porta antes de intentar la inyección. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes intravitales después de la inyección de células tumorales, para responder preguntas adicionales sobre cómo interactúan las células tumorales con el entorno lubramicro.

Con su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores en el campo de la metástasis explorar etapas posteriores de la cascada metastásica de varios cánceres en ratones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de dónde hacer la incisión quirúrgica, cómo mover suavemente los órganos internos para acceder a la vena porta y cómo llevar a cabo la inyección intraportal. No olvide que trabajar con jeringas cargadas con células tumorales puede ser peligroso y que se deben tomar precauciones para evitar pinchazos con agujas mientras se realiza este procedimiento.