ACT-PRESTO: Aclaración del tejido biológico y métodos para immunolabeling Volume Imaging

El objetivo general de este procedimiento es obtener el tejido intacto y aclarado y visualizar su información molecular tridimensional mediante métodos de inmunomarcaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neurociencia y la biología del desarrollo, como las conexiones neuronales, la categorización molecular y el cambio estructural durante el desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido permite claramente el análisis a nivel subcelular de muestras grandes sin necesidad de seccionarlas.

Para comenzar este procedimiento, incube los órganos fijos en una solución de monómero de hidrogel A4P0 a cuatro grados centígrados durante 12 a 24 horas con una agitación suave. Después de eso, agregue cinco mililitros de solución de monómero de hidrogel a un tubo de fondo redondo de 10 mililitros. A continuación, transfiera la muestra de cerebro de ratón a él y envuelva la parte superior del tubo con Parafilm.

A continuación, burbujee nitrógeno a través del líquido con la muestra de cerebro infundida con hidrogel durante un minuto. Cierre rápida y herméticamente el tubo contenedor de la muestra. Transfiera el tubo a un baño de agua durante dos horas.

Después de eso, verifique la viscosidad del hidrogel y luego lave brevemente la muestra polimerizada con 0.1 X PBS para eliminar el exceso de hidrogel. En este paso, transfiera la muestra polimerizada a un recipiente de pañuelos. Y coloque el recipiente de pañuelos en la cámara ETC.

A continuación, llene la cámara ETC con tampón ETC utilizando una bomba peristáltica. Establezca las condiciones de ETC y actívelo. Los trozos de cerebro de uno a dos milímetros de grosor se eliminan en dos horas.

Y un cerebro entero está suficientemente despejado en cinco o seis horas. Posteriormente, transfiera la muestra a un tubo cónico de 50 mililitros con 45 mililitros de 0,1 X PBS. Lave la muestra varias veces con 0.1 X PBS hasta que no se vean burbujas cuando se agite brevemente el tubo para confirmar la extracción completa de SDS.

Para realizar c-PRESTO, transfiera una pequeña muestra a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 500 microlitros de solución de dilución de anticuerpos con un factor de dilución de uno a 500 para el anticuerpo de colágeno tipo cuatro y centrifugar el tubo a 600 veces g durante dos horas. Después de eso, lave la muestra teñida con 0,1 X PBS por centrifugación a 600 veces g durante 30 minutos.

A continuación, añada 500 microlitros de solución de dilución de anticuerpos con un factor de dilución de uno a 500 para el anticuerpo secundario anti conejo conjugado Cy3 y centrifuga 600 veces g durante dos horas. Posteriormente, lavar la muestra teñida con 0,1 X PBS por centrifugación a 600 veces g durante 30 minutos. Para realizar s-PRESTO en tejidos más grandes, transfiera la muestra a una jeringa conectada con válvula de tres vías en la posición de válvula cerrada.

Agregue de cinco a siete mililitros de solución de dilución de anticuerpos con un factor de dilución de uno a 500 para el anticuerpo de colágeno tipo cuatro. Posteriormente, agregue la solución de anticuerpos a la muestra abriendo la válvula. A continuación, en la posición de válvula abierta, coloque el pistón de la jeringa en la posición de 17 mililitros para proporcionar suficiente espacio para el movimiento de extracción de la infusión.

Luego, cierre la válvula de tres vías una vez finalizado el ajuste de la jeringa. Coloque la jeringa que contiene la muestra en una bomba de jeringa. Ajuste las condiciones de la bomba de jeringa a un volumen de extracción de infusión de diez mililitros por minuto y un tiempo de pausa de cuatro minutos en el modo de ciclo continuo.

Después, haga funcionar la bomba de jeringa durante tres a 24 horas a temperatura ambiente. Luego, abra la válvula de tres vías y reemplace la solución con 0.1 X PBS. Lave la muestra teñida dos veces con 0,1 X PBS durante una hora cada vez, utilizando la bomba de jeringa.

Luego, reemplace PBS con la solución de dilución de anticuerpos que contiene anticuerpo secundario anti conejo conjugado Cy3 y haga funcionar la bomba de jeringa durante tres a 24 horas. Después de eso, abra la válvula de tres vías y reemplace la solución con 0.1 X PBS. Antes de la toma de imágenes, incube la muestra teñida en una cantidad adecuada de solución de montaje cúbico durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave.

Después de una hora, reemplace la solución con una solución de montaje cúbico nueva e incube durante una hora más. Dado que los anticuerpos no pueden penetrar en los tejidos densos por difusión, los métodos de inmunomarcaje PRESTO están diseñados para infundir activamente macromoléculas y administrar reactivos en los tejidos densos. La aplicación de fuerzas centrífugas utilizando una centrífuga de mesa estándar facilitó notablemente la administración de anticuerpos.

La aplicación de flujo de convección con una bomba de jeringa también mejoró la penetración de los anticuerpos. En el caso del s-PRESTO, se utilizó una bomba de jeringa para administrar los anticuerpos. Los órganos del ratón, como los riñones y el hígado, se marcaron con colágeno tipo 4.

En comparación con los métodos convencionales, tres horas de c o s-PRESTO mejoran notablemente la profundidad de etiquetado. En el riñón y el hígado, la profundidad del eje z alcanza de 300 a 350 micrómetros o más en las muestras de PRESTO, mientras que las muestras de control se marcan a una profundidad de solo 40 a 50 micrómetros. Una vez dominadas, estas técnicas se pueden realizar en un día para obtener tejido claramente si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener claro el tiempo de fijación del tejido, la emulsión de monómero de hidrogel y el tejido electroforético. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el inmunomarcaje, para responder a preguntas adicionales, como el análisis de la dinámica celular y la identificación de un encaje neuronal en múltiples órganos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ciencia médica exploraran el diagnóstico de enfermedades.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer la inclusión de hidrogel y la polimerización de tejidos. No olvide que trabajar con una solución de monómero de hidrogel puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.