Matrices 2D y 3D para estudiar la formación y la actividad invadosoma lineal

Nuestro grupo trabaja en la interacción entre la célula y la matriz extracelular. Las células pueden producir, pero también pueden degradar el elemento de la matriz extracelular. La degradación de la matriz puede ocurrir durante procesos fisiológicos, pero también en procesos patológicos, como la neurodegensis y la invasión de tumores celulares.

A nivel celular podemos notar la presencia de una estructura basada en actina involucrada en la degradación de la matriz. Y estas estructuras se denominan invadosomas. Invadosoma, es un término general que incluye podosomas en células normales e invadopodios en células cancerosas.

La degradación de este invadosoma puede autoorganizarse en diferentes formas, puntos, agregados y rosetas. Y la actividad de este invadosoma es impulsada por metaloproteinasas, como MMP2 y MT1-MMP. No es por mucho tiempo que la pareja, MMP2, MT1-MMP es activada por las fibrillas de colágeno tipo 1.

Para estudiar la actividad de los invadosomas, se utilizó un ensayo clásico de zimografía in situ. Pero para estudiar el papel y el impacto de las fibrillas de colágeno tipo 1 en los invadosomas, decidimos crear un nuevo ensayo. Para ello, creamos una matriz mixta compuesta por gelatina y fibrillas de colágeno tipo 1.

En esta película, en la primera parte, Eloide Henriet te mostrará cómo generamos este tipo de matriz. En la segunda parte, Zakaria Ezzoukhry te mostrará cómo somos capaces de medir el impacto de las fibrillas de colágeno tipo 1 en la morfología, formación y activación de los invadosomas. Y en la última parte, Julie Di Marino te mostrará cómo adaptamos un ensayo de invasión de colágeno en 3D.

Te mostraré cómo preparar una matriz mixta compuesta por gelatina y fibrillas de colágeno tipo 1. Haré dos tipos de matriz mixta. Uno para hacer el ensayo de zimografía in situ con gelatina de fluoresceína y colágeno tipo 1 no fluoresceína.

Y otro que nos permite visualizar las fibrillas de colágeno con gelatina sin fluoresceína y fibrillas de colágeno marcadas. Para preparar la matriz de gelatina, alícuota 20 gotas de microlitros de gelatina en un trozo de parafilm. Cubra cada gota con un cubreobjetos de vidrio esterilizado en autoclave.

Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos y proteger de la luz. Para la fijación de gelatina, alícuota 40 gotas de microlitros de 0,5% de glutaraldehído en PBS. Con pinzas, transfiera los cubreobjetos recubiertos de gelatina a cada gota de glutaraldehído.

Incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos y proteger de la luz. Tome una placa de cultivo celular multipocillo y llene cada pocillo con 500 microlitros de PBS estéril 1X. Al final del período de incubación, coloque cada cubreobjetos, con el lado de la gelatina hacia arriba, en cada pocillo.

Lave los cubreobjetos dos veces en 1X PBS durante cinco minutos cada uno. En este paso, los cubreobjetos se pueden utilizar para la experimentación o almacenarse para su uso posterior. Pipetear 0,4 mg por ml de colágeno uno en un tubo.

Añadir el colorante fluorescente hasta obtener una concentración final de 10 microgramos por ml. Mezclar la solución en el tubo e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Diluya hasta el volumen final con 1x DPBS y agregue 500 microlitros de la solución sobre cubreobjetos recubiertos de gelatina en una placa de pocillos múltiples.

Incubar durante cuatro horas a 37 grados centígrados para la polimerización del colágeno. Después de la incubación, retire el exceso de colágeno. Agregue las células para obtener un volumen final de 500 microlitros e incube las células a 37 grados centígrados antes de la fijación.

Este tipo de matrices podrían modificarse con otros elementos de la matriz como la fibronectina, la vitronectina o el colágeno tipo IV. Por mi parte, te mostraré cómo realizar inmunofluorescencia mediante el uso de Tks5, un marcador de invadosomas, y cómo cuantificar invadosomas lineales en cubreobjetos recubiertos de colágeno tipo 1. Podemos presentar los resultados por el número de células presentes en los invadosomas lineales, pero también podemos presentar el número de estructuras en cada célula.

Fije los cubreobjetos durante 10 minutos en 500 microlitros de 4% de paraformaldehído en PBS. Lavar dos veces con 1x PBS y permeabilizar las células con 0,2%Triton X-100 en 1x PBS durante 10 minutos. Alícuota 50 gotas de microlitros de solución primaria de anticuerpos en 4%BSA en 1x PBS en una pieza de parafilm.

Coloque cada cubreobjetos en una gota. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave los cubreobjetos dos veces con 1x PBS e incube los cubreobjetos en anticuerpo secundario, coloidina y colorante de Hoechst durante 30 minutos protegidos de la luz.

Después de la incubación, lavar dos veces con 1x PBS, seguido de agua destilada para eliminar las sales. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje polimerizante. Deje que el portaobjetos se seque durante la noche a temperatura ambiente antes de tomar imágenes.

Para el análisis de la imagen, adquiera una imagen de actina y Tks5 secuencialmente utilizando un microscopio confocal. Para cuantificar el tamaño y el número de invadosomas lineales por celda, utilice el software ImageJ y la macro proporcionada. Primero ejecute la macro en ImageJ y abra la imagen de actina.

A continuación, abra la imagen Tks5. Establezca el umbral y aplique la macro. Los resultados analizados aparecerán en dos tablas.

El número de invadosomas lineales por celda y otra información, como el área porcentual utilizada por los invadosomas lineales en la celda, se incluirán en la tabla de resumen. El tamaño de cada invadosoma lineal estará en la tabla de resultados. Después de la cuantificación de las imágenes, podemos presentar los resultados mostrando el número de estructuras por celda.

Así que, por mi parte, adaptamos un método para demostrar la presencia de invadosomas lineales en 3D. Realizamos el gel compuesto únicamente por fibrillas de colágeno y este ensayo se utiliza para evaluar la invasión celular en el contexto del colágeno. Prepare la solución de colágeno tipo 1 en hielo a una concentración final de dos mg por ml.

Añade el colorante fluorescente a una concentración final de un microgramo por mililitro. Mezclar la solución e incubar en hielo durante cinco minutos protegido de la luz. A continuación, añade 50 microlitros de 10x PBS helado.

A continuación, añade 6,25 microlitros de hidróxido de sodio molar helado. Agregue agua estéril para obtener la concentración correcta y mezcle la solución. Coloque los insertos de la cámara Boyden en una placa de cultivo celular de pocillos múltiples.

Agregue 100 microlitros de colágeno, una solución a cada inserto. Para polimerizar el gel de colágeno, incuba la placa durante una hora a 37 grados centígrados. Agregue medio de cultivo celular enriquecido con suero a cada pocillo y coloque los insertos en el medio.

Siembra 30.000 células en medios sin suero sobre el gel de colágeno. Para fijar las celdas, agregue una solución de paraformaldehído al 4% en un pozo vacío. Retire el medio celular del inserto sin tocar el gel de colágeno.

Coloque el inserto en los pocillos con la solución de paraformaldehído al 4% y agregue una solución adicional de paraformaldehído al 4% encima del gel de colágeno. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la fijación, retire la solución de paraformaldehído al 4% y lave con 1x PBS.

Después del lavado, el gel de colágeno debe volverse transparente. Ahora los insertos están listos para la inmunofluorescencia. Primero drene los insertos.

A continuación, coloque los insertos en los nuevos pocillos de la placa multipocillo. Para permeabilizar las células, agregue una solución de 0.2%Triton X-100 en 1X PBS sobre el gel de colágeno durante 30 minutos. Escurre los insertos.

Lavar con 1X PBS y añadir la solución de anticuerpos primarios sobre el gel de colágeno durante una hora protegido de la luz. Retirar la solución de anticuerpos primarios, lavar con 1X PBS e incubar el gel de colágeno con la solución de anticuerpos secundarios durante 1,5 horas protegido de la luz. Lave la solución de anticuerpos secundarios con 1X PBS.

Para preparar el gel de colágeno para el montaje, corte la membrana del inserto con un bisturí. Coloque el gel de colágeno adherido a la membrana en un plato con fondo de vidrio. Es importante que la parte superior del gel esté en contacto con la parte inferior del plato.

Agregue medios de montaje y un cubreobjetos en la parte superior para la observación microscópica. Con este ensayo, demostramos el papel clave del receptor DDR1 en la invasión celular en el colágeno uno. Este ensayo también se puede utilizar para evaluar el efecto de los fármacos en la invasión celular.

En nuestro estudio diferente, demostramos que solo agregar un nuevo elemento de matriz extracelular en su confirmación fisiológica, aquí fibrillas de colágeno tipo 1, puede modificar la morfología, la composición molecular y la actividad de los invadosomas. Así que usando los diferentes ensayos descritos en esta película, demostramos la existencia de nuevas estructuras, una nueva organización de invadosomas que llamamos invasorosomas lineales. Al generar matrices complejas y más fisiológicas, permitimos la identificación de nuevas vías involucradas en la adición, migración e invasión celular.