Matrices 2D y 3D para estudiar la formación y la actividad invadosoma lineal
2 de junio de 2017
Este protocolo describe cómo preparar una matriz mixta 2D, que consta de gelatina y colágeno I, y un colágeno 3D para estudiar invadosomas lineales. Estos protocolos permiten el estudio de la formación invadosoma lineal, la actividad de degradación de la matriz, y la capacidad de invasión de células primarias y líneas celulares de cáncer.
Nuestro grupo trabaja en la interacción entre la célula y la matriz extracelular. Las células pueden producir, pero también pueden degradar el elemento de la matriz extracelular. La degradación de la matriz puede ocurrir durante procesos fisiológicos, pero también en procesos patológicos, como la neurodegensis y la invasión de tumores celulares.
A nivel celular podemos notar la presencia de una estructura basada en actina involucrada en la degradación de la matriz. Y estas estructuras se denominan invadosomas. Invadosoma, es un término general que incluye podosomas en células normales e invadopodios en células cancerosas.
La degradación de este invadosoma puede autoorganizarse en diferentes formas, puntos, agregados y rosetas. Y la actividad de este invadosoma es impulsada por metaloproteinasas, como MMP2 y MT1-MMP. No es por mucho tiempo que la pareja, MMP2, MT1-MMP es activada por las fibrillas de colágeno tipo 1.
Para estudiar la actividad de los invadosomas, se utilizó un ensayo clásico de zimografía in situ. Pero para estudiar el papel y el impacto de las fibrillas de colágeno tipo 1 en los invadosomas, decidimos crear un nuevo ensayo. Para ello, creamos una matriz mixta compuesta por gelatina y fibrillas de colágeno tipo 1.
En esta película, en la primera parte, Eloide Henriet te mostrará cómo generamos este tipo de matriz. En la segunda parte, Zakaria Ezzoukhry te mostrará cómo somos capaces de medir el impacto de las fibrillas de colágeno tipo 1 en la morfología, formación y activación de los invadosomas. Y en la última parte, Julie Di Marino te mostrará cómo adaptamos un ensayo de invasión de colágeno en 3D.
Te mostraré cómo preparar una matriz mixta compuesta por gelatina y fibrillas de colágeno tipo 1. Haré dos tipos de matriz mixta. Uno para hacer el ensayo de zimografía in situ con gelatina de fluoresceína y colágeno tipo 1 no fluoresceína.
Y otro que nos permite visualizar las fibrillas de colágeno con gelatina sin fluoresceína y fibrillas de colágeno marcadas. Para preparar la matriz de gelatina, alícuota 20 gotas de microlitros de gelatina en un trozo de parafilm. Cubra cada gota con un cubreobjetos de vidrio esterilizado en autoclave.
Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos y proteger de la luz. Para la fijación de gelatina, alícuota 40 gotas de microlitros de 0,5% de glutaraldehído en PBS. Con pinzas, transfiera los cubreobjetos recubiertos de gelatina a cada gota de glutaraldehído.
Incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos y proteger de la luz. Tome una placa de cultivo celular multipocillo y llene cada pocillo con 500 microlitros de PBS estéril 1X. Al final del período de incubación, coloque cada cubreobjetos, con el lado de la gelatina hacia arriba, en cada pocillo.
Lave los cubreobjetos dos veces en 1X PBS durante cinco minutos cada uno. En este paso, los cubreobjetos se pueden utilizar para la experimentación o almacenarse para su uso posterior. Pipetear 0,4 mg por ml de colágeno uno en un tubo.
Añadir el colorante fluorescente hasta obtener una concentración final de 10 microgramos por ml. Mezclar la solución en el tubo e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Diluya hasta el volumen final con 1x DPBS y agregue 500 microlitros de la solución sobre cubreobjetos recubiertos de gelatina en una placa de pocillos múltiples.
Incubar durante cuatro horas a 37 grados centígrados para la polimerización del colágeno. Después de la incubación, retire el exceso de colágeno. Agregue las células para obtener un volumen final de 500 microlitros e incube las células a 37 grados centígrados antes de la fijación.
Este tipo de matrices podrían modificarse con otros elementos de la matriz como la fibronectina, la vitronectina o el colágeno tipo IV. Por mi parte, te mostraré cómo realizar inmunofluorescencia mediante el uso de Tks5, un marcador de invadosomas, y cómo cuantificar invadosomas lineales en cubreobjetos recubiertos de colágeno tipo 1. Podemos presentar los resultados por el número de células presentes en los invadosomas lineales, pero también podemos presentar el número de estructuras en cada célula.
Fije los cubreobjetos durante 10 minutos en 500 microlitros de 4% de paraformaldehído en PBS. Lavar dos veces con 1x PBS y permeabilizar las células con 0,2%Triton X-100 en 1x PBS durante 10 minutos. Alícuota 50 gotas de microlitros de solución primaria de anticuerpos en 4%BSA en 1x PBS en una pieza de parafilm.
Coloque cada cubreobjetos en una gota. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave los cubreobjetos dos veces con 1x PBS e incube los cubreobjetos en anticuerpo secundario, coloidina y colorante de Hoechst durante 30 minutos protegidos de la luz.
Después de la incubación, lavar dos veces con 1x PBS, seguido de agua destilada para eliminar las sales. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje polimerizante. Deje que el portaobjetos se seque durante la noche a temperatura ambiente antes de tomar imágenes.
Para el análisis de la imagen, adquiera una imagen de actina y Tks5 secuencialmente utilizando un microscopio confocal. Para cuantificar el tamaño y el número de invadosomas lineales por celda, utilice el software ImageJ y la macro proporcionada. Primero ejecute la macro en ImageJ y abra la imagen de actina.
A continuación, abra la imagen Tks5. Establezca el umbral y aplique la macro. Los resultados analizados aparecerán en dos tablas.
El número de invadosomas lineales por celda y otra información, como el área porcentual utilizada por los invadosomas lineales en la celda, se incluirán en la tabla de resumen. El tamaño de cada invadosoma lineal estará en la tabla de resultados. Después de la cuantificación de las imágenes, podemos presentar los resultados mostrando el número de estructuras por celda.
Así que, por mi parte, adaptamos un método para demostrar la presencia de invadosomas lineales en 3D. Realizamos el gel compuesto únicamente por fibrillas de colágeno y este ensayo se utiliza para evaluar la invasión celular en el contexto del colágeno. Prepare la solución de colágeno tipo 1 en hielo a una concentración final de dos mg por ml.
Añade el colorante fluorescente a una concentración final de un microgramo por mililitro. Mezclar la solución e incubar en hielo durante cinco minutos protegido de la luz. A continuación, añade 50 microlitros de 10x PBS helado.
A continuación, añade 6,25 microlitros de hidróxido de sodio molar helado. Agregue agua estéril para obtener la concentración correcta y mezcle la solución. Coloque los insertos de la cámara Boyden en una placa de cultivo celular de pocillos múltiples.
Agregue 100 microlitros de colágeno, una solución a cada inserto. Para polimerizar el gel de colágeno, incuba la placa durante una hora a 37 grados centígrados. Agregue medio de cultivo celular enriquecido con suero a cada pocillo y coloque los insertos en el medio.
Siembra 30.000 células en medios sin suero sobre el gel de colágeno. Para fijar las celdas, agregue una solución de paraformaldehído al 4% en un pozo vacío. Retire el medio celular del inserto sin tocar el gel de colágeno.
Coloque el inserto en los pocillos con la solución de paraformaldehído al 4% y agregue una solución adicional de paraformaldehído al 4% encima del gel de colágeno. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la fijación, retire la solución de paraformaldehído al 4% y lave con 1x PBS.
Después del lavado, el gel de colágeno debe volverse transparente. Ahora los insertos están listos para la inmunofluorescencia. Primero drene los insertos.
A continuación, coloque los insertos en los nuevos pocillos de la placa multipocillo. Para permeabilizar las células, agregue una solución de 0.2%Triton X-100 en 1X PBS sobre el gel de colágeno durante 30 minutos. Escurre los insertos.
Lavar con 1X PBS y añadir la solución de anticuerpos primarios sobre el gel de colágeno durante una hora protegido de la luz. Retirar la solución de anticuerpos primarios, lavar con 1X PBS e incubar el gel de colágeno con la solución de anticuerpos secundarios durante 1,5 horas protegido de la luz. Lave la solución de anticuerpos secundarios con 1X PBS.
Para preparar el gel de colágeno para el montaje, corte la membrana del inserto con un bisturí. Coloque el gel de colágeno adherido a la membrana en un plato con fondo de vidrio. Es importante que la parte superior del gel esté en contacto con la parte inferior del plato.
Agregue medios de montaje y un cubreobjetos en la parte superior para la observación microscópica. Con este ensayo, demostramos el papel clave del receptor DDR1 en la invasión celular en el colágeno uno. Este ensayo también se puede utilizar para evaluar el efecto de los fármacos en la invasión celular.
En nuestro estudio diferente, demostramos que solo agregar un nuevo elemento de matriz extracelular en su confirmación fisiológica, aquí fibrillas de colágeno tipo 1, puede modificar la morfología, la composición molecular y la actividad de los invadosomas. Así que usando los diferentes ensayos descritos en esta película, demostramos la existencia de nuevas estructuras, una nueva organización de invadosomas que llamamos invasorosomas lineales. Al generar matrices complejas y más fisiológicas, permitimos la identificación de nuevas vías involucradas en la adición, migración e invasión celular.
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Descripción general
Este protocolo describe la preparación de una matriz mixta bidimensional de gelatina y colágeno I, junto con un tapón tridimensional de colágeno I, para investigar los invadosomas lineales. El estudio se centra en la formación de invadosomas, la degradación de la matriz y las capacidades invasivas de células primarias y líneas celulares cancerosas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Interacciones de la matriz extracelular
- Investigación del cáncer
Antecedentes
- Las células pueden producir y degradar componentes de la matriz extracelular.
- La degradación de la matriz es significativa en procesos fisiológicos y patológicos.
- Los invadosomas son estructuras basadas en actina que participan en la degradación de la matriz.
- Estas estructuras incluyen los podosomas en células normales y los invadopodios en células cancerosas.
Objetivo del estudio
- Para preparar una matriz mixta para estudiar la formación de invadosomas.
- Para evaluar la actividad de degradación de la matriz.
- Para determinar las capacidades invasivas de diferentes tipos celulares.
Métodos Utilizados
- Preparación de una matriz mixta bidimensional de gelatina y colágeno I.
- Creación de un tapón tridimensional de colágeno I.
- Estudio de la formación de invadosomas lineales.
- Análisis de células primarias y líneas celulares cancerosas para evaluar sus capacidades invasivas.
Resultados principales
- Preparación exitosa de matrices para el estudio de invadosomas.
- Actividad demostrada de degradación de la matriz por células.
- Identificación de diferencias en las capacidades de invasión entre tipos celulares.
- Proporcionó información sobre el papel de los invadosomas en la invasión de células cancerosas.
Conclusiones
- Los protocolos permiten el estudio detallado de la dinámica de los invadosomas.
- Comprender la degradación de la matriz puede aportar información para la investigación del cáncer.
- Investigaciones futuras podrían conducir a conocimientos terapéuticos sobre la invasión tumoral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la formación de invadosomas en matrices fisiológicamente relevantes es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en la investigación de metástasis cancerosa. La capacidad de cuantificar la actividad lineal de los invadosomas sobre fibrillas de colágeno tipo I proporciona una lectura mecanicista para evaluar las vías de invasión inducidas por la matriz extracelular. Esto respalda la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes al vincular dianas moleculares como DDR1 con fenotipos funcionales de invasión en sistemas relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar a DDR1 como un receptor que media la formación de invadosomas lineales en matrices fisiológicas de colágeno I.
- Valor operativo: Proporciona un ensayo cuantitativo para evaluar la interacción con el blanco mediante la morfología de los invadosomas y su actividad de degradación.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al vincular la inhibición del receptor con la disminución de la formación de invadosomas lineales en contextos de matriz extracelular relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Proporciona una matriz mixta estandarizada 2D (gelatina + colágeno I) y un tapón de colágeno I 3D para obtener lecturas reproducibles de formación de invadosomas e invasión.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición del número, tamaño y localización celular de invadosomas lineales mediante análisis basado en ImageJ de la co-localización de actina y Tks5.
- Escalabilidad: Compatible con imágenes de alto contenido y adaptable a formatos de múltiples pocillos para campañas de cribado de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la invasión de células tumorales a través de colágeno fisiológico tipo I, una barrera clave en la metástasis.
- Continuidad traslacional: Conecta conocimientos mecanicistas en 2D con ensayos de invasión en 3D para evaluar los efectos de compuestos sobre la migración celular a través de colágeno fibrilar.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al cuantificar cambios en la actividad lineal de los invadosomas como biomarcador del potencial de invasión dependiente de la MEC.
Integración de la Secuencia de Trabajo y el Flujo de Trabajo
El método se integra en la secuencia de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y las pruebas preclínicas de eficacia, particularmente para programas oncológicos centrados en metástasis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función de receptores de la MEC (por ejemplo, DDR1) en la regulación de la degradación matricial dependiente de invadosomas.
- Selección: Proporciona matrices listas para ensayos con fibrillas estandarizadas de colágeno I para garantizar la formación reproducible de invadosomas en distintas condiciones de tratamiento con compuestos.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas mediante imágenes (número y tamaño de invadosomas lineales por célula) que permiten el análisis de respuesta dosis-dependiente y la evaluación de la modulación del blanco.
- Investigación Traducional: Conecta el mecanismo molecular con la invasión fenotípica en colágeno I tridimensional, apoyando la validación preclínica de estrategias antiinvasión.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar compuestos que modulan la MEC en distintos tipos de cáncer y contextos estromales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al demostrar la formación de invadosomas lineales dependientes de DDR1 en matrices fisiológicamente relevantes.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de matrices y protocolos invariables de obtención de imágenes y cuantificación.
- Valor estratégico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías de invasión, permitiendo una identificación temprana de blancos clínicamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de inhibidores de la invasión basada en la interacción funcional con la matriz extracelular, en lugar de únicamente en la actividad bioquímica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de la matriz extracelular, inmunofluorescencia y microscopía confocal para la detección precisa de invadosomas.
- Depende de la polimerización controlada de colágeno I y del marcado fluorescente para mantener la integridad y visualización de las fibrillas.
- Necesita estandarización entre equipos en la preparación de la matriz, siembra celular y aplicación del macro de ImageJ para garantizar la comparabilidad de los datos.
- La adaptación a otros componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, fibronectina, vitronectina) puede requerir una nueva optimización de la concentración y los tiempos de incubación.
- Se limita a tipos celulares formadores de invadosomas; no es aplicable a modelos de migración no invasivos o mesenquimales sin estructuras protrusivas basadas en actina.
