Name: Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a medir glucólisis y respiración mitocondrial en linfocitos de ratón mediante ensayo de flujo extracelular. Este método optimizado permite analizar perfiles metabólicos en tiempo real con alta viabilidad celular.

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Los autores agradecen al Dr. Michael N. Sack (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre) por su apoyo y discusión, a la Sra. Ann Kim por optimizar el protocolo de aislamiento de células B, al Dr. Joseph Brzostowski por su ayuda con la microscopía y a la Sra. Mirna Peña por mantener a los animales utilizados. Este estudio fue respaldado por los Programas de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos. Las tarifas de acceso abierto para este artículo fueron proporcionadas por Agilent Technologies.

El protocolo desarrollamos permitió el aislamiento eficiente de los subgrupos de linfocitos pura y viable, que posteriormente fueron utilizados en el análisis de flujo extracelular en diferentes concentraciones para evaluar las diferencias en la glucólisis y el rendimiento de la respiración mitocondrial. Este protocolo está diseñado específicamente para los linfocitos y aborda las consideraciones especiales relacionadas con estos tipos de células, tales como la baja actividad metabólica basal, fragilidad, de baja frecuencia, y su incapacidad para adherirse a las placas de ensayo. Por lo tanto, en comparación con los protocolos publicados previamente 11,12, nuestro método ofrece una guía más conveniente y mejor optimizado para los investigadores que trabajan en el campo de la inmunología. Hay varios pasos críticos en este protocolo, incluyendo la obtención de poblaciones de células puras y viables, en placas las células en confluencia óptima, y ​​la estandarización de las mediciones del ensayo de flujo extracelular a la concentración de proteína en cada pocillo. El initial número de células sembradas podría tanto ser visualizado por microscopía de luz y también cuantificarse utilizando mediciones de la concentración de proteínas. La correlación lineal entre el número de células y la concentración de proteína confirmó que la concentración de proteína de hecho se puede utilizar como una forma de normalizar los efectos de cambios en el número de células entre diferentes pozos. Mediante la estandarización de las ECAR y OCR resultados a las concentraciones de proteína, se demostró que, a pesar de la confluencia celular más baja, tan sólo 2,5 x 10 5 células / pocillo se podrían utilizar en la mayoría de los ensayos sin comprometer la calidad de los datos. Sin embargo, el límite inferior de células que pueden ser empleados varían entre tipos de células y ensayos. Por ejemplo, mientras que tan sólo 1,25 x 10 5 células podrían ser utilizadas para mediciones de OCR de células B, incluso de 2,5 x 10 5 células / pocillo no fueron suficientes para evaluar el rendimiento glicolítico del mismo tipo celular. Por lo tanto, siempre y cuando el número de células no es un factor limitante, chapado en más de90% de confluencia, que corresponde aproximadamente a 5 x 10 5 linfocitos / pocillo, es preferible. La optimización adicional puede ser necesaria cuando las células de diferentes tamaños, tal como anteriormente se activan y linfocitos-utilizan parcialmente diferenciadas. Además, al utilizar linfocitos primarios previamente cultivadas, puede haber una variación en la viabilidad celular entre las diferentes condiciones de tratamiento, lo que disminuiría la fiabilidad de la concentración de proteína como una medida del número de células desde células muertas o moribundas también puede contribuir a los niveles de proteína medidos . En tales casos, podría ser útil para clasificar células vivas mediante citometría de flujo antes de llevar a cabo los ensayos de flujo extracelulares. En nuestros ensayos usando recién aisladas y altamente viables las poblaciones de linfocitos, se obtuvieron datos funcionales fiables para ambas mediciones OCR y ECAR. Si bien todos los tipos de células se comportaron de manera similar en la prueba de estrés mitocondrial, notables diferencias entre los tipos de células fueronobservado en la prueba de esfuerzo glucólisis. Por ejemplo, el rendimiento glucolítica de las células T ingenuas era baja en comparación con los esplenocitos o células B, y no cambió con la adición de oligomicina. Esta observación coincide con los estudios publicados previamente 7,30, lo que confirma la validez de nuestro protocolo. En conclusión, nuestro método ofrece una manera eficiente y conveniente de probar la actividad metabólica de los linfocitos utilizando un analizador de flujo extracelular, y puede ser útil en una amplia gama de estudios inmunológicos explorar los cambios metabólicos en las células inmunes tras la activación, la diferenciación celular o debido a fenotipos de la enfermedad, tales como infección, autoinmunidad y neoplasias hematológicas.

La respuesta inmune frente a antígenos es un equilibrio estrechamente regulado entre la activación inmune y la supresión inmune. La activación inmunitaria impulsa la rápida proliferación celular y la migración, así como la producción de citoquinas, la secreción de anticuerpos y un aumento de la fagocitosis en respuesta al estimulante, mientras que la supresión inmune simplemente inhibe estos eventos y por lo tanto es importante en la prevención de la respuesta inmune innecesarios 1-6. Estudios recientes han demostrado que existe una relación directa entre el estado de activación de las células inmunes y la actividad de diversas rutas metabólicas 7. Las células inmunes pueden cambiar entre reposo y activadas por los estados de conmutación de las vías de producción de energía dentro y fuera. Además, se ha observado que diferentes tipos de células inmunes pueden utilizar diferentes estrategias metabólicas para alimentar sus mayores necesidades de energía durante la activación. Por ejemplo, mientras que la activación de los linfocitos T dirige a las células en un estado casi completamente glicolítica 8 </sup&gt;, los linfocitos B activados usar un equilibrio de la glucólisis y la fosforilación oxidativa 9,10. Estos estudios señalan la importancia de investigar los efectos de la activación de células inmunes en el metabolismo celular. En tiempo real, las mediciones simultáneas de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), como indicadores de la fosforilación oxidativa y la glucólisis, es una estrategia común para hacer frente a los estados de las vías de producción de energía 11-13. Con el fin de lograr esto, un analizador de flujo extracelular, tales como el Seahorse XF 96, se utiliza de forma rutinaria. Tal instrumento puede comparar rápidamente los cambios de OCR y el CERA través de tipos de células o en diferentes condiciones de estimulación. Hasta ahora, varios tipos de células, incluyendo las células inmunes, se han estudiado el uso de estos dispositivos. Sin embargo, un protocolo optimizado diseñado específicamente para las células inmunes no está disponible. Las células inmunes, particularmente linfocitos, difieren de otsus tipos de células en varias formas críticos. Los linfocitos son células frágiles que no sobreviven durante largos períodos en condiciones ex vivo 14-16. Este es un problema aún mayor cuando se cultivan en medio de crecimiento que carece de subóptima nutrientes esenciales, tales como los utilizados en el análisis de flujo extracelular. A diferencia de los macrófagos y muchas líneas de células, los linfocitos no se adhieren a las superficies de plástico; Por lo tanto, es fundamental para la fijación a la placa de análisis sin generar estrés. Por último, algunas subpoblaciones de linfocitos pueden ser extremadamente raro y cosecharlas en las cantidades óptimas requeridas, pueden ser un reto 17-19. A continuación, ofrecemos un protocolo optimizado que se ha desarrollado específicamente para los linfocitos. El uso de esplenocitos, linfocitos B y los linfocitos T CD4 + vírgenes aisladas de bazo de ratón y los ganglios linfáticos 20, se muestran las características de su glicolisis y la fosforilación oxidativa estado de reposo en difedensidades t celulares. Los datos se normalizaron para tener en cuenta las diferencias en el número de células iniciales para cada pocillo mediante la medición de las concentraciones de proteína de lisados ​​de células de ensayo final, que eran directamente proporcionales a los números de células. Nuestro protocolo no sólo proporciona directrices para el rápido aislamiento de linfocitos viables para ensayos de flujo extracelulares, pero también permite trabajar a concentraciones de células subóptimas sin comprometer la calidad de los datos.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7.2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>Para hacer tampón MACS</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>BSA Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>Para hacer tampón MACS</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8</td><td>Calidad Biológica</td><td>10128-446</td><td>Para hacer tampón MACS</td></tr><tr><td>solución de enjuague autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>En lugar de PBS + EDTA para hacer tampón MS. También se utiliza en el separador autoMACS Pro.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Contiene rojo fenol y L-glutamina</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>Para la inactivación del calor, descongele la botella de caldo congelado en una botella de 37 &deg; C baño de agua y luego inactivar a 56 &deg; C durante 30 min. Suero inactivado por calor alícuota para almacenamiento (p. ej., en tubos cónicos de 50 ml) y congelación a -20 °C; C hasta que sea necesario.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (Estreptococo en pluma)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combine Pen Strep con L-Glut 1:1 (si fabrica 500 ml de medio, haga un total de 12 ml de Pen Strep/L-Glut); mantenga las alícuotas en -20 & deg; C hasta que esté listo para hacer medios.</td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Componente de RF10 y medios de prueba de esfuerzo</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Componente de RF10 y medios de prueba de esfuerzo</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Componente de RF10</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Componente de RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Componente de RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; m filtro</td><td>de células Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr> celular <tr><td>Monoject 3 ml Jeringa, Luer-Lock Tip</td><td>Covidien 8881513934</td><td></td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr> celular <tr><td>Falcon 15 ml Tubos de centrífuga cónicos&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr> celular <tr><td>Falcon 50 ml Tubos de centrífuga cónicos&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr> celular <tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr><tr><td>celular CellTrics 30 &mu; Filtro de células m, estéril, de un solo paquete</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Utilizado en el aislamiento de células</td></tr><tr><td>B Kit de aislamiento de células, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Utilizado en el aislamiento de células</td></tr><tr><td>Na&iuml; ve CD4+ Kit de aislamiento de células T, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr><tr><td>de células LS Columna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Utilizado en el aislamiento</td></tr> celular <tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Imán para separación</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Soporte para imanes</td></tr><tr><td>autoMACS Solución de enjuague</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Solución de enjuague para autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell adhesive. Tenga cuidado de anotar la concentración, ya que cada lote es diferente (el paquete es de 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrofenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel Halt Inhibidor de la Proteasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Suministrado como cóctel 100x, combine con RIPA para formar 1x solución para lisis.</td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Siga las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Incluye placas de ensayo, cartuchos, guías de carga para transferir compuestos al cartucho de ensayo y solución de calibrante.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium Seahorse</td><td>Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Se utiliza para preparar medios de prueba de estrés</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizador de flujo extracelular</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Unidades de filtro de vacío estériles, 0.22 &mu; m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific SCGPU10RE</td><td></td><td>Se utiliza para medios filtrantes estériles.</td></tr><tr><td>El bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>disuelto a 0,1 M y se utiliza para diluir Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Los linfocitos responden a una variedad de estímulos mediante la activación de vías de señalización intracelular, que a su vez conduce a una rápida proliferación celular, la migración y la diferenciación, y la producción de citoquinas. Todos estos acontecimientos están estrechamente vinculados a la condición de energía de la célula, y por lo tanto el estudio de los caminos productores de energía puede dar pistas acerca de la funcionalidad global de estas células. El analizador de flujo extracelular es un dispositivo usado comúnmente para evaluar el desempeño de la glicolisis y la respiración mitocondrial en muchos tipos de células. Este sistema ha sido utilizado para estudiar las células inmunes en algunos informes publicados, sin embargo, un amplio protocolo optimizado especialmente para los linfocitos se carece. Los linfocitos son células frágiles que sobreviven mal en condiciones ex vivo. Muchas veces los subgrupos de linfocitos son raros, y el trabajo con bajo número de células es inevitable. Por lo tanto, se requiere una estrategia experimental que se ocupa de estas dificultades. A continuación, ofrecemos un protocoloque permite un rápido aislamiento de linfocitos viables de los tejidos linfoides, y para el análisis de sus estados metabólicos en el analizador de flujo extracelular. Además, proporcionamos resultados de los experimentos en los que se compararon las actividades metabólicas de varios subtipos de linfocitos a diferentes densidades de células. Estas observaciones sugieren que el protocolo puede ser utilizado para lograr resultados consistentes y bien estandarizados incluso a concentraciones de células bajos, y por lo tanto puede tener amplias aplicaciones en futuros estudios que se centran en la caracterización de los eventos metabólicos en las células inmunes.

Las células eucariotas utilizan una red integrada de la glucólisis, ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), y la fosforilación oxidativa para satisfacer la mayoría de sus demandas energéticas y para aportar los productos intermedios necesarios para el crecimiento y la proliferación celular. Estas vías comienzan con el atrapamiento intracelular de glucosa libre en la forma de la glucosa-6-fosfato, que posteriormente se procesa en piruvato. El piruvato se sea reducida a lactato o se transporta a la mitocondria, donde forma acetil coenzima A (CoA). Acetil CoA entra entonces en el ciclo de Krebs. Intermedios de alta energía del ciclo del TCA impulsan el movimiento de electrones en la cadena de transporte de electrones (ETC), que a su vez expulsa H + de la matriz mitocondrial para generar un gradiente de H + a través de la membrana mitocondrial interna. El oxígeno actúa como aceptor final de electrones, y H + vuelta de nuevo a la matriz mitocondrial a través de la F O / F &lt;sub&gt; 1 complejo, en donde se utiliza su energía potencial de generar ATP (Figura 1A). El principio de funcionamiento del ensayo de flujo extracelular depende de interferir con la glicólisis y la fosforilación oxidativa en puntos específicos, y la evaluación de los efectos resultantes. Para este propósito, se utilizó glucosa para propagar la glucólisis en las células de hambre, y 2-desoxiglucosa (2-DG), que se convierte en 2-desoxiglucosa-6-fosfato, un inhibidor competitivo de fosfoglucoisomerasa 23, por la hexoquinasa, con el fin de bloquear glucólisis. Rotenona (un inhibidor de complejo específico-I de la ETC), antimicina A (un complejo inhibidor III-específica de la ETC), oligomicina (inhibidor de la ATP sintasa 24), y el agente de desacoplamiento 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 eran utilicen para intervenir eventos específicos relacionados con el transporte de electrones, gradiente de protones y la síntesis de ATP (Figura 1A). En lugar de 2,4-DNP, cya carbonilonide-4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) también se puede utilizar, pero una mayor optimización puede ser requerida. En cualquier caso, desacopladores siempre deben ser titulados para un tipo específico de célula antes de su uso para determinar la concentración óptima necesaria. La prueba de esfuerzo glucólisis (Figura 1B) comienza con una medición de línea de base de la velocidad de acidificación extracelular (ECAR) en las células previamente hambre. Puesto que estas células están en su mínimo basal, y pueden por tanto ser prácticamente considerados como no glicolítica, la ECAR medido en este punto se conoce como la acidificación no glicolítica. Esta acidificación probable corresponde a CO2 respiratorio generado en el ciclo de Krebs se convierte en HCO 3 - y H +. Esto es seguido por la inyección de glucosa para activar la glucólisis, que se presenta como un aumento en la acidificación extracelular debido a la formación de lactato.Este aumento representa la tasa normal de la glucólisis. Las células se estimularon con la inyección de oligomicina, que bloquea la generación de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Las células responden a esta dramática disminución en la producción de ATP mediante la activación de la glucólisis a su nivel máximo, y que se traduce en un aumento del nivel secundario en la ECAR (reserva glucolítica). La prueba se termina por la inhibición total de la glucólisis que utilizan análogos de la glucosa 2-DG, que devuelve el ECAR a su nivel no glucolítica. Curiosamente, se ha propuesto que, contrariamente a las recomendaciones del fabricante, la glucólisis máximo se alcanza no necesariamente por la inyección de oligomicina 26. En las células con una alta capacidad glucolítica, si no hay un aumento significativo en la demanda de ATP, la glucólisis puede ser perfectamente capaz de hacer frente a la pérdida de ATP mitocondrial sin necesidad de que sea hasta reguladas. La tasa glucolítica con oligomicina podría ser superada mediante la adición de inhibidores de las vías respiratorias, Tales como la rotenona y myxothiazol, que proporcionan algunos de los beneficios más de oligomicina: 1) Aumentan la demanda ATP, ya que provocan la inversión de la ATP sintasa, con la hidrólisis de ATP, para bombear protones en un intento de recuperar el potencial de membrana mitocondrial 26; 2) Evitan la acidificación respiratoria del medio, lo que puede confundir los resultados ECAR (ver abajo). Otras formas de aumentar la demanda de ATP incluyen la adición de compuestos que estimulan la hidrólisis de ATP por las ATPasas de membrana de plasma de 26. Todo esto debe ser cuidadosamente considerada por los investigadores en la planificación de una prueba de esfuerzo glucólisis. La prueba de esfuerzo mitocondrial (Figura 1C) comienza con una medición de línea de base de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en células no hambre. Esto es seguido por la inyección de oligomicina, que inhibe el retorno de protones a través del complejo F O / F 1 y por lo tanto hyperpolariz rápidamentees la membrana mitocondrial. Hiperpolarización impide una mayor bombeo de protones a través de complejos respiratorios, y las vías respiratorias disminuye la velocidad. La respiración restante se denomina fuga de protones, que representa el flujo de protones a través de los lípidos o de otros canales. Este estado hiperpolarizado se invierte rápidamente por la adición del agente de desacoplamiento 2,4-DNP, que actúa como un ionóforo de protones. En respuesta, las células tratan de recuperar el potencial de membrana en un vano intento por aumentar la tasa de transporte de electrones en el máximo, y esto a su vez aumenta el OCR. Por último, con la adición de dos inhibidores de ETC (antimicina A y rotenona), la respiración mitocondrial se detiene por completo y OCR se reduce a su nivel más bajo. En este nivel, el consumo de oxígeno no se debe a la actividad mitocondrial (no mitocondrial). La diferencia en el OCR generados por estos inhibidores se denomina respiración mitocondrial máximo, que es la suma de la respiración de línea de base y de la capacidad de reserva. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; B y aislamientos de células T dió poblaciones de linfocitos puros altamente viables. Se aislaron las células B y las células T CD4 + vírgenes como se describe en la Sección 4 del protocolo, y los esplenocitos se obtienen simplemente por lisis de las células rojas de la sangre tal como se describe en la Sección 3.3. La sensibilidad de los ensayos metabólicos específicos del tipo de células depende de la viabilidad y la pureza de la población de células de partida. Por lo tanto, con el fin de verificar la viabilidad de las células aisladas T de ratón, los esplenocitos y células B, y la pureza de las células T y B, pequeñas alícuotas de las células se tiñeron para el análisis de citometría de flujo (Figura 2). En el área de dispersión de dispersión hacia adelante frente a lateral-área (FSC frente a SSC-A-A) trama, los linfocitos fueron cerrada, y dentro de esta puerta, la población a lo largo de la diagonal de la dispersión hacia adelante-height (FSC-H) frente a FSC-Una parcela se determinaron como los interiores. Dentro de la población singlete, la viabilidad se midió por gating las células que se tiñeron negativa para el marcador en vivo / muerto (Figura 2A); la viabilidad de las células T fue 97,9%, la viabilidad de esplenocitos fue del 92%, y la viabilidad de las células B fue del 94%. Pureza de células B, medida por la B220 + CD19 + población 26, fue del 99%, mientras que la pureza de células CD4 + T, medida por el CD44 - población CD4 + 27, fue 98,3% (Figura 2B). La concentración de proteína del lisado celular se puede utilizar como un indicador directo del número de células plateado. Linfocitos aislados y los esplenocitos se sembraron en una placa de ensayo de 96 pocillos recubierta con adhesivo a 5 x 10 5 células / pocillo, 2,5 x 10 5 células / pocillo, 1,25 x 10 5 células / pocillo, y 0.625 x 10 <sup&gt; 5 células / pocillo. La confluencia en cada densidad de placas de los tres tipos de células se visualizó bajo el microscopio de luz (Figura 3A). Como era de esperar, confluencia correlacionada con las densidades iniciales de galvanoplastia. Al finalizar el ensayo de flujo extracelular, se lisaron células cultivadas en placas y sus concentraciones de proteína se cuantificaron usando el ensayo de BCA. Para todos los tipos de células, se demostró que se correlaciona linealmente con las densidades de chapado iniciales (Figura 3B), lo que confirma que las concentraciones de proteína lisado se pueden utilizar como una medida precisa para la normalización del número de células en la interpretación de los datos de flujo extracelulares concentraciones de proteína lisado. Las densidades de placas utilizadas en este experimento se han optimizado para los linfocitos no tratados previamente, no estimuladas. Si las células estimuladas o previamente cultivadas se van a utilizar, puede ser necesaria una optimización adicional. Mitocondrial y stres glucolíticass ensayos dependen del número de células plateado. El OCR se midió para cada tipo de célula y la densidad de la siembra en el analizador de flujo extracelular. Como se esperaba, el número de células más altas tienen un OCR más alto medido, así como las respuestas más dramáticos a oligomicina, 2,4-DNP, y antimicina A / rotenona (Figura 4A). La estandarización de las mediciones de OCR para la concentración de proteínas de cada muestra revela que, en general, un mayor número de células conducen a mediciones más precisas de OCR. Plating en 5 y 2,5 x 10 5 células / pocillo dio como resultado mediciones de OCR normalizados similares en las células T y los esplenocitos, y 5 y 1,25 x 10 5 células / pocillo dado como resultado mediciones de OCR normalizados similares en las células B (Figura 4B). Las pequeñas diferencias en la celda B normalizada mediciones de OCR pueden ser una indicación indirecta de que las células B desempeñan mejor en 2.5 x 10 5 células / pocillo en comparación con otras densidades celulares. En todos los sentidos, 0,625 x 10 5 células / pocillo dio resultados óptimos, lo que demuestra que esta densidad de cultivo es insuficiente. La respiración de línea de base, fuga de protones, la respiración mitocondrial máxima, la respiración no mitocondrial y la producción de ATP linealmente correlacionados con densidades de chapado para todos los tipos de células (Figura 4C). Además, la mayoría de la respiración de línea de base se utiliza para la síntesis de ATP, como se indica por la fuga de protones bajo en los tres tipos de células. Mientras que el objetivo principal del experimento estrés mitocondrial es medir los cambios en OCR, la ECAR sigue siendo útil para grabar para asegurar que el ensayo se llevó a cabo con éxito. Al igual que el OCR, las dos densidades más altas de chapado resultaron en mayor ECAR y respuestas más dramáticas de oligomicina, 2,4-DNP, y antimicina A / rotenona (Figura 4D). Los cambios dramáticos en ECAR después de la adición de 2,4-DNP, y antimicina A / rotenona pueden deberse a cambios en la respiración además de los cambios en glycolysis, ya que el CO 2 generado en el ciclo de Krebs se convierte en HCO 3 - y H +. Este problema ha sido abordado recientemente, y existe un método simple para corregir la señal total de acidificación extracelular en términos de consumo de oxígeno, para obtener la tasa glucolítica verdadera 12,29. El ensayo de estrés glucólisis era más exitoso en la más alta densidad de placas (Figura 5A, B). En todos los tipos de células, las muestras de 5 x 10 5 células / pocillo tenían los mayores cambios en ECAR después de la adición de glucosa, oligomicina, y 2-DG (Figura 5B). Además, la normalización de la concentración de proteínas demostró que para todos los tipos de células, las 5 x 10 5 células / pocillo muestras dieron resultados óptimos, mientras que concentraciones más bajas -especialmente 0,625 x 10 5 células / pocillo-no mostraron una robusta capacidad de reserva glucolítica. No glycolytic acidificación, la glucólisis y la capacidad glucolítica aparente linealmente correlacionados con densidades de chapado para todos los tipos de células (Figura 5C). Para el experimento de estrés glucólisis, el gráfico muestra que la glucosa OCR estimula ligeramente la respiración mitocondrial, que después se inhibió por el tratamiento oligomicina; la adición de 2-DG no afectó a la OCR (Figura 5D). El gráfico de OCR se puede utilizar como un indicador adicional de que el experimento estrés glucólisis se realizó con éxito. Además, el gráfico de OCR se puede utilizar para corregir el gráfico ECAR, si es necesario, como se explicó anteriormente en el caso de la prueba de estrés mitocondrial 12,29. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Figura 1:. Esquema de ensayos de flujo extracelulares (A) Ilustración de la glucólisis (izquierda) y la fosforilación oxidativa (derecha) que muestra la acción de lamedicamentos metabólicos utilizados en los ensayos de flujo extracelular. (B) Esquema de la gráfica velocidad de acidificación extracelular (ECAR); esquemática del gráfico de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Figura 2: gating paso a paso de las células T, células B, y los esplenocitos para determinar la viabilidad y la pureza de citometría de flujo gráficos que muestran la viabilidad de las células T, los esplenocitos y células B (A); y la pureza de células T y B (B). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de TH</a>es figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Figura 3:. Confluencia de la célula se correlaciona con las concentraciones de proteínas de lisado de cada tipo de células a diferentes densidades de chapado (A) micrografías de luz de células en pocillos de placas de ensayo a densidades de chapado que van desde 5 x 10 5 células / pocillo a 0,625 x 10 5 células / bien. Las barras de escala indican 50 micras. Las concentraciones de proteína (B) lisado a diferentes densidades de chapado, medido por el ensayo de BCA. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Figura 4:<html> Ensayo mitocondrial estrés. Raw (A) y OCR estandarizada (B) para cada tipo de célula y densidad de placas se muestran. (C) Teléfonos cambios dependientes de números-en los niveles de línea de base, y la respiración mitocondrial máxima no mitocondrial, así como los consumos de oxígeno vinculados a la fuga de protones o de la producción de ATP, se muestran para cada tipo de células. Se muestran los valores (D) Raw ECAR obtenidos de las pruebas de resistencia mitocondriales. Cada punto de datos representa la media de 7-8 pocillos con desviación estándar. flechas etiquetadas denotan inyecciones de oligomicina (O), 2,4-DNP (D), y la rotenona / antimicina A (R / A). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5:. Ensayo de estrés glicolítica Raw (A) y ECAR estandarizada (B) para cada tipo de célula y densidad de placas se muestran. (C) se muestran los cambios depende del número de células en el CERA de acidificación no glucolítica, la glucólisis inducida por glucosa y la capacidad glucolítica total. Se muestran los valores (D) Raw OCR obtenidos de las pruebas de resistencia glicolíticas. Cada punto de datos representa la media de 7-8 pocillos con desviación estándar. flechas etiquetadas denotan inyecciones de glucosa (G), oligomicina (O), y 2-desoxiglucosa (2-DG). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El estudio del metabolismo es cada vez más relevante para la investigación inmunológica. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la glucólisis y la respiración mitocondrial en esplenocitos de ratón y linfocitos T y B.

Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

El objetivo general de este procedimiento es medir con precisión la glucólisis y la respiración mitocondrial en linfocitos utilizando un ensayo de flujo extracelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunometabolismo, como qué cambios metabólicos ocurren en las células inmunitarias tras la activación, la diferenciación o durante la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis eficiente y en tiempo real de los perfiles metabólicos de más de 90 muestras al mismo tiempo.Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo de los linfocitos, también puede aplicarse a otras células, incluidas las no adherentes, que requieren la adición de placas con mínima alteración de su funcionalidad. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los linfocitos son frágiles y requieren un manejo cuidadoso para mantener su funcionalidad y viabilidad. El día anterior al experimento, retire el cartucho de sensores del analizador de flujo extracelular y llene cada pocillo de la placa de utilidad con 200 microlitros de solución calibradora.A continuación, coloque el cartucho sobre la placa, sumergiendo los sensores en la solución de calibración, e incube el cartucho durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono ni nitrógeno. A la mañana siguiente, cubra cada pocillo de una placa de ensayo de 96 pocillos con 25 microlitros de solución adhesiva e incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos. Al final de la incubación, aspire la solución adhesiva y lave cada pocillo dos veces con 200 microlitros de agua estéril.Mientras la placa se seca al aire, coloque un filtro celular de 70 micrones sobre un tubo cónico de 50 mililitros y transfiera los órganos recolectados al filtro. Utilizando el émbolo de una jeringa estéril de tres mililitros, triture el tejido a través del filtro, manteniendo húmedos el filtro y los órganos durante todo el proceso de maceración mediante la adición de tampón MS según sea necesario. A continuación, enjuague el filtro con cinco a 10 mililitros de tampón MS, seguido de la centrifugación de la suspensión celular resultante.ReSuspender el sedimento en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos ACK. Después de cinco minutos en hielo, restablezca la tenacidad con 10 a 20 mililitros de tampón MS y centrifugue las células nuevamente. Al final de la centrifugación, coloque un filtro celular de 30 micrones sobre un tubo cónico de 15 mililitros y prepare el filtro con un mililitro de tampón MS.Re-suspender las células en cinco mililitros de tampón MS fresco y filtrar la suspensión celular a través del filtro para eliminar los agregados de glóbulos rojos lisados. Añadir cuatro mililitros de tampón MS fresco para enjuagar el tubo de lisis vacío y pasar el lavado a través del filtro. Contar las células y alícuotar un número apropiado de esplenocitos para el ensayo de flujo extracelular.Luego, centrifugue ambos conjuntos de células, resuspendiendo la muestra de esplenocitos para el ensayo de flujo extracelular en cinco mililitros de medio RF 10 sobre hielo. Resuspenda las células para el aislamiento con perlas en los volúmenes adecuados de cóctel de anticuerpos biotinilados, microperlas anti-biotina y tampón MS durante los tiempos de incubación indicados a dos a ocho grados Celsius. Al final de la segunda incubación, recoja las células por centrifugación y resuspenda el sedimento en 500 microlitros de tampón MS fresco por cada uno por diez a la ocho células.A continuación, coloque la columna adecuada en el imán de separación y prepare la columna con tres mililitros de tampón MS, descartando el flujo que atraviesa. Coloque un tubo cónico estéril de 15 mililitros debajo de la columna y cargue en ella todo el volumen de la muestra celular. Luego, enjuague el tubo de incubación celular con tres mililitros de tampón MS fresco, recolectando el lavado en el tubo cónico.Después de recolectar el último eluido, complete el tubo hasta un volumen final de 15 mililitros de tampón MS y centrifugue las células aisladas negativamente. Luego, re suspenda el precipitado en cinco mililitros de medio RF 10 fresco sobre hielo. No más de tres horas después del aislamiento, centrifugue todas las muestras de células y re suspenda los precipitados en cinco mililitros del medio de ensayo apropiado para otra centrifugación.Después de la segunda centrifugación, volver a suspender los pellets a la concentración experimental adecuada para obtener un volumen final de 180 microlitros de células por pocillo en medio de ensayo fresco e inocular 180 microlitros de células en cada pocillo de la placa. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 25 minutos. Luego centrifugar la placa para adherir firmemente las células al fondo de los pocillos y devolver la placa al incubador.Después de 30 minutos, utilice una micropipeta para cargar los compuestos de interés recién preparados a 37 grados Celsius en los puertos inyectores correspondientes del cartucho de sensores del analizador de flujo extracelular, cargando los puertos de control de fondo y no experimentales con medio únicamente. Devuelva el cartucho cargado al incubador y configure el programa del ensayo de flujo extracelular. A continuación, cargue el cartucho e inicie el programa, reemplazando la placa de calibración con la placa de ensayo tras la calibración, según se indique.Después del ensayo de flujo extracelular, continúe con las mediciones del contenido proteico. Más del 90 % de todas las poblaciones celulares son viables, con una pureza observada del 98 al 99 % para los linfocitos. La confluencia de cada tipo celular se correlaciona con las densidades iniciales de siembra.Las concentraciones de proteína del lisado presentan una correlación lineal con las densidades de siembra, lo que confirma que las concentraciones de proteína pueden utilizarse para normalizar con precisión los datos de flujo extracelular. Un mayor número de células se correlaciona con una tasa medida de consumo de oxígeno más elevada, así como con respuestas más pronunciadas a inhibidores mitocondriales. Densidades de siembra más altas producen mediciones similares de la tasa de consumo de oxígeno normalizada en linfocitos T y esplenocitos, mientras que cinco y 1,25 veces 10 a la cinco células por pocillo producen mediciones similares de la tasa de consumo de oxígeno normalizada en células B.Los parámetros de la respiración mitocondrial también presentan una correlación lineal con las densidades de siembra. Además, la baja fuga de protones indica que la mayor parte de la respiración basal se destina a la síntesis de ATP. Densidades de siembra más altas dan lugar a tasas más elevadas de acidificación extracelular y a respuestas mayores frente a inhibidores mitocondriales.Los parámetros de la glucólisis se correlacionan linealmente con las densidades de siembra celular, siendo la alta densidad de siembra la más óptima para un ensayo de estrés glucolítico exitoso. La glucosa estimula ligeramente la respiración mitocondrial, la cual es inhibida por oligomicina, mientras que el 2-DG no afecta significativamente el consumo de oxígeno. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis a ocho horas si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en hielo antes del análisis de flujo extracelular y contar y sembrar las células con precisión. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición del potencial mitocondrial y la captación de glucosa, para responder preguntas adicionales sobre el estado metabólico de las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar linfocitos y realizar un ensayo de flujo extracelular.

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