Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

El objetivo general de este procedimiento es medir con precisión la glucólisis y la respiración mitocondrial en linfocitos utilizando un ensayo de flujo extracelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunometabolismo, como qué cambios metabólicos ocurren en las células inmunitarias tras la activación, la diferenciación o durante la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis eficiente y en tiempo real de los perfiles metabólicos de más de 90 muestras al mismo tiempo.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo de los linfocitos, también puede aplicarse a otras células, incluidas las no adherentes, que requieren la adición de placas con mínima alteración de su funcionalidad. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los linfocitos son frágiles y requieren un manejo cuidadoso para mantener su funcionalidad y viabilidad. El día anterior al experimento, retire el cartucho de sensores del analizador de flujo extracelular y llene cada pocillo de la placa de utilidad con 200 microlitros de solución calibradora.

A continuación, coloque el cartucho sobre la placa, sumergiendo los sensores en la solución de calibración, e incube el cartucho durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius sin dióxido de carbono ni nitrógeno. A la mañana siguiente, cubra cada pocillo de una placa de ensayo de 96 pocillos con 25 microlitros de solución adhesiva e incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos. Al final de la incubación, aspire la solución adhesiva y lave cada pocillo dos veces con 200 microlitros de agua estéril.

Mientras la placa se seca al aire, coloque un filtro celular de 70 micrones sobre un tubo cónico de 50 mililitros y transfiera los órganos recolectados al filtro. Utilizando el émbolo de una jeringa estéril de tres mililitros, triture el tejido a través del filtro, manteniendo húmedos el filtro y los órganos durante todo el proceso de maceración mediante la adición de tampón MS según sea necesario. A continuación, enjuague el filtro con cinco a 10 mililitros de tampón MS, seguido de la centrifugación de la suspensión celular resultante.

ReSuspender el sedimento en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos ACK. Después de cinco minutos en hielo, restablezca la tenacidad con 10 a 20 mililitros de tampón MS y centrifugue las células nuevamente. Al final de la centrifugación, coloque un filtro celular de 30 micrones sobre un tubo cónico de 15 mililitros y prepare el filtro con un mililitro de tampón MS.

Re-suspender las células en cinco mililitros de tampón MS fresco y filtrar la suspensión celular a través del filtro para eliminar los agregados de glóbulos rojos lisados. Añadir cuatro mililitros de tampón MS fresco para enjuagar el tubo de lisis vacío y pasar el lavado a través del filtro. Contar las células y alícuotar un número apropiado de esplenocitos para el ensayo de flujo extracelular.

Luego, centrifugue ambos conjuntos de células, resuspendiendo la muestra de esplenocitos para el ensayo de flujo extracelular en cinco mililitros de medio RF 10 sobre hielo. Resuspenda las células para el aislamiento con perlas en los volúmenes adecuados de cóctel de anticuerpos biotinilados, microperlas anti-biotina y tampón MS durante los tiempos de incubación indicados a dos a ocho grados Celsius. Al final de la segunda incubación, recoja las células por centrifugación y resuspenda el sedimento en 500 microlitros de tampón MS fresco por cada uno por diez a la ocho células.

A continuación, coloque la columna adecuada en el imán de separación y prepare la columna con tres mililitros de tampón MS, descartando el flujo que atraviesa. Coloque un tubo cónico estéril de 15 mililitros debajo de la columna y cargue en ella todo el volumen de la muestra celular. Luego, enjuague el tubo de incubación celular con tres mililitros de tampón MS fresco, recolectando el lavado en el tubo cónico.

Después de recolectar el último eluido, complete el tubo hasta un volumen final de 15 mililitros de tampón MS y centrifugue las células aisladas negativamente. Luego, re suspenda el precipitado en cinco mililitros de medio RF 10 fresco sobre hielo. No más de tres horas después del aislamiento, centrifugue todas las muestras de células y re suspenda los precipitados en cinco mililitros del medio de ensayo apropiado para otra centrifugación.

Después de la segunda centrifugación, volver a suspender los pellets a la concentración experimental adecuada para obtener un volumen final de 180 microlitros de células por pocillo en medio de ensayo fresco e inocular 180 microlitros de células en cada pocillo de la placa. Incubar las células a 37 grados Celsius durante 25 minutos. Luego centrifugar la placa para adherir firmemente las células al fondo de los pocillos y devolver la placa al incubador.

Después de 30 minutos, utilice una micropipeta para cargar los compuestos de interés recién preparados a 37 grados Celsius en los puertos inyectores correspondientes del cartucho de sensores del analizador de flujo extracelular, cargando los puertos de control de fondo y no experimentales con medio únicamente. Devuelva el cartucho cargado al incubador y configure el programa del ensayo de flujo extracelular. A continuación, cargue el cartucho e inicie el programa, reemplazando la placa de calibración con la placa de ensayo tras la calibración, según se indique.

Después del ensayo de flujo extracelular, continúe con las mediciones del contenido proteico. Más del 90 % de todas las poblaciones celulares son viables, con una pureza observada del 98 al 99 % para los linfocitos. La confluencia de cada tipo celular se correlaciona con las densidades iniciales de siembra.

Las concentraciones de proteína del lisado presentan una correlación lineal con las densidades de siembra, lo que confirma que las concentraciones de proteína pueden utilizarse para normalizar con precisión los datos de flujo extracelular. Un mayor número de células se correlaciona con una tasa medida de consumo de oxígeno más elevada, así como con respuestas más pronunciadas a inhibidores mitocondriales. Densidades de siembra más altas producen mediciones similares de la tasa de consumo de oxígeno normalizada en linfocitos T y esplenocitos, mientras que cinco y 1,25 veces 10 a la cinco células por pocillo producen mediciones similares de la tasa de consumo de oxígeno normalizada en células B.

Los parámetros de la respiración mitocondrial también presentan una correlación lineal con las densidades de siembra. Además, la baja fuga de protones indica que la mayor parte de la respiración basal se destina a la síntesis de ATP. Densidades de siembra más altas dan lugar a tasas más elevadas de acidificación extracelular y a respuestas mayores frente a inhibidores mitocondriales.

Los parámetros de la glucólisis se correlacionan linealmente con las densidades de siembra celular, siendo la alta densidad de siembra la más óptima para un ensayo de estrés glucolítico exitoso. La glucosa estimula ligeramente la respiración mitocondrial, la cual es inhibida por oligomicina, mientras que el 2-DG no afecta significativamente el consumo de oxígeno. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis a ocho horas si se realiza adecuadamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en hielo antes del análisis de flujo extracelular y contar y sembrar las células con precisión. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición del potencial mitocondrial y la captación de glucosa, para responder preguntas adicionales sobre el estado metabólico de las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar linfocitos y realizar un ensayo de flujo extracelular.