Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

El objetivo general de este procedimiento es introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química, como la modificación de proteínas, la ingeniería y la conjugación. La principal ventaja de esta técnica es que la sonda o el caldo objetivo pueden introducirse en proteínas o anticuerpos de forma específica en el sitio mediante una simple mezcla.

Después de construir los plásmidos, agregue un microlitro de cada uno a 20 microlitros de la cepa de E.Coli DH10-beta a una concentración de dos veces 10 a las ocho células por microlitro a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Utilice una pipeta para mezclar suavemente la solución. A continuación, coloque 20 microlitros de la solución mezclada en una cubeta limpia.

Ajuste la máquina de electroporación a 25 microfaradios y 2,5 kilovoltios. A continuación, inserte la cubeta en la corredera de la cámara de choque. Empuje la corredera dentro de la cámara hasta que la cubeta haga contacto firme con los electrodos de la cámara.

Presione el botón de pulso una vez hasta que la máquina de electroporación emita un pitido. Después de esto, agregue un mililitro de medio SOC a la cubeta rápidamente. Luego transfiera la mezcla a un tubo de ensayo.

Incubar agitando a 37 grados centígrados durante una hora. Una vez completada la incubación, extienda las células de E. Coli transformadas en placas de agar de caldo de lisogén que contengan los antibióticos adecuados. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 12 horas.

Una vez completada la incubación en placa, inocule una sola colonia transformada en cinco mililitros de medio LB que contenga antibióticos. Incubar agitando durante 12 horas a 37 grados centígrados. A continuación, transfiera el cultivo primario a 200 mililitros de medio LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina y un milimolar de FA. Incubar agitando a 37 grados centígrados durante al menos tres horas.

Añadir dos mililitros de arabinosa 1,6 molar cuando el cultivo alcance una densidad óptica de 0,8 a 550 nanómetros. Luego incubar agitando a 30 grados centígrados durante 12 horas. Una vez finalizada la incubación, recoja las células por centrifugación a 11.000 veces g durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y congele el pellet a 20 grados centígrados negativos. Cuando esté listo para lisar las células, vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de tampón de lisis paraplásmica en un tubo de centrífuga nuevo. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora.

A continuación, centrifugar el lisado celular a 18.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet. A continuación, añade 400 microlitros de una suspensión de resina Ni-NTA.

Con un rotador, agite suavemente el tubo durante una hora a cuatro grados centígrados. Una vez completada la mezcla, vierta la suspensión en una columna de polipropileno. Lava la resina tres veces con cinco mililitros de tampón de lavado.

Eluir el anticuerpo objetivo con 300 microlitros de tampón de elución. Después de esto, determine la concentración de la proteína mutante como se describe en el protocolo de texto. Comience agregando 10 microlitros de una solución de 10 micromolares de HerFab-L177AF en tampón de fosfato que contiene 10 milimolares de fosfato de sodio dibásico y 100 milimolares de cloruro de sodio a un tubo de centrífuga nuevo.

A continuación, añada 20 microlitros de una solución de 200 micromolares de Cy 5,5 azadibenzociclooctina en agua. Después de esto, cubra el recipiente de reacción con papel de aluminio. Deje que la reacción de cicloedición promovida por la mancha continúe durante seis horas a 37 grados centígrados.

Una vez completada la reacción, agregue 30 microlitros de muestra y 450 microlitros de tampón de fosfato para lavar el tinte Cy 5.5 libre en una columna de centrifugado de filtro. Centrifugar la columna de centrifugación a 14.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el flujo continuo y luego transfiera la muestra purificada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Guarde el HerFab etiquetado purificado a cuatro grados centígrados a menos que esté listo para el análisis. Comience agregando 13 microlitros de HerFab purificado de 7.8 micromolares a un tubo nuevo. A continuación, añada cinco microlitros de tampón de muestra de proteína LDS.

Incuba la mezcla a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, conecte el casete de gel Bis-Tris SDS-PAGE de cuatro a 12% a la celda de electroforesis. Agregue el búfer en ejecución.

A continuación, cargue las muestras de proteínas conjugadas en el generador de peso molecular preteñido. Realice la electroforesis en gel durante 35 minutos a 200 voltios. Una vez completada la electroforesis, transfiera el gel a un sistema de documentación y análisis de gel.

Escanee el gel en busca de Cy 5.5 y luego tiña el gel con una tinte de proteína comercial. En este estudio, el fragmento de anticuerpo Her-Fab se conjuga específicamente con un Esto se logra incorporando un aminoácido que contiene azida en el fragmento y luego reaccionando el fragmento de anticuerpo mutante con un ciclooctino tensado. El análisis SDS-PAGE se realiza para proteínas mutantes expresadas con y sin el aminoácido que contiene azida.

Como se puede observar, el fragmento de anticuerpo de longitud completa se obtuvo solo en presencia del aminoácido. El anticuerpo que contiene el aminoácido se evalúa para su conjugación mediante una reacción con un derivado de azadibenzociclooctino unido a Cy 5.5 Cy 5.5 y se analiza mediante SDS-PAGE. Las imágenes de fluorescencia muestran la conjugación del fragmento de anticuerpo mutante con Cy 5.5, mientras que no se observó ninguna conjugación en el control.

Una vez que se haya expresado y purificado correctamente su proteína con acetilfenilalanina, la proteína se puede marcar de manera eficiente con una sonda con la cepa. Debido a que la reacción de marcaje no requiere reactivo adicional, puede introducir la sonda en su proteína objetivo simplemente mezclando la sonda con su proteína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo introducir una sonda química específica en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida.