Name: Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a introducir sondas químicas en fragmentos de anticuerpos mediante incorporación genética de aminoácidos con azida y cicloadición SPAAC. Este método permite marcar proteínas específicamente para estudiar interacciones proteicas.

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1. Construcción del plásmido <ol><li> Construir un plásmido de expresión (pBAD-HerFab-L177TAG) que exprese el gen del anticuerpo diana (pBAD-HerFab-WT) con un 6-Su etiqueta, y sustituir el codón para leucina-177 con el codón ámbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénesis dirigida al sitio convencional. Véase la Tabla de Materiales. </li><li> Construir otro plásmido de expresión (pEVOL-AFRS) que contiene los genes para el evolucionado tRNA Tyr y aminoacil-tRNA sintetasa par (aaRs). Utilice el vector plásmido especialmente diseñado, pEVOL, para su incorporación eficiente de UAAs. Los protocolos detallados de información y plásmido de clonación se describen en el informe anterior. 28 </li><li> Obtener ADN plásmido de alta calidad mediante el uso de kits de preparación de plásmidos disponibles comercialmente. La relación 260/280 de ~ 1,8 es óptimo para el ADN purificado. Si es necesario, llevar a cabo la electroforesis en gel de agarosa al 1% para comprobar la pureza de la DNA. </li></ol><ol><li> La electroporación <ol><li> Añadir cada ADN 1 l de pEVOL-AFRS 28 y pBAD-HerFab-L177TAG a 20 l cepa de Escherichia coli DH10β. Mezclar con cuidado, usando una pipeta. Los plásmidos se pueden transformar juntos o en reacciones independientes. </li><li> Para cubetas de 0,1 cm, establecer la configuración de electroporación a 25 mF y 2,5 kV. </li><li> Insertar la cubeta en el portaobjetos de la cámara impactante. Empuje la corredera en la cámara hasta que la cubeta haga contacto con los electrodos de la cámara. </li><li> Pulso vez pulsando el botón de pulso hasta que la máquina emite un pitido electroporación. </li><li> Añadir 1 ml de caldo súper óptima con represión catabólica (SOC) medio que contiene 2% (w / v) triptona, 0.5% (w / v) de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl 2, y glucosa 20 mM a la cubeta de forma rápida y transferir la mezcla a un tubo de ensayo. Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C con agitación.</li><li> Spread transformado células de E. coli en caldo de Lisogenia (LB) placas de agar que contenían los antibióticos apropiados (35 mg / ml de cloranfenicol y 100 mg / ml de ampicilina para la selección de pEVOL-AFRS y pBAD-HerFab-L177TAG, respectivamente). Las placas se incuban a 37 ° C durante 12 h. </li></ol></li><li> preparación de cultivo <ol><li> Se inocula una sola colonia transformada en medio que contiene 5 ml de LB antibióticos. Incubar durante 12 horas a 37 ° C con agitación. </li></ol></li></ol> 3. Expresión y purificación de HerFab-L177AF <ol><li> Expresión de HerFab-L177AF <ol><li> Transferir el cultivo primario (5 ml) en 200 ml de LB medio que contiene ampicilina (100 mg / ml) y AF (1 mM), seguido de incubación a 37 ° C con agitación. NOTA: mM AF 100 solución madre (10 ml) se preparó disolviendo 206 mg AF en 100 mM de ácido clorhídrico (10 ml, el volumen final). </li><li> Añadir 2 ml de 1,6 M arabinosa (16mM concentración final) cuando el cultivo alcanzó la fase logarítmica (DO550 = 0,8, DO = densidad óptica). Incubar durante 12 horas a 30 ° C con agitación. </li><li> Cosecha células por centrifugación a 11.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y congelar el sedimento a -20 ° C. </li></ol></li><li> Lisis celular <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares en 20 ml de tampón de lisis que contiene 30 mM periplásmico Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 20% de sacarosa, y 0,2 mg / ml de lisozima, y ​​se incuba la mezcla durante 1 h a 37 ° C. </li><li> Centrifugar el lisado de células a 18.000 xga 4 ° C durante 15 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y desechar el sedimento. </li></ol></li><li> Cromatografía de afinidad Ni-NTA <ol><li> Añadir suspensión de resina Ni-NTA a cada tubo de centrífuga (400 l de resina para una cultura 200 ml), y se mezcla suavemente a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Se vierte la suspensión en una columna de polipropileno y lavar la resina tres veces con 5 ml de lavado buffer que contiene 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazol 20 mM, y NaCl 300 mM. </li><li> Eluir el anticuerpo diana con tampón de elución 300 l que contiene mM NaH 2 PO 4 50 (pH 8,0), imidazol 250 mM, y NaCl 300 mM. </li><li> Determinar la concentración de la proteína mutante por ensayo de proteínas de Bradford 29 o mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. Calcular el coeficiente de extinción (75.866 M -1 cm -1) para HerFab-L177AF a 280 nm mediante la calculadora coeficiente de extinción de proteínas utilizando el coeficiente de extinción (2.471 M -1 cm -1) para la FA. NOTA: La secuencia de aminoácidos de HerFab se puede encontrar en el sitio web de NCBI (GI: 783 282 791 y GI: 783282792). </li></ol></li></ol> 4. La conjugación de Purificada HerFab-L177AF con Acetileno Sondas Uso de cicloadición de azida-alquino Strain-promovido (SPAAC) <ol><li> Añadir 20 l de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) en H2O (20081; M concentración final) a una solución de 10 l de HerFab-L177AF (10 mM de concentración final) en tampón de fosfato que contiene 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) y NaCl 100 mM. NOTA: Como alternativas, cyclooctyne difluorado (DIFO) y biciclo [6.1.0] derivados nonino (BCN) también están disponibles para la misma aplicación. </li><li> Deje que la reacción de cicloadición cepa ascendido a proceder durante 6 horas a 37 ° C. Si se utiliza una sonda sensible a la luz (por ejemplo, Cy5.5), cubra el recipiente de reacción con papel de aluminio. </li><li> Se purifica el HerFab etiquetados de acuerdo con el paso 5. </li></ol> 5. Purificación de HerFab Etiquetada <ol><li> Añadir 500 l de muestra a una columna de filtro giratorio centrífugo. </li><li> Se centrifuga la columna de centrifugación a 14.000 xga 4 ° C durante 15 minutos. </li><li> Descarte el filtrado y la transferencia purificados muestra de la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Como una alternativa al paso de 5.1 5.3, realice Purificación por diálisis contra el mismo tampón. </li><li> Almacenar el HerFab marcada purificada a 4 ° C. </li></ol> 6. SDS-PAGE análisis de HerFab Etiquetada <ol><li> Añadir 5 l LDS tampón de muestra de proteína que contiene 106 mM de Tris · HCl, mM de base 141 Tris (pH 8.5), 2% LDS, 10% de glicerol, EDTA mM 0,51, 0,22 mM SERVA azul G250, y fenol 0,175 mM roja a 13 l de purificado marcado HerFab (7,8 M o 0,38 mg / ml) en presencia (+) o ausencia (-) de 2 l de ditiotreitol (DTT, 100 mM de concentración final). Incubar la mezcla a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Una el Bis-Tris casete de gel de SDS-PAGE al 4-12% a la celda de electroforesis y añadir tampón de desarrollo. Cargar las muestras de proteínas conjugadas y el marcador de peso molecular pre-manchada. Realizar electroforesis en gel durante 35 minutos a 200 V. Nota: Mantenga la celda de electroforesis en la oscuridad durante todo el período de minimizar foto-blanqueo del fluoróforo. </li><li> Después de la electroforesis, la transferencia deel gel a un escáner gel fluorescente, y escanear de emisión de fluorescencia a la longitud de onda apropiada. Para Cy5.5, utilice el modo de Cy5 en el software del escáner. </li><li> Tinción del gel con una tinción de proteínas comercial. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La incorporación genética de aminoácidos no naturales en proteínas tiene varias ventajas sobre otros métodos utilizados para la modificación de proteínas. 1-3 Una de las ventajas importantes es su aplicabilidad general a cualquier tipo de proteína. En principio, no hay limitación en la selección de una proteína diana y un sitio diana de la proteína. Sin embargo, la sustitución de un residuo importante estructural o funcionalmente con un UAA puede dar lugar a la alteración de la estructura y función de la prot...

Desde que se informó de la incorporación genética de -methoxyphenylalanine p en Escherichia coli, 1 más de 100 aminoácidos no naturales (UAAs) se han incorporado con éxito en varias proteínas. 1-3 Entre estos UAAs, los aminoácidos que contienen grupos funcionales bioorthogonal han sido ampliamente estudiados y representan la proporción más grande. Los grupos funcionales bioorthogonal utilizados en los UAAs incluyen cetona, 4 azida, 5 alquino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturados amida, 9 norboneno, 10 transcyclooctene, 11 y biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 A pesar de que cada grupo funcional tiene sus ventajas y desventajas, los aminoácidos que contienen azida se han utilizado más ampliamente para la conjugación de la proteína. p -Azidophenylalanine (AF), uno de los aminoácidos que contienen azido-, está fácilmente disponible, y su incorporación efficiency es excelente. Las proteínas mutantes que contienen este aminoácido se pueden hacer reaccionar con alquinos de cicloadición catalizada con cobre o con cyclooctynes ​​por SPAAC. 12-20 Recientemente, los productos biofarmacéuticos han estado atrayendo una gran atención en la industria farmacéutica. El conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) es una clase de anticuerpos terapéuticos que son ventajosos debido a su capacidad para la terapia dirigida para el tratamiento de cánceres humanos 21 y otras enfermedades. Más de 50 ADC están actualmente en ensayos clínicos, y el número está aumentando rápidamente. En el desarrollo de ADCs, muchos factores necesitan ser considerados para maximizar la eficacia y minimizar los efectos secundarios. Entre estos factores, una reacción de conjugación eficaz y específica de sitio para formar un enlace covalente entre un anticuerpo y un fármaco es crítica. La eficiencia deseada y especificidad en la reacción de conjugación se puede lograr mediante conjugación con un grupo funcional en un bioorthogonalno natural de aminoácidos que se incorpora específicamente en un anticuerpo. 22-26 Aquí, se presenta un protocolo para incorporar específicamente en el sitio AF en un fragmento de anticuerpo y el conjugado del fragmento de anticuerpo mutante con una sonda de bioquímica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Construcción > plásmido </</td></tr><tr><td>plásmido fuerte pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>Opcionalmente contiene el codón de parada ámbar (TAG) en la posición deseada. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plásmido pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., y Schultz, P. G. Un sistema mejorado para la mutagénesis de aminoácidos no naturales en E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Host Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4">2. Preparación de cultivos</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Electroporación</fuerte></td></tr><tr><td>Micro emisor de impulsos</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Micro cubeta de impulsos</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm espacio entre electrodos, paquete de 50</td></tr><tr><td>Ampicilina Sódica</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC medio</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Expresión y purificación de HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Expresión de Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanina (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinosa, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>3.2 Lisis Celular</fuerte></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA sal disódica dihidratada, 99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>3.3 Cromatografía de afinidad Ni-NTA</fuerte></td></tr><tr><td>Resina de Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Columna de polipropileno</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/paquete, capacidad de 1 mL</td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>4. Conjugación de HerFab-L177AF purificado con sondas de alquino utilizando cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5. Purificación de</td></tr> <tr><td>filtros centrífugos HerFabAmicon Ultra 0.5 mL</td> etiquetados <td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/paquete, 500 &#956; L capacity</td></tr><tr><td colspan="4">6. Análisis SDS-PAGE de escaneo de gel fluorescente y HerFab marcado</td></tr><tr><td>1,4-ditio-DL-treitol, DTT, 99.5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Tampón de muestra NuPAGE LDS, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Tampón de funcionamiento MES</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% Geles SDS PAGE</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>de 12 pocillos</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 generador de imágenes de modo variable</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino strain-promovido

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Actualmente hay muchas herramientas químicas disponibles para introducir sondas químicas a las proteínas para estudiar su estructura y función. Un método útil es la conjugación de proteínas genéticamente mediante la introducción de un aminoácido no natural que contiene un grupo funcional bioorthogonal. Este informe describe un protocolo detallado para la conjugación de anticuerpo específico del sitio. El protocolo incluye detalles experimentales para la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida-, y la reacción de conjugación por cicloadición de azida-alquino cepa promovido (SPAAC). Esta reacción cepa promovido procede por simple mezcla de las moléculas que reaccionan a pH y temperatura fisiológica, y no requiere reactivos adicionales, tales como iones de cobre (I) y ligandos quelantes de cobre. Por lo tanto, este método sería útil para la conjugación de proteínas en general y el desarrollo de conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC).

En este estudio, un fragmento de anticuerpo era específicamente en el sitio conjugado con un fluoróforo mediante la incorporación de un aminoácido que contiene azida-en el fragmento y hacer reaccionar el fragmento de anticuerpo mutante con un cyclooctyne tensa (Figura 1). HerFab fue seleccionado como el fragmento de anticuerpo de destino en la que la FA fue incorporado como un aminoácido que contiene azida. Para elegir el residuo en HerFab para la sustitución con FA, se ...

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

El objetivo general de este procedimiento es introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología química, como la modificación de proteínas, la ingeniería y la conjugación. La principal ventaja de esta técnica es que la sonda o el caldo objetivo pueden introducirse en proteínas o anticuerpos de forma específica en el sitio mediante una simple mezcla.Después de construir los plásmidos, agregue un microlitro de cada uno a 20 microlitros de la cepa de E.Coli DH10-beta a una concentración de dos veces 10 a las ocho células por microlitro a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Utilice una pipeta para mezclar suavemente la solución. A continuación, coloque 20 microlitros de la solución mezclada en una cubeta limpia.Ajuste la máquina de electroporación a 25 microfaradios y 2,5 kilovoltios. A continuación, inserte la cubeta en la corredera de la cámara de choque. Empuje la corredera dentro de la cámara hasta que la cubeta haga contacto firme con los electrodos de la cámara.Presione el botón de pulso una vez hasta que la máquina de electroporación emita un pitido. Después de esto, agregue un mililitro de medio SOC a la cubeta rápidamente. Luego transfiera la mezcla a un tubo de ensayo.Incubar agitando a 37 grados centígrados durante una hora. Una vez completada la incubación, extienda las células de E. Coli transformadas en placas de agar de caldo de lisogén que contengan los antibióticos adecuados. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 12 horas.Una vez completada la incubación en placa, inocule una sola colonia transformada en cinco mililitros de medio LB que contenga antibióticos. Incubar agitando durante 12 horas a 37 grados centígrados. A continuación, transfiera el cultivo primario a 200 mililitros de medio LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina y un milimolar de FA. Incubar agitando a 37 grados centígrados durante al menos tres horas.Añadir dos mililitros de arabinosa 1,6 molar cuando el cultivo alcance una densidad óptica de 0,8 a 550 nanómetros. Luego incubar agitando a 30 grados centígrados durante 12 horas. Una vez finalizada la incubación, recoja las células por centrifugación a 11.000 veces g durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y congele el pellet a 20 grados centígrados negativos. Cuando esté listo para lisar las células, vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de tampón de lisis paraplásmica en un tubo de centrífuga nuevo. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora.A continuación, centrifugar el lisado celular a 18.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet. A continuación, añade 400 microlitros de una suspensión de resina Ni-NTA.Con un rotador, agite suavemente el tubo durante una hora a cuatro grados centígrados. Una vez completada la mezcla, vierta la suspensión en una columna de polipropileno. Lava la resina tres veces con cinco mililitros de tampón de lavado.Eluir el anticuerpo objetivo con 300 microlitros de tampón de elución. Después de esto, determine la concentración de la proteína mutante como se describe en el protocolo de texto. Comience agregando 10 microlitros de una solución de 10 micromolares de HerFab-L177AF en tampón de fosfato que contiene 10 milimolares de fosfato de sodio dibásico y 100 milimolares de cloruro de sodio a un tubo de centrífuga nuevo.A continuación, añada 20 microlitros de una solución de 200 micromolares de Cy 5,5 azadibenzociclooctina en agua. Después de esto, cubra el recipiente de reacción con papel de aluminio. Deje que la reacción de cicloedición promovida por la mancha continúe durante seis horas a 37 grados centígrados.Una vez completada la reacción, agregue 30 microlitros de muestra y 450 microlitros de tampón de fosfato para lavar el tinte Cy 5.5 libre en una columna de centrifugado de filtro. Centrifugar la columna de centrifugación a 14.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el flujo continuo y luego transfiera la muestra purificada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Guarde el HerFab etiquetado purificado a cuatro grados centígrados a menos que esté listo para el análisis. Comience agregando 13 microlitros de HerFab purificado de 7.8 micromolares a un tubo nuevo. A continuación, añada cinco microlitros de tampón de muestra de proteína LDS.Incuba la mezcla a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, conecte el casete de gel Bis-Tris SDS-PAGE de cuatro a 12% a la celda de electroforesis. Agregue el búfer en ejecución.A continuación, cargue las muestras de proteínas conjugadas en el generador de peso molecular preteñido. Realice la electroforesis en gel durante 35 minutos a 200 voltios. Una vez completada la electroforesis, transfiera el gel a un sistema de documentación y análisis de gel.Escanee el gel en busca de Cy 5.5 y luego tiña el gel con una tinte de proteína comercial. En este estudio, el fragmento de anticuerpo Her-Fab se conjuga específicamente con un Esto se logra incorporando un aminoácido que contiene azida en el fragmento y luego reaccionando el fragmento de anticuerpo mutante con un ciclooctino tensado. El análisis SDS-PAGE se realiza para proteínas mutantes expresadas con y sin el aminoácido que contiene azida.Como se puede observar, el fragmento de anticuerpo de longitud completa se obtuvo solo en presencia del aminoácido. El anticuerpo que contiene el aminoácido se evalúa para su conjugación mediante una reacción con un derivado de azadibenzociclooctino unido a Cy 5.5 Cy 5.5 y se analiza mediante SDS-PAGE. Las imágenes de fluorescencia muestran la conjugación del fragmento de anticuerpo mutante con Cy 5.5, mientras que no se observó ninguna conjugación en el control.Una vez que se haya expresado y purificado correctamente su proteína con acetilfenilalanina, la proteína se puede marcar de manera eficiente con una sonda con la cepa. Debido a que la reacción de marcaje no requiere reactivo adicional, puede introducir la sonda en su proteína objetivo simplemente mezclando la sonda con su proteína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo introducir una sonda química específica en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida.

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Investigación

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Bioquímica

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Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

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Un protocolo optimizado para el radiomarcaje eficaz de nanopartículas de oro mediante el uso de una<sup&gt; 125</sup&gt; Azida grupo prostético marcado con I

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