Name: La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a inducir la diferenciación condrogénica de células madre derivadas de tejido adiposo mediante fuerza de gravedad centrífuga. Este método sin citocinas promueve la expresión de SOX9 para reparación de cartílago.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología de la Salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de subvención: HI14C2116) y por el Fondo de Investigación del Hospital St. Mary's de Seúl, Universidad Católica de Corea.

Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC16EAME0162) y lleva a cabo según las directrices del NIH. Todos los tejidos se obtuvieron con consentimiento informado por escrito. 1. La gravedad centrífuga Carga y Pellet Cultura <ol><li> Cultivo de células y la cosecha <ol><li> Cultura ASC (P2-P3; véase la Lista de Materiales) en Modificado Medio-bajo nivel de glucosa de Eagle de Dulbecco (DMEM-LG) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C en un incubador humidificado que contiene 5% de CO 2. </li><li> Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, se elimina el medio y se lavan las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). </li><li> Añadir 1 ml de PBS que contenía EDTA 1 mM y se incuba durante 2 min a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2. </li><li> Toque suavemente la placa de cultivo, añadir 4 ml de medio fresco, transferir las células aun tubo de 15 ml cónico, y centrifugar las células a 250 xg durante 2 min a temperatura ambiente (RT). </li></ol></li><li> Centrífuga de carga por gravedad <ol><li> Después de la centrifugación (paso 1.1.4), eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y volver a suspender el sedimento en 10 ml de DMEM-LG con 10% de SFB. Contar las células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Para CG de carga, la transferencia de 2,5 × 10 5 células a un nuevo tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 2400 xg durante 15 min. </li></ol></li><li> la cultura de pellets <ol><li> Inmediatamente después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de medio de diferenciación condrogénica definido (CDM, DMEM de alta glucosa suplementado con 1% de FBS,, 100 nM de dexametasona, solución de aminoácidos 1x MEM no esenciales 1% ITS + Premix, 50 g / ml de L-prolina, y 1% de penicilina / estreptomicina). Añadir 50 g / ml de recién preparada de ácido L-ascórbico 2-fosfato en cada cambio de medio. Como control positivo, inducir differentiati condrogénicasen las células no centrifugadas mediante la adición de CDM que contiene 10 ng / ml de TGF-β1. </li><li> Colocar los tubos tapados holgadamente que contienen las pastillas en una posición de pie y se incuba a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2. </li><li> Cambiar el medio cada dos días durante 3 semanas. </li></ol></li><li> cultura Micromass <ol><li> Inmediatamente después de la centrifugación (etapa 1.2.2; 2.400 × g durante 15 min), aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 l de CDM. </li><li> Para formar un Micromass, colocar las células resuspendidas en el centro de un pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Después de 2 h, se añade cuidadosamente 1 ml de MDL a la fuente, el pipeteado contra la pared de la placa para evitar la interrupción de la Micromass. Como control positivo, realizar un cultivo en micromasa con células no centrifugadas mediante la adición de CDM que contiene 10 ng / ml de TGF-β1. </li><li> Incubar la Micromass a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO 2. </li><li> Cambiar el medio evEry otro día durante 3 semanas. </li></ol></li></ol> 2. la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para detectar la transcripción regulación al alza de diferenciación condrogénica Marcadores <ol><li> En el día 14, utilizar una pipeta para transferir los gránulos esferoidales a un nuevo tubo de 1,5 ml y lavar en 1 x PBS. </li><li> Se extrae el ARN total de las pastillas utilizando el método de extracción con tiocianato-fenol-cloroformo guanidinio 9. </li><li> Sintetizar ADNc a partir de 2 g de ARN total usando la transcriptasa inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante (incubar a 42 ° C durante 1 h y después inactivar la enzima a 70 ° C durante 5 min). </li><li> Realizar PCR con cebadores específicos para los marcadores de diferenciación condrogénica 10. </li></ol> 3. La tinción para detectar la sobreexpresión de proteínas condrogénicas diferenciación de un marcador <ol><li> sedimentos de células de inclusión en parafina <ol><li> En el día 21,utilizar una pipeta para recoger las bolitas esferoide y lavarlos con PBS 1x. </li><li> Fijar los pellets de esferoides por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 24 h. Precaución: El paraformaldehído es altamente tóxico. Evitar el contacto con los ojos, la piel o las membranas mucosas. Minimizar la exposición y evitar la inhalación durante la preparación. Use equipo de protección personal adecuado. </li><li> Desechar el fijador y enjuagar los sedimentos celulares con agua desionizada (DW). </li><li> Colocar una capa de gasa sobre el cassette y transferir los pellets fijas usando una pipeta. Cubrir el sedimento doblando la gasa y cierre la tapa. </li><li> Deshidratar los pellets. <ol><li> Sumergir los gránulos en 70% de etanol (EtOH) durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los gránulos en 80% de EtOH durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los gránulos en 95% de EtOH durante 5 min a RT. </li><li> Sumergir los gránulos en 100% de EtOH durante 5 min a RT. Repetir dos veces. </li><li> Sumergir los gránulos en 100% de xileno durante 15 min a RT. Repita TWIce. </li></ol></li><li> Insertar los sedimentos celulares fijos en parafina a 56 ° C en un molde; las pastillas puede ser embebido en parafina utilizando sistemas de procesamiento automatizado de tejidos especializados. </li><li> Cortar secciones de 5 micras de espesor del sedimento celular en parafina usando un micrótomo rotatorio. </li><li> Flotar las secciones en EtOH al 50% y luego transferirlos a un baño de agua a 50 ° utilizando una diapositiva. </li><li> Coloque las secciones flotantes en portaobjetos. </li></ol></li><li> Safranina O y tinción con azul Alcian <ol><li> Rehidratar las secciones de parafina. <ol><li> Sumergir los portaobjetos en xileno durante 15 minutos. Repetir dos veces. </li><li> Sumergir los portaobjetos en EtOH al 100% durante 5 min. Repetir dos veces. </li><li> Sumergir los portaobjetos en EtOH al 90% durante 5 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos en EtOH al 80% durante 5 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos en EtOH al 70% durante 5 minutos, y luego lavarlos en 1x PBS. </li></ol></li><li> Tinción de las secciones rehidratadas con solución de safranina O 1% y 3% de azul Alcian para30 minutos. </li><li> Desechar la solución de tinción y enjuague las secciones con DW. </li><li> Manchar las secciones con solución de hematoxilina / eosina (contratinción) durante 1 minuto. </li><li> Desechar la solución de tinción y enjuague las secciones con DW. </li><li> Colocar una gota de medio de montaje sobre un cubreobjetos después de la eliminación de cualquier agua residual. Con cuidado, coloque la corredera (célula boca abajo) sobre el portaobjetos que contiene el medio de montaje. </li><li> Deje que los portaobjetos se sequen durante 2-3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Capturar imágenes utilizando un microscopio de campo brillante (microscopio vertical automatizado, 50X y 200X). </li></ol></li><li> ensayo de inmunofluorescencia <ol><li> Rehidratar las secciones tal como se describe en la sección 3.2.1. </li><li> Sumergir los portaobjetos en tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) y, a continuación, mantenerlas a una temperatura sub-hirviendo durante 10 min usando un horno de microondas. </li><li> Enfriar los portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego lavar con agua del grifo. </li><li> Incubar los portaobjetos en un 3%H 2 O 2 (en 1x PBS) durante 15 min, y luego los lavar con agua del grifo durante 15 min 11. </li><li> Bloquear los portaobjetos con tampón de bloqueo (10% de suero de cabra normal en PBS) durante 1 h. </li><li> Aspirar la solución de bloqueo, y luego aplicar un anticuerpo primario diluido con suero de cabra normal al 5% sobre los portaobjetos. </li><li> Incubar los portaobjetos durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Incubar las diapositivas de anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo diluido con suero de cabra normal al 5% durante 1 h a TA en la oscuridad. </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante 5 min cada uno en la oscuridad. </li><li> Incubar los portaobjetos con DAPI (1 mg / ml) durante 10 min, y luego los de lavado dos veces en 1X PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Colocar una gota de medio de montaje sobre un cubreobjetos después de la eliminación de cualquier agua residual. Con cuidado, coloque la corredera (celular lado negativo) en el medio de montaje. </li><li> Deje que los portaobjetos se sequen durante 2-3h en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Visualizar las diapositivas utilizando microscopía de fluorescencia (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X y 200X) 12. </li></ol></li></ol>

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<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
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</ol>

Declaramos que no tenemos conflictos de intereses asociados con este trabajo.

El estado stemness de las células es muy importante para la sobreexpresión inducida por CG de SOX9. En nuestro estudio, la expresión SOX9 podría ser inducida por CG en ASC-paso temprano (2-3), pero no en ASC-tarde de paso. Se ha informado de que, durante el cultivo, ASC contienen CD34 + células hasta 3 pasajes 16. ASCs tienden a perder la expresión de CD34 como se pasan las células, lo que resulta en una baja respuesta a CG. Con la fuerza de gravedad centrífuga, la pr...

Los defectos en el cartílago articular no se curan de forma natural. En consecuencia, trasplante de células madre ha sido propuesta como un enfoque prometedor para la reparación de cartílago deteriorado. Sin embargo, este método requiere tanto la adquisición de un número suficiente de células madre y la inducción de estas células a someterse a la diferenciación condrogénica. La médula ósea (BM) se ha usado ampliamente como una fuente de células madre, pero el aislamiento de células de BM tiene dos desventajas principales: invasión y de rendimiento insuficiente. Debido a su facilidad de adquisición, el tejido adiposo es una fuente preferida de células madre. Estudios previos demostraron la factibilidad de aislamiento de células madre a partir de tejido adiposo y la inducción de la diferenciación condrogénica en estas células por medio de citocinas, tales como TGF-β1 1, 2. Estos métodos son eficaces, pero caro. Como una alternativa de bajo costo para las citoquinas, la tensión mecánica se puede utilizar parainducir la diferenciación condrogénica. Carga mecánica juega un papel crítico en el mantenimiento de la salud del cartílago articular 3, y que puede inducir fenotipos condrogénicas en diversas células. Por ejemplo, la presión hidrostática induce fenotipos condrogénicas en las células progenitoras sinovial derivado a través de la vía de la MAP quinasa / JNK 4, y la compresión mecánica induce condrogénesis en células madre mesenquimales humanas (MSCs) upregulating genes chondrocytic 5. Además, la tensión de cizallamiento contribuye a la expresión de la matriz extracelular relacionados condrogénesis-(ECM), en MSC humanas 6. Gravedad centrífuga (CG), una tensión mecánica fácilmente aplicada y controlada generada por centrifugación, se puede inducir la expresión génica diferencial en las células 7. Por ejemplo, en células de carcinoma de pulmón epiteliales, la expresión de la interleucina 1b (IL) es upregulated por centrifugación 8. Tor lo tanto, como una tensión mecánica experimentalmente inducible, CG se puede utilizar para inducir la expresión de genes en las células madre chondrocytic. Sin embargo, no queda claro si CG puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre. En este estudio, se encontró que CG indujo la regulación al alza de SOX9, un regulador maestro de la condrogénesis, en ASC humanos, dando como resultado la sobreexpresión de los genes chondrocytic. Además, se compararon los efectos de CG en la condrogénesis con las de TGF-β1, el factor de crecimiento más comúnmente utilizado para inducir la condrogénesis in vitro en las células madre.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Artículos de plástico</resistente></td></tr><tr><td>100 mm Plato</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plato</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Cornical SPL</td><td></td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Cornical SPL</td><td></td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta Desechable</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta Desechable</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Culture Media Materials</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Baja glucosa</td><td>Life Technologies</td><td>11885-084 medios base de</td><td>crecimiento</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Medios de diferenciación condrogénicos Materiales</fuerte></td></tr><tr><td>DMEM Alta glucosa</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td> medios base de <td>diferenciación condrogénica</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr><tr><td>Ascorbato-2-fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>SU</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>1%</td></tr><tr><td>TGF humano y beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materiales</fuerte></td></tr><tr><td>18 mm Cubierta de vidrio</td><td>superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovación</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Colágeno II</td><td>anticuerpo abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594 conjugado</td><td>Sonda molecular</td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonda molecular</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold reactivo antidecoloración</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio, recubierto</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Kit de síntesis de ADNc de primera hebra</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq ADN polimerasa</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>estrella de carga</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) marcador de escalera de ADN</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Células madre derivadas del tejido adiposo humano (ASCs)</td><td>Catholic MASTER Cells</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

El cartílago deteriorado no puede sanar de forma natural. En la actualidad, la terapia más avanzada para los defectos del cartílago es el trasplante de condrocitos diferenciados de células madre mediante citoquinas. Desafortunadamente, la diferenciación condrogénica inducida por citocinas es costosa, requiere mucho tiempo y se asocia con un alto riesgo de contaminación durante la diferenciación in vitro. Sin embargo, los estímulos biomecánicos también sirven como factores reguladores cruciales para la condrogénesis. Por ejemplo, el estrés mecánico puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre, lo que sugiere un enfoque terapéutico potencial para la reparación del cartílago dañado. En este estudio, demostramos que la gravedad centrífuga (CG, 2.400 × g), una tensión mecánica fácilmente aplicada por centrifugación, indujo la regulación positiva de la región determinante del sexo Y (SRY)-box 9 (SOX9) en células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs), haciendo que expresen fenotipos condrogénicos. Las ASC centrifugadas expresaron niveles más altos de marcadores de diferenciación condrogénica, como agrecano (ACAN), colágeno tipo 2 alfa 1 (COL2A1) y colágeno tipo 1 (COL1), pero niveles más bajos de colágeno tipo 10 (COL10), un marcador de condrocitos hipertróficos. Además, se observó la formación de agregados condrogénicos, un requisito previo para la condrogénesis, en las ASC centrifugadas.

gravedad centrífuga induce la sobreexpresión de los marcadores de diferenciación condrogénica de las células madre derivadas de tejido adiposo. Para determinar el grado de fuerza de gravedad centrífuga que es adecuado para inducir la diferenciación condrogénica, ASC se estimularon con diferentes grados de CG (0, 300, 600, 1.200, y 2.400 xg) durante 15 min. Después de la estimulación, las ASC fueron re-sembradas en placas de cu...

El estrés mecánico puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre, proporcionando un enfoque terapéutico potencial para la reparación del cartílago dañado. Presentamos un protocolo para inducir la diferenciación condrogénica de células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs) utilizando la gravedad centrífuga (CG). La regulación positiva de SOX9 inducida por CG da como resultado el desarrollo de fenotipos condrogénicos.

La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir la diferenciación condrogénica de los ASC para la reparación defectuosa del cartílago. Este método consiste en inducir la diferenciación precondrogénica de los ASC utilizando la fuerza de gravedad centrífuga. Aunque este método puede proporcionar información sobre la diferenciación condrogénica de las ASC, también se puede aplicar a otros sistemas, como la diferenciación osteogénica y fibrogénica.La principal ventaja de esta técnica es que la diferenciación condrogénica se puede inducir fácilmente a partir de células madre sin tratar ninguna citocina. Demostrando el procedimiento estarán Yeri Alice Rim y Yoojun Nam de mi laboratorio. Comience cosechando un 80% de células madre derivadas del tejido adiposo confluente de una placa de cultivo de 100 mililitros desechando el medio y lavando con cinco mililitros de PBS.A continuación, añada un mililitro de PBS que contenga un milimolar de EDTA e incube durante dos minutos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono. Después de dos minutos, golpee suavemente la placa de cultivo, luego agregue cuatro mililitros de medio fresco y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 250 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante sin alterar el pellet. Luego, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio. Cuente las células con un hemocitómetro.Para la carga centrífuga por gravedad, transfiera 2,5 veces diez a las quintas celdas a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 2400 veces g durante 15 minutos. Después de la centrifugación, proceda al cultivo de pellets o micromasa. Inmediatamente después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y a 500 microlitros de medio de diferenciación condrogénico, o CDM, y 50 microgramos por mililitro de ácido L-ascórbico 2-fosfato recién preparado en el pellet.Un control positivo, induce la diferenciación condrogénica y recoge sus células mediante la adición de CDM que contiene 10 nanogramos por mililitro de TGF-beta-1. Tape los tubos sin apretar e incube a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono durante tres semanas. Inmediatamente después de la centrifugación por gravedad, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 microlitros de CDM.Para formar una micromasa, pipetee las células resuspendidas en el centro de un pocillo de una placa de 24 pocillos y luego coloque la placa en la incubadora. Después de dos horas, agregue con cuidado 500 microlitros de CDM al pocillo, pipeteando contra la pared de la placa para evitar alterar la micromasa. Como control positivo, realizar un cultivo de micromasa con células no centrifugadas añadiendo CDM que contenga 10 nanogramos por mililitro de TGF-beta-1.Incubar la micromasa durante tres semanas. El día 21 después de la formación de la micromasa, use una pipeta para cosechar los gránulos de esferoides y luego lave con 1X PBS. Fije los gránulos de esferoide por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 24 horas.Al día siguiente, deseche el fijador y enjuague los gránulos celulares con agua desionizada. Coloque una capa de gasa en el casete de pañuelo y transfiera los gránulos de esferoides fijos con una pipeta. Cubra el pellet doblando la gasa y cierre la tapa del casete.A continuación, deshidrate los gránulos de esferoide por inmersión en etanol al 70% durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, continúe a través de una serie de concentraciones de etanol durante cinco minutos cada una. A continuación, sumerja los pellets en xileno al 100% durante 15 minutos.Sumerja los gránulos de esferoides en parafina a 56 grados centígrados para su inclusión. A continuación, corte secciones de cinco micras de grosor del pellet de celda incrustado en parafina con un micrótomo rotativo. Flote las secciones en etanol al 50% y luego transfiéralas a un baño de agua a 50 grados centígrados.Monte las secciones flotantes en portaobjetos y luego proceda a la safranina o y al azul alcián para la tinción inmunofluorescente. Para determinar una fuerza de gravedad centrífuga adecuada, los ASC se hicieron girar a una gravedad centrífuga de cero, 300, 600, 1, 200 y 2, 400 veces g durante quince minutos. Se evaluó la expresión de ARNm de SOX9 a las 24 horas después de la estimulación con CG.Un CG de 2.400 veces g indujo significativamente la expresión de ARNm de SOX9. Para evaluar la expresión de genes relacionados con la condrogénesis, se extrajo ARN total de ASC no estimuladas, ASC que habían sido centrifugadas o tratadas con TGF-beta-ona. Como se ve aquí, la estimulación de CG induce la expresión de colágeno tipo 2 y agrecano.La sobreexpresión de colágeno tipo-2 en ASC tratados con CG se confirmó mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra colágeno tipo-2 en un anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 594. Para determinar el efecto de CG en la sobreexpresión de ECM relacionada con la condrogénesis, las ASC se trataron con TGF-beta-ona como control positivo. El testigo negativo fue un cultivo de pellets no sometido a carga de CG, ni tratamiento con TGF-beta-ona.Se evaluó la sobreexpresión de MEC relacionada con la condrogénesis en gránulos de esferoides consistentes en ASC centrifugados mediante el uso de safranina o y tinción con azul alcián. El glicosaminoglicano, un componente principal del cartílago articular, se tiñó de azul con azul alcián, o se tiñó de naranja con safranina O. Después de 14 días de cultivo en micromasa, se evaluó la condensación de condrocitos por el tamaño de los agregados.El tamaño de cada agregado, generado por CG, fue de alrededor de 0,5 milímetros. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la diferenciación condóngica de las células madre utilizando la fuerza de gravedad centrífuga.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Aprende a inducir la diferenciación condrogénica de células madre derivadas de tejido adiposo mediante fuerza de gravedad centrífuga. Este método sin citocinas promueve la expresión de SOX9 para reparación de cartílago.

La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

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