La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

El objetivo general de este procedimiento es inducir la diferenciación condrogénica de los ASC para la reparación defectuosa del cartílago. Este método consiste en inducir la diferenciación precondrogénica de los ASC utilizando la fuerza de gravedad centrífuga. Aunque este método puede proporcionar información sobre la diferenciación condrogénica de las ASC, también se puede aplicar a otros sistemas, como la diferenciación osteogénica y fibrogénica.

La principal ventaja de esta técnica es que la diferenciación condrogénica se puede inducir fácilmente a partir de células madre sin tratar ninguna citocina. Demostrando el procedimiento estarán Yeri Alice Rim y Yoojun Nam de mi laboratorio. Comience cosechando un 80% de células madre derivadas del tejido adiposo confluente de una placa de cultivo de 100 mililitros desechando el medio y lavando con cinco mililitros de PBS.

A continuación, añada un mililitro de PBS que contenga un milimolar de EDTA e incube durante dos minutos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono. Después de dos minutos, golpee suavemente la placa de cultivo, luego agregue cuatro mililitros de medio fresco y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 250 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante sin alterar el pellet. Luego, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio. Cuente las células con un hemocitómetro.

Para la carga centrífuga por gravedad, transfiera 2,5 veces diez a las quintas celdas a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 2400 veces g durante 15 minutos. Después de la centrifugación, proceda al cultivo de pellets o micromasa. Inmediatamente después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y a 500 microlitros de medio de diferenciación condrogénico, o CDM, y 50 microgramos por mililitro de ácido L-ascórbico 2-fosfato recién preparado en el pellet.

Un control positivo, induce la diferenciación condrogénica y recoge sus células mediante la adición de CDM que contiene 10 nanogramos por mililitro de TGF-beta-1. Tape los tubos sin apretar e incube a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono durante tres semanas. Inmediatamente después de la centrifugación por gravedad, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 microlitros de CDM.

Para formar una micromasa, pipetee las células resuspendidas en el centro de un pocillo de una placa de 24 pocillos y luego coloque la placa en la incubadora. Después de dos horas, agregue con cuidado 500 microlitros de CDM al pocillo, pipeteando contra la pared de la placa para evitar alterar la micromasa. Como control positivo, realizar un cultivo de micromasa con células no centrifugadas añadiendo CDM que contenga 10 nanogramos por mililitro de TGF-beta-1.

Incubar la micromasa durante tres semanas. El día 21 después de la formación de la micromasa, use una pipeta para cosechar los gránulos de esferoides y luego lave con 1X PBS. Fije los gránulos de esferoide por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 24 horas.

Al día siguiente, deseche el fijador y enjuague los gránulos celulares con agua desionizada. Coloque una capa de gasa en el casete de pañuelo y transfiera los gránulos de esferoides fijos con una pipeta. Cubra el pellet doblando la gasa y cierre la tapa del casete.

A continuación, deshidrate los gránulos de esferoide por inmersión en etanol al 70% durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, continúe a través de una serie de concentraciones de etanol durante cinco minutos cada una. A continuación, sumerja los pellets en xileno al 100% durante 15 minutos.

Sumerja los gránulos de esferoides en parafina a 56 grados centígrados para su inclusión. A continuación, corte secciones de cinco micras de grosor del pellet de celda incrustado en parafina con un micrótomo rotativo. Flote las secciones en etanol al 50% y luego transfiéralas a un baño de agua a 50 grados centígrados.

Monte las secciones flotantes en portaobjetos y luego proceda a la safranina o y al azul alcián para la tinción inmunofluorescente. Para determinar una fuerza de gravedad centrífuga adecuada, los ASC se hicieron girar a una gravedad centrífuga de cero, 300, 600, 1, 200 y 2, 400 veces g durante quince minutos. Se evaluó la expresión de ARNm de SOX9 a las 24 horas después de la estimulación con CG.

Un CG de 2.400 veces g indujo significativamente la expresión de ARNm de SOX9. Para evaluar la expresión de genes relacionados con la condrogénesis, se extrajo ARN total de ASC no estimuladas, ASC que habían sido centrifugadas o tratadas con TGF-beta-ona. Como se ve aquí, la estimulación de CG induce la expresión de colágeno tipo 2 y agrecano.

La sobreexpresión de colágeno tipo-2 en ASC tratados con CG se confirmó mediante inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra colágeno tipo-2 en un anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 594. Para determinar el efecto de CG en la sobreexpresión de ECM relacionada con la condrogénesis, las ASC se trataron con TGF-beta-ona como control positivo. El testigo negativo fue un cultivo de pellets no sometido a carga de CG, ni tratamiento con TGF-beta-ona.

Se evaluó la sobreexpresión de MEC relacionada con la condrogénesis en gránulos de esferoides consistentes en ASC centrifugados mediante el uso de safranina o y tinción con azul alcián. El glicosaminoglicano, un componente principal del cartílago articular, se tiñó de azul con azul alcián, o se tiñó de naranja con safranina O. Después de 14 días de cultivo en micromasa, se evaluó la condensación de condrocitos por el tamaño de los agregados.

El tamaño de cada agregado, generado por CG, fue de alrededor de 0,5 milímetros. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la diferenciación condóngica de las células madre utilizando la fuerza de gravedad centrífuga.