Name: Análisis metagenomic de ensilaje (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a analizar comunidades bacterianas en ensilaje mediante secuenciación metagenómica shotgun. Este protocolo computacional permite identificar microorganismos potencialmente dañinos y evaluar la calidad del alimento para ganado.

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Los autores desean agradecer a Andrew Bird por las muestras de ensilado y a Audrey Farbos del Servicio de Secuenciación de Exeter por su ayuda en la preparación de las bibliotecas de secuenciación de ADN. Servicio de secuenciación de Exeter e instalaciones centrales computacionales de la Universidad de Exeter. Premio de Infraestructura Clínica del Consejo de Investigación Médica (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) y BBSRC LOLA Award (BB/K003240/1).

1. Localización del Sitio <ol><li> Recoger la muestra de ensilaje de un sitio apropiado, tal como una granja. Aquí, la finca se encuentra en Ballydulea, Co. Cork, Irlanda (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. Extracción de ADN NOTA: la extracción de ADN se realizó utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Un control negativo, que no contenía la muestra, se utiliza en todo el método de preparación de la biblioteca. <ol><li> Añadir 100 a 400 mg de la muestra a un tampón de fosfato de sodio 978 l de tampón de lisis y suelo 122 l en los tubos de lisis suministrados. </li><li> Homogeneizar las muestras mediante la colocación de los tubos de lisis en el homogeneizador durante 40 s a una velocidad de 6.0 m / s. </li><li> lisados ​​centrifugar a 14.000 xg durante 15 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio que contenía 250 l de proteína precipitado de la solución (PPS). Mezclar la solución invirtiendo 10 veces y centrifugara 14.000 xg durante 5 min. </li><li> Añadir el sobrenadante a 1 ml de matriz de unión a ADN en un tubo de centrífuga limpio de 15 ml. Mezclar la solución invirtiendo el tubo constantemente por 3 min. Dejar que la mezcla se asiente durante 3 minutos, luego descarta 500 l de sobrenadante. Mezclar el sobrenadante restante. </li><li> Transferir 600 l de la suspensión a un filtro de giro y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min. Desechar el filtrado y se repite el proceso con el resto de la suspensión. </li><li> Añadir 500 l de tampón de lavado a la matriz de unión al ADN dentro del filtro giratorio, mezclar con la pipeta y centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. </li><li> Desechar el filtrado y centrifugar el filtro de centrifugado de nuevo a 14.000 xg durante 2 min para asegurar se haya eliminado todo el tampón de lavado. Secar el filtro giratorio a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Pre-caliente (70 ° C) el agua libre de DNasa (DES) y volver a suspender la matriz de unión de ADN en 100 L de DES en el filtro giratorio. Transferir el filtro giratorio a una limpia 1,5 ml de microcentrífuga maser y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min para eluir el ADN. Almacenar el ADN purificado a -20 ° C hasta que se realice un análisis posterior. </li></ol> 3. Perlas de purificación utilizando ADN Purificación de ADN Se obtuvo Antes de la preparación biblioteca metagenómica se purificó el ADN extraído usando perlas de purificación para asegurar una muestra de ADN puro: NOTA. <ol><li> Se incuban las perlas a 23ºC durante 30 min antes de su uso. Añadir 2 volúmenes de perlas para la muestra de ADN e incubar la solución a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Colocar las muestras en un imán de separación para 5 min y luego descartar el sobrenadante. Lavar las perlas dos veces con 200 l de etanol fresco 80% (EtOH). Deje secar al aire las perlas durante 10 minutos. </li><li> Eliminar las muestras del imán separación y añadir 50 l de tampón de elución (EB), mezclar mediante pipeteo. </li><li> Incubar la suspensión a 23 ° C durante 5 min, después de lo cual Colocar las muestras de nuevo en el imán de separación para 3 min. </li><li> Transfer el sobrenadante, que contiene el ADN, a un tubo limpio. Desechar las cuentas. </li><li> Cuantificar el ADN purificado de acuerdo con el apartado cuarto. </li></ol> 4. Cuantificación de ADN purificado NOTA: El ADN purificado se cuantificó usando un fluorómetro y kit de ensayo de doble cadena (dsDNA) de alta sensibilidad (HS) siguiendo las instrucciones del fabricante. <ol><li> Preparar una solución de trabajo utilizando 199: 1 relación de tampón y el agente reactivo. </li><li> Añadir 10 l de cada estándar de ADN de 190 l de solución de trabajo. </li><li> Añadir 10 l de ADN purificado a 190 l de solución de trabajo. El volumen final debe ser de 200 l. Incubar las muestras estándar y de ADN a 23 ° C durante 2 min. </li><li> Analizar las normas antes de las muestras de ADN en el fluorómetro utilizando las instrucciones que aparecen en pantalla. </li></ol> 5. La secuenciación escopeta Biblioteca Preparación NOTA: La biblioteca de escopeta secuenciación se preparó usando unkit de preparación de la biblioteca comercial usando las instrucciones del fabricante. <ol><li> Diluir las muestras de ADN a 0,2 ng / l utilizando EB. Cualquier muestra que ya está por debajo de esta concentración, es decir, el control negativo, se deja a su concentración actual. </li><li> Mezclar 5 l de ADN purificado con 10 l de tampón y 5 l mezcla de enzima. Incubar las muestras a 55ºC durante 5 min. </li><li> Añadir 5 l de tampón de neutralización y se incuba la solución a 23 ° C durante 5 min. </li><li> Añadir 5 l de cada uno de los índices de secuenciación específicos de muestra y 15 l de la mezcla de PCR master. </li><li> En un termociclador, se incuban las muestras a 72 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 30 s, antes de los 12 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55ºC durante 30 s y 72 ° C durante 30 s. Incubar las muestras finalmente a 72 ° C durante 5 min. </li><li> Se purifica el ADN preparado mediante la purificación de talón como antes, pero con una elución final de 30 l de EB. </li></ol> 6. LCantidad ibrary y comprobación de la calidad NOTA: La cantidad y calidad de las bibliotecas preparadas se evaluaron utilizando un kit comercial y la instrumentación. <ol><li> Incubar los componentes del kit a 23 ° C durante 30 min antes de su uso. </li><li> Añadir 2 l de ADN a 2 l de tampón y de vórtice durante 1 min a 2000 rpm. </li><li> Centrifugar la muestra para asegurarse de que está en el fondo del tubo. </li><li> Inserte los tubos de muestra, cinta de análisis y consejos en el instrumento, y llevar a cabo análisis de la manera indicada por el software. </li></ol> La secuenciación de ADN 7. <ol><li> La transferencia de las bibliotecas de secuenciación de ADN preparados y cuantificadas las muestras a un servicio de secuenciación y la secuencia de 300 pb utilizando la secuencia final emparejado 45. </li></ol> 8. Análisis de los datos brutos de Secuencia NOTA: Los comandos para cada programa que usa un sistema operativo Linux se muestran a continuación de la etapa de protocolo. La tubería utilizada para sanálisis de los datos equence se muestra en la Figura 1. Los programas son para ser instalado por el usuario antes del análisis. Este proceso se debe realizar de forma individual para cada muestra. <ol><li> Analizar y visualizar los datos de la secuencia de ADN utilizando FastQC 46 escribiendo en la línea de comandos / ruta-a-archivo / fastqc, seguido por el avance y retroceso en bruto lee raw_read2.fastq raw_read1.fastq. </li><li> Especificar una carpeta de salida escribiendo output_fastqc -o y el formato de archivo de los archivos de lectura primas por FASTQ -f. </li><li> Ver el archivo de salida (Figura 2). ruta-a-archivo / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o -f output_directory FASTQ. </li></ol> 9. Control de Calidad del recorte y filtrado Datos de Secuencia <ol><li> Ejecutar el programa de recorte, Trimmomatic 28 escribiendo en la línea de comandos java-jar / ruta-a-archivo / trimmomatic-0.35.jar. </li><li> Especificar los archivos están emparejados archivos finales escribiendo &#39;PE&#39;. Estado que el 16 pr centroocessing unidades (CPU) deben ser utilizados por el programa escribiendo -threads 16. </li><li> Enumerar los dos archivos a verificación de control de calidad, escribiendo los nombres de la prima hacia adelante y marcha atrás lee. El prefijo de los archivos de salida se determina escribiendo ensilado -baseout. </li><li> Definir las opciones para el programa escribiendo ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 principales: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 CULTIVO: 200 HEADCROP: 15 minlen: 36. </li><li> Una vez completa, analizar las secuencias recortadas utilizando FastQC como antes y comparar la salida de la secuencia de datos en bruto para asegurar el recorte se ha realizado con éxito. NOTA: La herramienta de software, Trimmomatic, recortado lee más mediante la eliminación conduce baja calidad o N bases (por debajo de la calidad 3), la eliminación de arrastre de baja calidad o N bases (por debajo de la calidad 3) y analizando cada lectura con un 4-base amplia ventana deslizante. Los parámetros se establecieron para el corte cuando la calidad promedio por la base cae por debajo de 20 y luego a soltar cualquier lecturas por debajo de 36 bases de largo. Por último, 15 bases fueron cosechadas from la cabeza de cada uno lee y dice estaban recortada para mantener 200 bases desde el inicio de la lectura. Este último paso se llevó a cabo para superar algunos problemas de calidad durante la secuenciación de largo (&gt; 200 pb) lee. Estos se pueden ajustar para las muestras específicas 28. java-jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq ensilado -baseout ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 principales: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 CULTIVO: 200 HEADCROP: 15 minlen: 36 </li></ol> 10. Asamblea Metagenoma <ol><li> Combinar la desapareado, recortado lee escribiendo gato seguido por el desapareado lee; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Escribir los archivos a un nuevo archivo escribiendo&gt; silage_merged_unpaired.fastq gato silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Para novo ensamblar el ADN secuenciado, utilice Picas (San Petersburgo genoma ensamblador) 30 escribiendo / ruta-a-file / spades.py. Especificar que 16 CPU se van a utilizar escribiendo -t 16 y que el parámetro metagenomic debe aplicarse escribiendo --meta. </li><li> Identificar los recortado hacia adelante lee usando -1 silage_read1_paired.fastq y el reverso se lee por -2 silage_read2_paired.fastq. El desapareado fusionada lee son especificados por silage_merged_unpaired.fastq -s. </li><li> Definir la carpeta de salida escribiendo -o silage_spades. ruta-a-archivo / spades.py -t 16 --meta -1 -2 silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11.-extremo emparejado Lee Superposición <ol><li> Mezcla pares de secuencia de ADN lee el uso de flash (Rápido Ajuste de la longitud de la Corto lecturas) 29 escribiendo en la línea de comandos / ruta-a-archivo / flash. Especifican que 16 CPU deben ser utilizados mediante el uso -t 16 y el prefijo de salida escribiendo -o ensilado. </li><li> Identificar recortado lee escribiendo silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq ruta-a-archivo / flash-T16 -o FLASHED silage_read2_paired.fastq silage_read1_paired.fastq </li></ol> La clasificación taxonómica 12. <ol><li> Tipo / ruta-a-archivo / kraken y especifique la base de datos escribiendo --db / ruta-a-archivo / estándar. </li><li> Definir que 16 CPU se deben utilizar escribiendo --threads 16 e identificar una carpeta de salida mediante el uso de --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Escriba el nombre del archivo de entrada; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq ruta-a-archivo / norma --db kraken --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOTA: La clasificación de los andamios montados de secuencias de ADN utilizando Kraken 7 se completó en contra de la base de datos más reciente, Kraken estándar que contenía todas las secuencias del genoma procariotas disponibles. </li><li> columnas de transferencia 2 y 3 del archivo de salida y a un nuevo archivo escribiendo corte -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Abrir el archivo de salida en el navegador web. cortar -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importe el archivo nuevo en Corona 12 escribiendo ktImportTaxonomy. Especificar el archivo de entrada escribiendo FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Identificar el archivo de salida escribiendo -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html. ruta-a-archivo / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. anotación funcional <ol><li> Ir a la página web 47 MG-RAST, http://metagenomics.anl.gov/. Registrarse como nuevo usuario, si es necesario. Después de iniciar sesión, haz clic en el botón &quot;Subir&quot;. Sube los andamios montados desde el paso 10. </li><li> Una vez que los archivos se han cargado, haga clic en &quot;Enviar&quot; y siga las instrucciones y esperar a la finalización del análisis. </li><li> Después de terminado el análisis, ver el enlace enviado a través de EMail de MG-RAST, o, alternativamente, haga clic en &quot;Progreso&quot;. Hay una lista de los trabajos terminados. Haga clic en el identificador de trabajo pertinente y luego en el enlace a la &quot;página de descarga&quot;. </li><li> En la página de descarga, bajo el título &quot;La agrupación de proteínas del 90%&quot;, haga clic en el botón de proteínas para descargar el archivo de proteína predicha, 550.cluster.aa90.faa. </li><li> Para clasificar las proteínas que supuestamente pertenecen a una clase particular de enzimas CAZy, comparar las proteínas cargadas en la base de datos CAZy 48. Descargar la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy) a partir de archivos son: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip y PL.zip. Estos archivos representan las siguientes clases de enzimas, respectivamente: Actividades auxiliares (AA), esterasas de hidratos de carbono (CE), glucósido hidrolasas (GH), glicosil transferasas (GT) y el polisacárido liasas (PL). </li><li> Descomprimir los archivos de base de datos y anotar las proteínas mediante la determinación de la similitud de proteínas de las proteínas de bases de datos utilizando el Cazy Algor USEARCH UBLASTITHM 49. Para utilizar un bucle de bash (for i in * .txt) para iterar a través de la base de datos de tipo 5 archivos .txt &quot;for i in * .txt; hacer&quot;. </li><li> Ejecutar USEARCH escribiendo / ruta-a-archivo / usearch8 con el -ublast parámetro con el fin de utilizar el algoritmo ublast. A continuación, escriba el nombre del archivo de secuencias de proteínas descargado de MG-RAST, &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Para indicar el archivo de base de datos que se utilizará el tipo &quot;-db $ i&quot; y para especificar el E-valor umbral en 1e -5, tipo &quot;-evalue 1e-5&quot;. </li><li> Para terminar la búsqueda tras el descubrimiento de una secuencia diana y por lo tanto la clasificación de que la secuencia de proteínas como pertenecientes a la clase de la enzima diana, por ejemplo GH, tipo &quot;-masaccepts 1&quot;. </li><li> Para definir que 16 CPU deben utilizarse tipo &quot;-threads 16&quot; y para especificar el formato del archivo de salida como tipo &quot;-blast6out&quot; ATAB separados texto. Para identificar el tipo de archivo de salida &quot;$ i.ublast&quot;. Para terminar el bucle de bash, tipo &quot;; hecho&quot; for i in * .txt; hacer / ruta-a-archivo / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; hecho </li></ol> 14. Visualización CAZy Anotación <ol><li> Para visualizar la salida de la anotación CAZy como un diagrama de Venn, generar listas de ID de la proteína para cada clase de la enzima usando un bucle de bash. Tipo &quot;for i in * .ublast; hacer&quot;. </li><li> Para transferir la columna 1 del archivo de salida y en un nuevo archivo, tipo &quot;cat $ i | cortó -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Terminar el bucle y el tipo &quot;; hecho&quot;. </li><li> Abrir los archivos .list en un editor de texto. Ir a la página web, seleccione el número de series como 5 y pegar el contenido de cada archivo de lista en una caja separada. Descargar el diagrama resultante como un archivo .SVG. for i in * .ublast; hacer cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list; hecho </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que un análisis in silico puede dar una excelente visión de las comunidades microbianas que están presentes en muestras ambientales, es fundamental que las clasificaciones taxonómicas demostraron ser realizado en asociación con los controles pertinentes y que una profundidad adecuada de la secuenciación se ha logrado captar la totalidad población actual 51. Con cualquier análisis computacional, hay muchas rutas para lograr un objetivo similar. Los métodos que hemos utilizado en este estudio son ejemplos de métodos adecuados y sencillos, que han sido reunidas para lograr una serie de análisis sobre el microbioma ensilado. Una variedad y un número cada vez mayor de herramientas y técnicas de bioinformática están disponibles para analizar los datos de metagenómica, por ejemplo Phylosift 8 y 52 MetaPhlAn2, y estos deben ser evaluados antes de la investigación por su importancia para la muestra y el análisis reqpedirá otra 53. métodos de análisis Metagenomic están limitados por las bases de datos disponibles para la clasificación, la profundidad de la secuenciación y la calidad de secuenciación. El tratamiento bioinformático ha demostrado aquí se llevó a cabo en una máquina motorizada locales, alta; Sin embargo los sistemas basados ​​en la nube también están disponibles. Estos servicios basados ​​en la nube permiten el alquiler de la potencia de cálculo necesaria sin tener la inversión de alto costo de una potente estación de trabajo local adecuado. Una posible aplicación de este método sería evaluar el ensilaje antes de su uso en la agricultura para asegurar que no hay bacterias potencialmente dañinas están presentes, por lo tanto evitando que entren en la cadena alimentaria.

La metagenómica es el análisis directo del ADN purificado a partir de las comunidades biológicas que se encuentran dentro de las muestras ambientales 1 y se utilizó originalmente para detectar bacterias no cultivables que se encuentran en los sedimentos 2. Metagenomics ha sido ampliamente utilizado para un número de aplicaciones, tales como la identificación de la microbioma humano 3, la clasificación de las poblaciones microbianas en el océano 4 e incluso para el análisis de las comunidades de bacterias que se desarrollan en las máquinas de café 5. La introducción de las tecnologías de secuenciación de próxima generación dio lugar a un mayor rendimiento de secuenciación y de salida. En consecuencia, la secuenciación del ADN se ha convertido en más económico 6 y la profundidad de secuenciación que puede ser realizado ha aumentado considerablemente, lo que permite la metagenómica para convertirse en una herramienta poderosa, analítica. Mejoras &quot;front-end&quot; en el aspecto práctico, molecular de secuenciación metagenómica han impulsado el crecimiento de la inherramientas bioinformáticas silico disponibles para la clasificación taxonómica 7-9, anotación funcional 10,11 y 12,13 representación visual de los datos de secuencia de ADN. El número cada vez mayor de disposición, secuenciado procariotas y eucariotas 14 genomas permite mayor precisión en la clasificación de las comunidades microbianas, que se realizan siempre en contra de una base de datos de referencia &quot;back-end&quot; de 15 genomas secuenciados. Dos enfoques principales pueden ser adoptados para el análisis de metagenómica. El método más convencional es el análisis del gen 16S rRNA región del genoma bacteriano que codifica. El 16S rRNA está altamente conservada entre las especies procariotas pero exhibe nueve regiones hiper-variable (V1 - V9) que puede ser explotada para la identificación de especies 16. La introducción de la secuencia más larga (≤ 300 pb extremo emparejado) permitido para el análisis de secuencias de ADN que abarcan dos regiones hipervariables, en particularV3 - V4 región 17. Los avances en las tecnologías de secuenciación de otros, tales como Oxford nanoporos 18 y 19 PacBio, permiten que todo el gen 16S rRNA para secuenciar de forma contigua. Aunque las bibliotecas basadas 16S rDNA proporcionan un enfoque dirigido a la identificación de especies y permiten la detección de ADN bajo número de copias que se produce de forma natural en muestras purificadas, las bibliotecas de secuenciación shotgun permiten la detección de especies que pueden contener regiones de ADN que, o bien no son amplificable por 16S secuencias de cebador rRNA marcador usado, o porque las diferencias entre la secuencia de la plantilla y la secuencia del cebador de amplificación son demasiado grandes 20,21. Además, aunque las ADN polimerasas tienen una alta fidelidad de la replicación de ADN, los errores de base pueden, no obstante, producirse durante la amplificación por PCR y estos errores incorporados pueden dar lugar a la clasificación incorrecta de las especies 22 de origen. Sesgos en la amplificación por PCR de la SEC plantillaTambién se pueden producir influencias; secuencias de ADN con un alto contenido de GC pueden estar bajo representado en la piscina amplicón final de 23 y de manera similar modificaciones de base no naturales, tales como glicol timina, puede detener ADN polimerasas causando fallos en la amplificación de secuencias de ADN 24. En contraste, una biblioteca de ADN secuenciación escopeta es una biblioteca de ADN que se ha preparado mediante el uso de todo el ADN purificado que ha sido extraído de una muestra y, posteriormente, fragmentado en longitudes de cadena de ADN más corto antes de la preparación para la secuenciación. Clasificación taxonómica de las secuencias de ADN generadas por secuenciación shotgun es más preciso en comparación con la secuenciación de ARNr 16S amplicón 25, aunque el coste financiero necesario para alcanzar una profundidad de secuenciación fiable es mayor que la de la secuencia de amplificación 26. El principal beneficio de la metagenómica secuenciación escopeta es que las regiones secuenciadas de los diferentes genomas en la muestra están disponibles para la prospección de genes una vez que han sidoha sido clasificada taxonómicamente 27. datos de la secuencia metagenómica es analizada por una cada vez mayor gama de herramientas bioinformáticas. Estas herramientas son capaces de realizar una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, análisis de control de calidad de los datos de secuencia en bruto 28, la superposición del extremo emparejado lee 29, de novo montaje de secuencia lee a contigs y andamios 30,31, clasificación taxonómica y la visualización de la secuencia lee y secuencias de 7,12,32,33 y la anotación funcional de las secuencias ensambladas 34,35 montado. El ensilaje, producida por los agricultores de todo el mundo a base de cereales fermentados, como el maíz (Zea mays), se utiliza principalmente como alimento para ganado. El ensilaje se trata con la bacteria Lactobacillus sp. para ayudar a la fermentación 36, pero hasta la fecha, existe un conocimiento limitado de las otras poblaciones de microbios que se encuentran en el ensilaje. el fermentation proceso puede conducir a los microorganismos indeseables y potencialmente dañinos va imponiendo en el ensilaje de 37. Además de levaduras y mohos, las bacterias son particularmente adaptable al entorno anaeróbica en la fermentación de ensilaje y están asociados más frecuentemente con enfermedades en el ganado en lugar de la degradación de la ensilaje 38. Pueden ser añadidos inadvertidamente del suelo bacterias ácido butírico se mantiene durante el llenado de los silos de ensilado y son capaces de convertir el ácido láctico, un producto de la digestión anaerobia, a ácido butírico, lo que aumenta el pH del ensilaje 39. Este aumento en el pH puede conducir a un aumento de las bacterias de descomposición que normalmente sería incapaz de sostener el crecimiento en condiciones de fermentación óptima de ensilado 38. Clostridium spp. , Listeria spp. y Bacillus spp. son de particular preocupación, especialmente en el ensilaje para la alimentación de ganado lechero, como esporas bacterianas que han sobrevivido a la gastrtracto ointestinal 40 puede entrar en la cadena alimentaria, conducir a la descomposición de los alimentos y, en casos raros, a los animales y muertes humanas 37,39,41-44. Por otra parte, si bien es difícil estimar el impacto económico exacto de tratamiento veterinario y la pérdida de ganado causada por el deterioro del ensilaje, es probable que sea perjudicial para una granja si un brote se iba a producir. La hipótesis es que mediante el uso de un enfoque metagenomic podemos clasificar las poblaciones microbianas que están presentes en muestras de ensilaje y además identificar las comunidades microbianas asociadas con el deterioro del ensilaje que, a su vez, lo que podría tener un efecto perjudicial sobre el ganado, lo que permite medidas correctoras necesarias tomado antes de que el ensilado es para ser utilizado como una fuente de alimento.

<table><tbody><tr><td>Kit FastDNA SPIN para Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>Extracción de ADN</td></tr><tr><td>FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>Extracción de ADN</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Tampón</td></tr> de elución de purificación de <tr><td></td> ADN <td>Qiagen</td><td>19806</td><td>Purificación de ADN</td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Cuantificación</td></tr> de <tr><td>qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de preparación de bibliotecas</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 Preparación de</td><td>bibliotecas</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>HS D100 Reactivos ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>Consejos TapeStation</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>CintaStation Tubos</td><td>Agilent</td><td>401428 y 401425</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>- proporcionado por un servicio de secuenciación</td></tr><tr><td>Estación de trabajo de análisis de alta potencia</td><td>Varios</td><td></td><td>Sistema local o basado en la nube, preferido por el usuario</td></tr></tbody></table>

análisis metagenomic de ensilaje

Metagenomic Analysis of Silage

La metagenómica se define como el análisis directo del ácido desoxirribonucleico (ADN) purificado a partir de muestras ambientales y permite la identificación taxonómica de las comunidades microbianas presentes en ellas. Existen dos enfoques metagenómicos principales; la secuenciación de la región codificante del gen ARNr 16S, que presenta suficiente variación entre los taxones para su identificación, y la secuenciación shotgun, en la que se analizan los genomas de los organismos que están presentes en la muestra y se atribuyen a "unidades taxonómicas operativas"; especies, géneros o familias en función del grado de cobertura de secuenciación. 
En este estudio, se utilizó la secuenciación de escopeta para analizar la comunidad microbiana presente en el ensilado de ganado y, junto con una gama de herramientas bioinformáticas para verificar la calidad y filtrar las lecturas de secuencias de ADN, realizar la clasificación taxonómica de las poblaciones microbianas presentes dentro del ensilado muestreado y lograr la anotación funcional de las secuencias. Estos métodos se emplearon para identificar bacterias potencialmente dañinas que existían dentro del ensilado, una indicación del deterioro del ensilaje. Si el ensilado en mal estado no se remedia, al ingerirlo podría ser potencialmente fatal para el ganado.

Antes del procesamiento bioinformático, la secuencia de bajo nivel Lee se recorta y los adaptadores se eliminan con el software Trimmomatic 28. Después de la etapa de recorte y de filtrar, el número de lecturas se redujo a 50% de la secuencia lee (Tabla 1). La puntuación media Phred base era&gt; 30 después del control de calidad (Figura 2). Pares de secuencias de ADN que tenían zonas de solapamiento se fusionaron usando el software Flash 29 para generar sola ya lee, no se solapan lee se mantuvieron en un archivo separado. 45.47% lee (105343) combinado con éxito. Tras la superposición de lee el uso de flash de lecturas, los fragmentos ampliados resultantes se sometieron a clasificación taxonómica bacteriana usando el software Kraken 7 y posteriormente se visualizaron con el software de Corona (Figura 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-page='"1"&gt;' la mayor de las especies bacterianas presentes en el metagenoma ensilaje se encuentran dentro phyla procariota: firmicutes actinobacteria proteobacteria y bacteroidetes . distribuci clases estos filos puede ver>Figura 4. Las especies más abundantes en el metagenoma eran Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) y Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). También se observaron especies importantes para la salud animal y implicados en la enfermedad; Clostridium spp. (1%) Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) se prevé que ser presente en la muestra de ensilaje. Funcional anotación se realizó en montado lee. Metagenoma fue ensamblado usando el ensamblador Picas 30 mediante el recortado y filtradaemparejado-end y no apareado lee la generación de 92,284 andamios. Con el fin de identificar las celulasas, las proteínas se predijo a partir de MG-RAST y anotaron utilizando la base de datos de enzimas activas en carbohidratos (CAZy). De los 97,562 proteínas predichas, 6357 fueron anotados como una enzima de hidratos de carbono activo putativo en una de las cinco clases de enzimas que conforman la base de datos CAZy (Figura 5). Los resultados se visualizan como un diagrama de Venn usando software InteractiVenn 50 que muestra la distribución de las anotaciones de proteínas, incluyendo los que contienen más de una clase de enzimas anotación CAZy. De estos, 3861 se predice que tienen actividad hidrolasa de glucósido y se va a caracterizar aún más en el laboratorio para confirmar la función. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg"> Figura 1: La metagenómica bioinformático de la tubería de Análisis para el ensilaje. Dos enfoques principales eranutilizado para investigar el microbioma del ensilaje, clasificación taxonómica y la anotación funcional. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg"> Figura 2: Calidad de secuencia por la base antes y después del recorte y la eliminación del adaptador. La secuencia de trama por la calidad de la base de FASTQC muestra la puntuación media Phred través de la longitud de la secuencia de control lee antes y después de la calidad. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg"> Figura 3: taxonómica Classificación del microbioma bacteriana de ensilaje sólido. Clasificación de la secuencia de superposición recortado y lee de la memoria flash se ha realizado mediante Kraken 7 y posteriormente se visualiza con corona. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg"> Figura 4: Distribución taxonómica de la Clase 4 Phyla más abundante en el microbioma bacteriana de ensilaje sólido. El porcentaje de cada clase de bacterias dentro de los cuatro filos más abundante. Firmicutes: clostridios (rojo) y bacilos (azul oscuro); Proteobacterias: delta / épsilon (rosa), alfa (azul claro), gamma (naranja) y beta (turquesa); Bacteroidetes: flavobacteria (azul oscuro) y Bacteroidia(Verde pálido); Actinobacteria: Coriobacteriia (púrpura oscura) y otra actinobacteria (verde oscuro). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg"> Figura 5: CAZy anotación del proteoma previsto en el Ensilaje sólido microbioma. diagrama de Venn que muestra la distribución de las cinco clases de enzimas de anotaciones CAZY en el proteoma predicho de microbioma ensilaje sólido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw lee </td><td rowspan="2"> # Filtrada lee (emparejado) </td> # Filtrada lee <td rowspan="2"> # FLASHED lee </td></tr><tr><td> (Emparejado) </td><td> (Sin pareja) </td></tr><tr><td> 2374949 x2 </td><td> 231679 x2 </td><td> 1,892,534 </td><td> 105.343 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Tabla resumen de las lecturas de secuenciación.

Metagenómica se utilizó para investigar el microbioma de la alimentación del ganado ensilado. El análisis se realizó por secuenciación con escopeta. Este enfoque se utilizó para caracterizar la composición de la comunidad microbiana dentro de la alimentación del ganado.

Análisis metagenomic de ensilaje

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

El objetivo general de este experimento es comprender la comunidad bacteriana que está presente dentro de una muestra de ensilaje, aunque estos procedimientos se pueden aplicar a una variedad de diferentes tipos de muestras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave a la hora de identificar las comunidades procariotas que se encuentran dentro de sistemas microbianos complejos, como en el caso que se presenta aquí, el ensilado para alimentación animal. La principal ventaja de esta técnica es que se emplea la secuenciación de escopeta en lugar de la secuenciación de amplicones 16S más convencional, lo que permite una precisión mucho mayor a la hora de clasificar el microbioma.Este método se puede aplicar a una amplia gama de otras muestras en las que se pueden formar microcosmos complejos, como en el intestino humano, en la superficie de la piel, en muestras de agua o incluso alrededor de la máquina de café de la oficina. Se utiliza un kit comercial para extraer el ADN de la muestra de ensilaje. Comience este procedimiento agregando de 100 a 400 miligramos de la muestra a 978 microlitros de tampón de fosfato de sodio y 122 microlitros de tampón de lisis del suelo en el tubo de lisis suministrado.Incluya un testigo negativo que no tenga muestra de ensilaje. Homogeneice las muestras colocando los tubos de lisis en el homogeneizador durante 40 segundos a una velocidad de 6,0 metros por segundo. Centrifugar los lisados durante 15 minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio que contenga 250 microlitros de solución de precipitado de proteínas y mezcle la solución invirtiendo 10 veces. A continuación, centrifugar durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio de 15 mililitros que contenga un mililitro de matriz de unión al ADN.Mezcle la solución invirtiendo el tubo constantemente durante tres minutos. Deje que la mezcla se asiente durante tres minutos, luego deseche 500 microlitros del sobrenadante y mezcle el sobrenadante restante mediante pipeteo. Transfiera 600 microlitros de la suspensión a un filtro de centrifugación y centrifugue a 14.000 veces G durante un minuto.Deseche el filtrado y repita el proceso con la suspensión restante. Después de desechar el filtrado, agregue 500 microlitros de tampón de lavado a la matriz de unión al ADN dentro del filtro de centrifugación, mezcle por pipeteo y centrifugue a 14.000 veces G durante un minuto. Deseche el filtrado y centrifugue el filtro giratorio durante dos minutos para asegurarse de que se elimine todo el tampón de lavado.Seque el filtro de centrifugado a 23 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue 100 microlitros de agua libre de DNasa precalentada a la matriz de unión al ADN y transfiera el filtro de centrifugación a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Centrifugar a 14.000 veces G durante un minuto para eluir el ADN.Almacene el ADN a menos 20 grados centígrados hasta que lo necesite para su posterior análisis. El ADN extraído de las muestras de ensilado se purificará utilizando perlas de purificación de ADN. Retire las cuentas del refrigerador y déjelas a 23 grados centígrados al menos 30 minutos antes de usarlas.Agregue dos volúmenes de perlas a cada muestra de ADN e incube la solución a 23 grados centígrados durante cinco minutos. Coloque las muestras en un imán de separación durante cinco minutos y luego deseche el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 200 microlitros de etanol fresco al 80%.Seque las cuentas al aire durante 10 minutos Las cuentas deben estar lo suficientemente secas, pero no demasiado secas, por lo que es crucial inspeccionar visualmente las cuentas antes de continuar. Retire las muestras del imán de separación, agregue 50 microlitros de tampón de elución y mezcle mediante pipeteo. Incube la suspensión a 23 grados centígrados durante cinco minutos y luego vuelva a colocar las muestras en el imán de separación durante tres minutos.Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo limpio y deseche las perlas. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de trabajo utilizando una proporción de 199 a uno de tampón a reactivo. Agregue 10 microlitros de cada patrón de ADN a 190 microlitros de solución de trabajo.Agregue 10 microlitros de ADN purificado a 190 microlitros de solución de trabajo. Incubar las muestras estándar y de ADN a 23 grados centígrados durante dos minutos. Posteriormente, analice los estándares antes de las muestras de ADN en el fluorómetro siguiendo las instrucciones en pantalla.Es fundamental que el ADN purificado sea de buena calidad y esté cuantificado con precisión, por lo que si hay alguna duda sobre la calidad y la concentración del ADN, se debe repetir la extracción del ADN. La biblioteca de secuenciación de escopeta se prepara utilizando un kit de preparación de biblioteca comercial. Diluir las muestras de ADN a 0,2 nanogramos por microlitro utilizando tampón de elución.Mezcle cinco microlitros del ADN purificado con 10 microlitros de tampón de marcación y cinco microlitros de mezcla de enzimas de etiquetado. Incubar las muestras a 55 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue cinco microlitros de tampón neutralizante a cada muestra e incube la solución a 23 grados centígrados durante cinco minutos.A continuación, agregue cinco microlitros de cada uno de los índices de secuenciación específicos de la muestra y 15 microlitros de la mezcla maestra de PCR. Coloque las muestras en un termociclador y realice la PCR. Purifique el ADN preparado utilizando el método de purificación de perlas como se demostró anteriormente, pero con una elución final de 30 microlitros de tampón de elución.Posteriormente, se secuencia el ADN y se utilizan una serie de herramientas bioinformáticas para analizar los datos de la secuencia, tal y como se describe en el protocolo de texto. La clasificación taxonómica del microbioma bacteriano se realizó con el software Kracken y luego se visualizó con el software CHROMA. La mayoría de las especies bacterianas presentes en el metagenoma del ensilaje se encuentran dentro de cuatro filas procariotas, las firmicutas al 34%, las actinobacterias al 28%, las proteobacterias al 27% y la bactoroítis al 7%.La anotación funcional realizada en lecturas ensambladas dio como resultado 6.357 proteínas predichas anotadas como una enzima activa de carbohidratos putativa y una de las cinco clases de enzimas que componen la base de datos de enzimas activas de carbohidratos. Este diagrama de Venn muestra la distribución de las anotaciones de proteínas, incluidas las que contienen más de una anotación de clase de enzima. De estos, se predijo que 3.591 tenían actividad glucósido hidrolasa.Una vez dominado, la preparación de las bibliotecas de secuenciación de ADN puede completarse en un solo día si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que no haya contaminación cruzada entre las muestras y utilizar siempre controles adecuados, como un blanco en blanco. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros análisis biofomáticos con el fin de validar las clasificaciones realizadas por Kracken.Estas técnicas metagenómicas permiten a los investigadores explorar el microbioma en muchos sistemas complejos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas de secuenciación de ADN metagenómico y realizar análisis bioinformáticos sobre las lecturas de secuencias de ADN obtenidas. No olvide que trabajar con reactivos de unión al ADN puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben usar precauciones como guantes y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.

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