Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

El objetivo general de este protocolo es diseñar factores de empalme artificial que puedan manipular específicamente el empalme alternativo de un objetivo determinado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del procesamiento de ARN, como la regulación y la mala regulación del empalme alternativo en las células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es su flexibilidad.

Podemos diseñar factores artificiales que promuevan o inhiban diferentes tipos de empalme alternativo en cualquier gen dado. Para demostrar este procedimiento estarán Huan-Huan, un investigador asociado de mi laboratorio, y Qianyun, un postdoctorado en mi laboratorio. El ADN PUF de tipo salvaje se utiliza como plantilla para generar el andamio de dominio PUF personalizado.

Utilice cebadores de PCR que contengan secuencias de PUF que reconozcan específicamente diferentes nucleótidos de ARN en cada posición. Para cada repetición de PUF, use cuatro cebadores diferentes para reconocer una base diferente en cada posición. En la primera ronda de PCR, utilice los pares de cebadores que se muestran para generar secuencias de codificación para cuatro repeticiones de PUF, fragmentos de puente universal y fragmentos de tapa.

En la segunda ronda, utilice los productos de PCR generados en el último paso como plantillas con las combinaciones de cebadores que se muestran para generar secuencias codificantes para los códigos de reconocimiento de ARN R-one a R-4 y R-cinco a R-ocho. En la tercera ronda, use los productos de la segunda ronda y conecte el cuatro al cinco como plantillas con el cebador R-one hacia adelante y el cebador inverso R-ocho para generar secuencias de codificación para R-one a R-ocho sin mayúsculas. En la cuarta ronda de PCR, utilice R-one a R-ocho, la tapa de extremo de cinco primos y la tapa de extremo de tres primos como plantillas, para generar secuencias de codificación para dominios PUF completos.

Para comenzar la transfección de células HEK-293T, mezcle el reactivo de transfección liposomal invirtiendo suavemente los frascos. A continuación, diluir dos microlitros de reactivo de transfección liposomal en 50 microlitros de medio sérico reducido por transfección. Mezcle suavemente y luego incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, diluya 04 microgramos de vector de expresión de dominio rico en glicina y 0,2 microgramos del plásmido reportero de empalme modular en 50 microlitros de medio sérico reducido en un tubo estéril. A continuación, diluir 0,4 microgramos de vector de expresión de dominio efector RS y 0,2 microgramos de plásmido reportero PGZ-tres en 50 microlitros de medio sérico reducido. Por último, diluir 0,4 microgramos de vector de expresión PGL-RS-PUF y 0,2 microgramos de plásmidos reporteros PEZ-1B o PEZ-2F en 50 microlitros de medio sérico reducido en un tubo estéril.

Después de cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, mezcle suavemente el reactivo de transfección liposomal diluido con las mezclas de plásmidos diluidas. Incubar las mezclas finales durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada las mezclas de transfección que contienen los vectores de expresión a cada pocillo de una placa de 24 pocillos sembrada con células HEK-293, e incube durante al menos 12 horas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de 12 horas de incubación, recoja las células transfectadas por tripsinización y centrifugación. Después de la centrifugación, deseche el medio y agregue 0,5 mililitros de tampón de extracción de ARN por tubo. Añada 0,1 mililitros de cloroformo por cada 0,5 mililitros de tampón de extracción de ARN a cada muestra.

Después de la incubación, centrifugar los tubos durante 15 minutos a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera la base acuosa a un tubo nuevo. Añadir 0,25 mililitros de isopropanol por cada 0,5 mililitros de tampón de extracción de ARN utilizado en la homogeneización inicial.

Mezclar por vórtice e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de una centrifugación como antes, el precipitado de ARN suele ser visible en la parte inferior del tubo. Deseche el sobrenadante y lave el pellet de ARN con 0,5 mililitros de etanol al 75% por 0,5 mililitros de tampón de extracción de ARN.

Agite vigorosamente y luego centrifugue a 7, 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después del centrifugado, retire el sobrenadante y seque al aire los gránulos de ARN. Disuelve los ARN en 50 microlitros de agua libre de ARNasa.

A continuación, agregue dos microlitros de cinco unidades por microlitro de DNasa-uno, siete microlitros de tampón 10X y 11 microlitros de agua a cada solución de ARN de 50 microlitros. Después de la incubación, caliente las soluciones a 70 grados centígrados durante 15 minutos para inactivar la DNasa. Después de realizar una reacción de transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir de cada muestra, agregue los componentes de la reacción de PCR marcados en el cuerpo en el orden que se muestra en la pantalla a los tubos de PCR.

Prepare una reacción por muestra. Ejecute el programa RT-PCR en el termociclador. Por último, resuelva los productos de PCR por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10% con tampón TBE.

Utilice un escáner de fluorescencia para visualizar los productos y mida la cantidad de cada isoforma empalmada mediante un software de densitometría. Para el ensayo de inmunofluorescencia para medir la apoptosis, prepare una mezcla de transfección que contenga plásmidos de expresión de dominio ricos en glicina como se mostró anteriormente, y transfecte células HeLa cultivadas en cubreobjetos de vidrio recubiertos de polilisina en una placa de seis pocillos. 24 horas después de la transfección, fije las celdas en los cubreobjetos con un mililitro de paraformaldehído al 4% en 1x PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, lave suavemente las celdas de los cubreobjetos con dos mililitros de 1x PBS durante cinco minutos. A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,2% en 1x PBS durante 10 minutos. Después de lavar tres veces con 1x PBS como antes, bloquee la unión inespecífica con albúmina sérica bovina al 3% en 1x PBS durante 10 minutos.

Diluir el anticuerpo bandera uno a 1.000 en 3%BSA en PBS, y pipetear 30 microlitros del anticuerpo bandera diluido en la hoja de parapelícula. Use fórceps para quitar un cubreobjetos. Seque cuidadosamente el exceso de tampón con toallitas de laboratorio y luego coloque la cubierta con el lado de la celda hacia abajo sobre la solución anti-bandera.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, agregue aproximadamente 500 microlitros de 1x PBS al lado de la celda del cubreobjetos hasta que flote sobre la solución. Devuélvalo a la placa de seis pocillos con 1x PBS en los pocillos.

Incubar con anticuerpo secundario en parafilm como antes durante 15 minutos. Lave como antes y luego monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje que contenga DAPI. Visualice las células con un microscopio de fluorescencia y fotografíelas con una cámara digital.

Usando microscopía de inmunofluorescencia, muchas células que expresaban Gly-PUF-531 tenían ADN nuclear fragmentado, lo que indicaba que estaban en apoptosis. Como control, las células que expresan Gly-PUF de tipo salvaje tenían menos ADN nuclear fragmentado en comparación con las células transfectadas con Gly-PUF-531. Aquí, la microscopía de inmunofluorescencia que utiliza el anticuerpo anti-flag combinado con células teñidas con DAPI muestra que el Gly-PUF-531 se localiza predominantemente en los núcleos de las células transfectadas.

Gly-PUF de tipo salvaje también se localiza en los núcleos de las células transfectadas, lo que sugiere que estos ESF se disocian de sus objetivos cuando los ARNm completamente empalmados se transportan al citoplasma. El porcentaje de células apoptóticas con ADN nuclear fragmentado se midió a partir de campos elegidos al azar de imágenes de microscopía de fluorescencia. Una vez dominados, la construcción de andamios PUF con especificidad de unión al ARN se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular específicamente el empalme alternativo en células humanas mediante la ingeniería de factores artificiales.