Name: Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprende a diseñar factores artificiales de empalme para manipular específicamente el splicing alternativo en células humanas. Este método flexible permite modular la expresión génica en investigación del cáncer.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01-CA158283 y la subvención NSFC 31400726 a ZWYW es financiado por el Programa de Young Thousand Talents y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31471235 y 81422038). XY es financiado por la fundación científica postdoctoral de China (2015M571612).

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<li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li>
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<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
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<li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este informe proporciona una descripción detallada para el diseño y construcción de los factores de empalme artificiales que pueden manipular específicamente el corte y empalme alternativo de un gen diana. Este método toma ventaja del modo de unión a la ARN única de PUF repite para producir un andamio de unión al ARN con especificidad personalizado. Se puede utilizar para activar o reprimir empalme. El paso crítico en este protocolo es la generación del dominio PUF reprogramed que define la ...

La mayoría de los genes humanos se someten a splicing alternativo (AS) para producir múltiples isoformas con actividades distintas, que ha aumentado en gran medida la complejidad de codificación del genoma 1, 2. AS proporciona un mecanismo importante para regular la función de genes, y está estrechamente regulada a través de diversas vías en diferentes etapas celular y del desarrollo 3, 4. Debido misregulation empalme es una causa común de la enfermedad humana 5, 6, 7, 8, dirigido a la regulación de empalme está convirtiendo en una ruta terapéutica atractiva. De acuerdo con un modelo simplificado de la regulación de empalme, AS está controlada principalmente por corte y empalme reguladores cis -Elementos (ERE) en pre-mRNA que funcionan como potenciadores de corte y empalme o silenciadores de exones alternativos. ThSREs ESE reclutan específicamente diversos factores de proteínas que actúan en trans (es decir, factores de empalme) que promueven o inhiben la reacción de corte y empalme 3, 9. La mayoría de los factores de empalme activo en trans tienen dominios de unión de ARN específico de secuencia separados de reconocer sus objetivos y dominios efectores para controlar empalme. Los ejemplos más conocidos son los miembros de la (SR) de la familia de proteínas serina / rico en arginina que contienen ARN de reconocimiento de motivos (EMRR), que se unen exonic splicing enhancers y RS C-terminales dominios N-terminales, que promueven la inclusión del exón 10 . A la inversa, hnRNP A1 se une a silenciadores exonic empalme a través de los dominios RRM e inhibe la inclusión del exón través de un dominio rico en glicina C-terminal 11. El uso de este tipo de configuraciones modulares, los investigadores deben ser capaces de diseñar los factores de empalme artificiales mediante la combinación de una específica de unión al ARN de dominio (RBD) con diferentes efecTor que activan o inhiben el empalme. La clave de tal diseño es utilizar un RBD que reconoce dadas objetivos con ARN programable vinculante especificidad, que es análoga a la ADN vinculante modo de la TALE dominio. Sin embargo, la mayoría de los factores de empalme nativos contienen RRM o K Homología (KH) dominios, que reconocen los elementos cortos de ARN con afinidad débil y por lo tanto carecen de un predictivo de ARN-proteína de reconocimiento &quot;código&quot; 12 . El RBD de PUF proteínas de repetición ( es decir, el dominio PUF) tiene un único modo de reconocimiento de ARN, lo que permite el rediseño de PUF dominios para reconocer específicamente diferentes ARN objetivos [ 13 , 14] . El dominio PUF canónico contiene ocho repeticiones de tres hélices α, cada una de las cuales reconoce una única base en un objetivo de ARN de 8 nt. Las cadenas laterales de aminoácidos en ciertas posiciones de la segunda hélice-α forman enlaces de hidrógeno específicos con el borde de Watson-Crick de tél ARN base, que determina la especificidad de unión de ARN de cada repetición (Figura 1A). El código de reconocimiento de bases de RNA de la repetición PUF es sorprendentemente simple (Figura 1A), lo que permite la generación de dominios PUF que reconocen cualquier combinación posible 8-base (revisado por Wei y Wang 15). Este principio de diseño modular permite la generación de un empalme Factor Engineered (FSE) que consiste en un dominio PUF personalizado y un dominio de modulación de empalme (es decir, un dominio de SR o un dominio Gly-ricos). Estos ESFs pueden funcionar ya sea como activadores de empalme o como inhibidores para controlar diversos tipos de eventos de empalme, y que han demostrado ser útiles como herramientas para manipular el empalme de genes endógenos relacionados con la enfermedad humana 16, 17. Como un ejemplo, hemos construido ESFs-de tipo Gly PUF para alterar específicamente el corte y empalme del gen Bcl-x, La conversión de la isoforma larga anti-apoptótica (Bcl-xL) a la pro-apoptótica isoforma corta (Bcl-xS). Desplazamiento de la relación de la Bcl-x isoforma era suficiente para sensibilizar a varias células cancerosas a múltiples fármacos de quimioterapia contra el cáncer 16, lo que sugiere que estos factores artificiales pueden ser útiles como reactivos terapéuticos potenciales. Además de controlar el empalme con dominios de empalme efectoras conocidos (por ejemplo, una RS o Gly-rico de dominio), los factores de PUF ingeniería también se pueden utilizar para examinar las actividades de los nuevos factores de empalme. Por ejemplo, usando este enfoque, hemos demostrado que el dominio C-terminal de varias proteínas SR puede activar o inhibir empalme cuando la unión a diferentes regiones pre-ARNm 18, que el motivo rico en alanina de RBM4 puede inhibir de empalme 19, y que el motivo rico en prolina de DAZAP1 puede mejorar de empalme 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. Estos nuevos dominios funcionales se pueden utilizar para construir otros tipos de factores artificiales a splicing afinar.

<table><tbody><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad (Phusion High-Fidelity) con tampón de PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA ligasa (T4 DNA ligasa)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección liposomal (Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Medio sérico reducido (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA tampón de extracción (reactivo TRIzol)El reactivo TRIzol</td> de <td>ambion</td><td>15596018</td><td>incluye fenol, que puede causar quemaduras. Use guantes cuando manipule</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Anticuerpo de transcriptasa inversa (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspasa-3</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo PARP</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-x anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo de beta-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting reactivos de detección</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células activado por fluorescencia (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtrar-esterilizar y almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Vector pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vector pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vector psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (libre de RNasa)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón (Anti-ratón IgG, anticuerpo ligado a HRP)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

El procesamiento de la mayoría de los ARN eucariotas está mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) con configuraciones modulares, incluyendo un módulo de reconocimiento de ARN, que se une específicamente a la diana pre-mRNA y un dominio efector. Anteriormente, hemos aprovechado el único modo de unión a ARN del dominio PUF en Pumilio humano 1 para generar un andamio de enlace de ARN programable, que se usó para diseñar varias RBPs artificiales para manipular el metabolismo de ARN. Aquí, un protocolo detallado se describe para construir Engineered Splicing Factors (ESF) que están específicamente diseñados para modular el empalme alternativo de los genes diana. El protocolo incluye cómo diseñar y construir un andamio PUF personalizado para un objetivo de ARN específico, cómo construir un plásmido de expresión de ESF fusionando un dominio PUF diseñador y un dominio efector y cómo usar ESFs para manipular el empalme de genes diana. En los resultados representativos de este método, se han descrito también los ensayos comunesde las actividades del FSE utilizando la prensa de empalme, la aplicación de FSE en células humanas cultivadas, y el posterior efecto de los cambios de empalme. Siguiendo los protocolos detallados en este informe, es posible diseñar y generar ESFs para la regulación de los diferentes tipos de splicing alternativo (AS), que proporciona una nueva estrategia para estudiar la regulación de empalme y la función de diferentes isoformas de empalme. Por otra parte, mediante la fusión de diferentes dominios funcionales con un dominio PUF diseñado, los investigadores pueden diseñar factores artificiales que se dirigen a ARN específicos para manipular diversos pasos de procesamiento del ARN.

Este informe describe el protocolo completo para el diseño y construcción de ESF y reporteros de empalme. También describe la aplicación adicional de ESFs en la manipulación del AS de genes endógenos 16. Para ilustrar los resultados típicos de empalme cambios FSE mediada, se utilizan los datos de nuestro trabajo anterior como un ejemplo. El SESF con diferentes dominios funcionales se pueden utilizar para promover o inhibir la inclusión del exón casete de destino <...

Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

El objetivo general de este protocolo es diseñar factores de empalme artificial que puedan manipular específicamente el empalme alternativo de un objetivo determinado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del procesamiento de ARN, como la regulación y la mala regulación del empalme alternativo en las células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es su flexibilidad.Podemos diseñar factores artificiales que promuevan o inhiban diferentes tipos de empalme alternativo en cualquier gen dado. Para demostrar este procedimiento estarán Huan-Huan, un investigador asociado de mi laboratorio, y Qianyun, un postdoctorado en mi laboratorio. El ADN PUF de tipo salvaje se utiliza como plantilla para generar el andamio de dominio PUF personalizado.Utilice cebadores de PCR que contengan secuencias de PUF que reconozcan específicamente diferentes nucleótidos de ARN en cada posición. Para cada repetición de PUF, use cuatro cebadores diferentes para reconocer una base diferente en cada posición. En la primera ronda de PCR, utilice los pares de cebadores que se muestran para generar secuencias de codificación para cuatro repeticiones de PUF, fragmentos de puente u

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Este protocolo describe la conversión de fibroblastos de piel en mioblastos y su diferenciación en miotubes. Las líneas celulares se derivan de pacientes con trastornos neuromusculares y se pueden utilizar para investigar mecanismos patológicos y para probar estrategias terapéuticas.

Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Este protocolo presenta una herramienta rápida y útil para evaluar el papel de una proteína con la función uncharacterized en la regulación que empalma alternativa después del tratamiento quimioterapéutico.

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

Este protocolo describe un ensayo de reportero de minigenes para monitorear el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5'en el empalme y desarrolla snRNA supresor U1 para el rescate de la inhibición del empalme inducida por la mutación. Las construcciones de snRNA U1 reportero y supresor se expresan en células HeLa, y el empalme se analiza por extensión de cebador o RT-PCR.

Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células humanas para analizar los factores de iniciación de la traducción que se unen a la tapa 5' del ARNm durante las condiciones fisiológicas de oxígeno. Este método utiliza un análogo de tapa m7GTP ligado a agarosa y es adecuado para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan.

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Aprende a diseñar factores artificiales de empalme para manipular específicamente el splicing alternativo en células humanas. Este método flexible permite modular la expresión génica en investigación del cáncer.

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

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