El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

El objetivo general de esta técnica es capturar in vitro las interacciones proteína-proteína proximal lipídica. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la dinámica mitocondrial, como por ejemplo cómo las interacciones proteína-proteína en la membrana externa mitocondrial pueden verse afectadas por los lípidos accesorios. La principal ventaja de esta técnica es que la unión de los dominios de proteínas solubles a las plantillas de lípidos garantiza que se pueda lograr una confirmación más nativa.

Además, las interacciones complejas entre las proteínas solubles y sus socios anclados pueden evaluarse en presencia de cofactores lipídicos definidos. Aunque utilizamos este método para investigar las interacciones de las proteínas en la maquinaria de fisión mitocondrial, también se puede aplicar a otros complejos de proteínas que se localizan en diversos compartimentos de membrana. Para demostrar este procedimiento estará Ryan, un estudiante de posgrado de mi laboratorio.

Primero, combine soluciones de cloroformo de los lípidos deseados en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Evapore el solvente con gas nitrógeno seco mientras gira el tubo para formar una fina película lipídica. A continuación, retire el disolvente residual con el evaporador centrífugo durante una hora a 37 grados centígrados.

A continuación, agregue tampón A precalentado para obtener una concentración final de lípidos de uno a dos milimolares. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados con vórtices ocasionales para resuspender completamente la mezcla de lípidos. Después de la incubación, transfiera la mezcla de lípidos a un tubo de ensayo de plástico y coloque el tubo en nitrógeno líquido durante aproximadamente 30 segundos hasta que esté completamente congelado.

Luego coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos hasta que se descongele por completo. A continuación, prepare una extrusora de lípidos remojando cuatro soportes de filtro y un filtro de policarbonato en el tampón A y ensamblando la extrusora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extruya la solución lipídica a través del filtro 21 veces utilizando una presión suave y constante para garantizar una distribución homogénea del tamaño.

Durante la extrusión, utilice una presión lenta y constante para garantizar la homogeneidad del tamaño de los liposomas. Con un filtro de una micra, esto es menos importante. Pero con tamaños de filtro más pequeños, puede introducir una heterogeneidad más aparente.

Almacene los liposomas extruidos a cuatro grados centígrados. Incubar el factor de fisión mitocondrial marcado con His o Mff con liposomas de andamio durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente en tampón A y BME. Para un control libre de Mff, incube los liposomas con una proteína de control marcada con His, como GFP, para unirse y proteger el níquel-NTA expuesto.

Agregue la proteína uno relacionada con la dinamina o Drp1 a la mezcla de liposomas e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, transfiera cinco microlitros de la muestra a una lámina de película de laboratorio y coloque una rejilla de cobre-rodio recubierta de carbono sobre la muestra. Después de incubar durante un minuto, retire el exceso de líquido con papel de filtro y agregue una gota de acetato de uranilo al 2%.

Después de incubar durante otro minuto, elimine el exceso de mancha con papel de filtro y transfiera la muestra a una caja de rejilla. Al día siguiente, tome imágenes de las muestras utilizando un microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 18.500 a 30.000X para observar los cambios ultraestructurales en las morfologías de proteínas y liposomas. Incubar Mff y Fis1 marcados con His con los liposomas del andamio durante 15 minutos a temperatura ambiente en tampón A y BME.

Agregue Drp1 e incube cada mezcla durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente. Transfiera los tubos al termociclador ajustado a 37 grados centígrados e inicie las reacciones agregando GTP y cloruro de magnesio. En los puntos de tiempo deseados, transfiera 20 microlitros de cada mezcla de reacción a los pocillos de una placa de microtitulación que contenga cinco microlitros de EDTA 0,5 molar para quelar el magnesio y detener la reacción.

A continuación, prepare un conjunto de patrones de fosfato diluyendo fosfato de potasio en tampón A y BME para calibrar los resultados. Añadir 20 microlitros de cada patrón a los pocillos que contengan cinco microlitros de EDTA 0,5 molar. Agregue 150 microlitros de reactivo de verde de malaquita a cada pocillo.

Por último, lea el DO 650 cinco minutos después de cada adición. GTP se hidrolizará lentamente en presencia del reactivo verde de malaquita ácida. Por lo tanto, este reactivo debe agregarse a todos los pocillos de muestra dentro de los 10 minutos posteriores a la medición de la absorbancia para maximizar la relación señal/ruido.

En ausencia de Drp1, ni Mff ni GFP dieron lugar a la deformación de la membrana. Y solo se observaron liposomas sin rasgos distintivos para los liposomas de andamio enriquecidos decorados con GFP o ESL. Sin embargo, cuando se añadió Drp1 a las plantillas de ESL decoradas con Mff, la remodelación de los liposomas fue evidente.

Decoración del SL con actividad GTPasa mejorada Mff. Por el contrario, cuando los grupos principales de NTA expuestos se bloquearon con GFP marcado con His, se ablacionó esta actividad GTPasa aumentada. El anclaje de Fis1 que carece de su dominio transmembrana al SL, tampoco logró provocar una estimulación de la actividad GTPasa de Drp1.

Al igual que en el SL, la adición de SL/Cl a Drp1 dio lugar a una ligera estimulación de la actividad de la GTPasa que se revirtió mediante la unión de Fis1 o GFP marcados con His a los liposomas. Se observó una sinergia entre Mff y cardiolipina, ya que la actividad de la GTPasa de Drp1 se estimuló 2,6 veces cuando se incubó con SL/CL decorado con Mff. Cuando las plantillas SL/PE/CL se decoraron con Mff, se mejoró la actividad de Drp1.

La capacidad de Drp1 para remodelar los liposomas en túbulos lipídicos se mejoró con la adición de PE a los liposomas del andamio. Una vez dominados, estos andamios se pueden preparar y utilizar en horas si el procedimiento se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos de interacción de proteínas y lípidos, como la sedimentación y los ensayos de dispersión de luz, para caracterizar las interacciones funcionales.

La aplicación de esta técnica permite a las personas que examinan la translocación de proteínas a una membrana biológica definida explorar las interacciones transitorias de proteínas y el impacto de cofactores lipídicos específicos en la formación y estabilización de ensamblajes celulares esenciales.