Name: El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a reconstituir interacciones proteína-proteína-lípidos proximal in vitro usando andamios liposomas. Este método permite estudiar la dinámica mitocondrial y el efecto de lípidos accesorios en conformaciones nativas.

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Los autores desean agradecer la financiación recibida de la Asociación Americana del Corazón (SDG12SDG9130039).

1. Preparación de liposomas Andamios NOTA: Idealmente, los experimentos iniciales se debe utilizar un andamio relativamente simple y sin rasgos (compuesto por DOPC (1,2-sn dioleoyl- glicero-3-fosfocolina o PC) y DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil - sn -glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) Building fuera de estos experimentos, la carga de los lípidos, la flexibilidad, y la curvatura puede introducirse como factores individuales con el potencial de alterar las interacciones de membrana proximal. Estos cambios se pueden lograr mediante la adición de cantidades definidas de los constituyentes lipídicos específicos, incluyendo fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolamina (DOPE o PE), o galactosil ceramida (β). <ol><li> Combinar los lípidos disueltos en cloroformo en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Se evapora el disolvente con gas nitrógeno seco mientras se gira el tubo para formar una película lipídica delgada. Eliminar el disolvente residual con una centrifugal evaporador durante 1 hora a 37 ° C. NOTA: Varias formulaciones de liposomas se utilizan en los protocolos descritos a continuación: liposomas de andamio (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7% en moles de DOPC), liposomas de andamio con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% en moles cardiolipina / 86,7% en moles de DOPC), liposomas andamio flexibles con cardiolipina (3,3% en moles DGS-NTA (Ni2 +) / 10% en moles cardiolipina / 35% en moles de DOPE / DOPC 51,7% en moles), y el andamio enriquecido liposomas (10% en moles DGS-NTA (Ni2 +) / 15% en moles cardiolipina / 35% mol DOPE / DOPC 40% en moles). </li><li> Añadir Tampón A (HEPES 25 mM (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), KCl 150 mM, pH ajustado a 7,5 con KOH) precalentado a 37 ° C tal que la concentración final de lípidos es de 1 - 2 mM. Incubar 30 min a 37 ° C con agitación ocasional para resuspender completamente la mezcla de lípidos (Figura 1a). </li><li> Transferir a un tubo de ensayo de plástico, colocar el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado (rougHly 30 s), y el lugar en un baño de agua a 37 ° hasta que esté completamente descongelado (aproximadamente 1 - 2 min). Repita para un total de 4 ciclos de congelación-descongelación (Figura 1b). </li><li> Preparar una extrusora de lípidos por remojo 4 soportes de filtro y un filtro de policarbonato en tampón y montaje de la máquina de extrusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extruir la solución de lípidos a través del filtro 21 veces. Use una presión suave y constante para asegurar una distribución homogénea de tamaño (Figura 1c). NOTA: Para todos los experimentos descritos en este protocolo, se utilizó un filtro de 1,0 micras de policarbonato para la extrusión. Interacción Drp1 con los lípidos aniónicos se puede observar con una variedad de diámetros de liposomas que van de 50 nm a 400 nm 12 o más grande 13. Por lo tanto, el tamaño del filtro de 1 m se elige para que sea ideal para la actividad GTPasa y de microscopía electrónica. Si se desean otros diámetros de liposomas, la preparación de vesículas unilamelares gigantes (14,15) o GUVs pequeña unilamellar vesículas 16 (SUVs) se puede utilizar. Dispersión dinámica de luz se puede utilizar para evaluar la heterogeneidad de liposomas de tamaño 13. </li><li> Almacenar los liposomas extruidos a 4 ° C y descartar después de 3 - 5 de d. </li></ol> 2. Uso de Andamios liposomas para análisis de unión de proteínas <ol><li> Preparación de la muestra <ol><li> Incubar Su-etiquetados MffΔTM (5 mM final) con liposomas de andamio (40% mol PC / 35% mol de PE / 15% mol CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 mM final) durante al menos 15 min a TA en tampón a + BME (HEPES 25 mM, KCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado a 7,5 con KOH). Para un control Mff libre, incubar liposomas con una marcada His proteína de control (tal como GFP) para atar y blindaje expuesto NTA (Ni2 +). NOTA: MffΔTM se expresó y se purificó como se describe en un estudio previo 2. GFP se purificó de una manera similar, pero se omitió la etapa de intercambio iónico. BME se requiere para estos experiments porque Drp1 es sensible a la oxidación, lo que puede alterar sus propiedades de actividad y de montaje. </li><li> Añadir Drp1 (2 mM final) y se incuba durante 1 h a TA. NOTA: Drp1 se expresó y se purificó como se describe en un estudio previo 2. Después de la incubación con Drp1, el efecto de la unión en la deformación de la membrana de nucleótidos puede ser investigado mediante la incubación de una hora más con 2 mM MgCl 2 y, o bien GTP 1 mM, 1 mM GMP-PCP, o tampón A + BME. </li></ol></li><li> Negativo a las manchas Microscopía Electrónica de Transmisión (EM) Análisis <ol><li> Transferencia de 5 l de muestra a una hoja de película de laboratorio y colocar una rejilla de Cu / Rh revestida de carbono en la muestra. Incubar la cuadrícula 1 min de la muestra, seque el exceso de líquido en el papel de filtro, y la transferencia a una gota de acetato de uranilo al 2%. Incubar 1 min, secar el exceso de tinta sobre papel de filtro, y la transfiere a una celda de la malla. Tienda al vacío O / N para asegurar la desecación completa. </li><li> muestras de imagen utilizando un microsc electrónica de transmisiónOPE en 18.500 - 30,000X magnificación para observar los cambios ultraestructurales en proteínas y liposomas morfologías 17. Nota: los cambios ultraestructurales pueden ser cuantificados usando el software de análisis de imágenes, tales como ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decoración de proteína se puede medir cuando se compara con las plantillas de lípidos desnudos. Además, los diámetros de los segmentos tubulares se pueden medir desde la parte más externa de los conjuntos de 13. Un análisis más detallado se puede realizar utilizando crio-microscopía electrónica 17. Este método se puede utilizar para conjuntos de proteína-lípido nativas de la imagen en el disolvente sin el uso de manchas de metal pesado que la capa de la muestra. De esta forma, las características estructurales detallados no aparentes en tinción negativa, incluyendo cambios en la morfología de lípidos subyacente, pueden ser examinados y cuantificados. </li></ol></li></ol> 3. El uso de liposomas para Andamios Ensayo enzimático Nota: Un coloriensayo de GTPasa métrica 18 se utilizó para medir la liberación de fosfato a través de la hidrólisis de GTP. Ensayos de GTPasa alternativos están disponibles 19 y se pueden implementar según sea necesario. <ol><li> Incubar Su-etiquetados MffΔTM (MFP), Fis1ΔTM (Fis1) o GFP (5 mM final para todos) con liposomas de andamio (150 mM final) durante 15 min a TA en tampón A + BME (volumen = 30 l). Añadir Drp1 (500 nM final) y se incuba 15 minutos más a temperatura ambiente (volumen = 80 l). NOTA: Fis1 se purificó de una manera similar a Mff 2, pero se omitió la etapa de cromatografía de intercambio iónico. El propósito de His-GFP es para proteger a la NTA grupos de cabeza (Ni2 +) y evitar interacciones de carga no específicos con otras proteínas. Si no se observa efecto en ausencia de GFP, a continuación, este control puede no ser necesaria. proteínas de bloqueo alternativos (de tamaño comparable al de la proteína de interés) se pueden utilizar también, pero GFP permite la visualización directa de las interacciones con SCAFdoblar liposomas. </li><li> Tubos de transferencia a un termociclador establece en 37 ° C, e inician las reacciones por adición de GTP y MgCl2 (1 mM y final 2 mM, respectivamente; volumen = 120 l). </li><li> En los puntos de tiempo deseados (es decir, t = 5, 10, 20, 40, 60 min), la transferencia de 20 l de reacción a los pocillos de una placa de microtitulación que contiene 5 l de 0,5 M EDTA para quelar Mg 2+ y detener la reacción. </li><li> Preparar un conjunto de normas de fosfato mediante la dilución de KH 2 PO 4 en tampón A + BME para calibrar los resultados. Una serie de normas útiles es de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 y 0 M. Añadir 20 l de cada uno para los pocillos que contenían 5 l de 0,5 M EDTA. </li><li> Añadir 150 l de reactivo de la malaquita verde (verde carbinol 1 mM malaquita, 10 mM de molibdato de amonio tetrahidratado, y HCl 1 N) a cada pocillo, y leer OD 650 5 min después de la adición. NOTA: GTP es ácido lábil, y se hidrolizará en presencia de reactivo de verde de malaquita. Asegúrese de que tque el tiempo entre la adición del reactivo de malaquita y la lectura es constante para asegurar resultados reproducibles. </li><li> Generar una curva estándar trazando OD 650 de las normas en función de la concentración de fosfato. Utilizar la regresión lineal para determinar la relación entre OD 650 y la concentración de fosfato en una muestra. </li><li> Uso de la regresión lineal, convertir el OD 650 de las muestras de reacción proteína a fosfato M. Determinar la velocidad de generación de fosfato para cada mezcla de reacción mediante el trazado de la concentración de fosfato como una función del tiempo, y convertir a k gato dividiendo la tasa por la concentración Drp1 (0,5 M). NOTA: Sólo la tasa lineal inicial se debe utilizar para determinar la velocidad de generación de fosfato, y un mínimo de 3 puntos de datos debe ser utilizado. Si la velocidad de reacción es suficientemente rápida que los primeros tres puntos de datos no son lineales (es decir, el r 2 del ajuste lineal es inferior a 0,9) un signoificantly más corto transcurso de tiempo con al menos 3 puntos de tiempo debe ser realizada. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo ofrece un método para la investigación de las interacciones proteína-proteína que participa en proteínas integrales de membrana. Mediante la utilización de un andamio modular de liposomas, los investigadores son capaces de evaluar la actividad de una o más proteínas en un entorno de lípidos proximal. Estudios anteriores han demostrado un método similar para las enzimas de los receptores de la membrana plasmática 24-26. Hemos ampliado este método para incorporar cofactores ...

El estudio de las interacciones proteína-proteína de membrana proximal es una tarea difícil debido a la dificultad para recapitular el entorno natural de las proteínas integrales de membrana que participan 1. Esto es debido a la necesidad de solubilización de detergente y la orientación inconsistente de proteínas en proteoliposomas. Con el fin de evitar estos problemas, se ha empleado una estrategia en la que dominios solubles de proteínas integrales de membrana se expresan como proteínas de fusión His-tag, y estos fragmentos solubles están anclados a los liposomas de andamio a través de interacciones con NTA (Ni 2+) grupos de cabeza en el lípido superficie. El uso de estos andamios, las interacciones proteína-lípido proximal pueden ser investigados en un rango de composiciones de lípidos y proteínas. Hemos aplicado con eficacia este método para investigar las interacciones proteína-proteína críticos que rigen el ensamblaje del complejo de la fisión mitocondrial y examinar las interacciones de lípidos que modulan este proceso 2. Durante la fisión mitocondrial, una proteína de la remodelación de membrana conservada, denominado proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) 3, es reclutado para la superficie de la externa mitocondrial membrana (OMM) en respuesta a señales celulares que regulan la homeostasis de la energía, la señalización de apoptosis, y varias otras procesos mitocondriales integrales. Este GTPasa grande, citosólica es reclutado a la superficie de la mitocondria a través de interacciones con proteínas integrales de OMM 4 - 8. El papel de una de tales proteínas, Fisión mitocondrial Factor (MFP), ha sido difícil de dilucidar debido a una débil interacción aparente con Drp1 in vitro. Sin embargo, los estudios genéticos han demostrado claramente que Mff es esencial para el éxito de 7,8 fisión mitocondrial. El método descrito en este manuscrito fue capaz de superar las deficiencias anteriores mediante la introducción de lípidos interacciones simultáneas que promueven interacciones Drp1-MFP. En general, este novedoso ensayo REVEAconducido interacciones fundamentales ensamblaje del complejo de fisión mitocondrial de guía y proporcionó una nueva etapa para estudios estructurales y funcionales en curso de esta máquina molecular esencial. Hasta la fecha, el examen de las interacciones entre Drp1 y Mff se han complicado por la flexibilidad inherente de Mff 9, la heterogeneidad de Drp1 Polímeros 2,10, y la dificultad en la purificación y reconstitución de longitud completa Mff con un dominio transmembrana intactas 11. Hemos abordado estos problemas mediante el uso de liposomas NTA (Ni2 +) de andamios para reconstituir His-Mff que carece de su dominio transmembrana (MffΔTM-Su 6). Esta estrategia fue una ventaja, ya MffΔTM era extremadamente soluble cuando se sobre-expresan en E. coli, y esta proteína aislada se reconstituyó fácilmente en liposomas de andamios. Cuando atado a estas plantillas de lípidos, Mff asumió una, la orientación hacia el exterior idéntica en la superficie de la membrana.Además de estas ventajas, los lípidos mitocondriales, tales como cardiolipina, se añadieron a estabilizar Mff plegado y la asociación con la membrana 11. La cardiolipina también interactúa con el dominio variable de Drp1 2,12 que puede estabilizar esta región desordenada y facilitar el montaje de la maquinaria de fisión. Este método robusto es ampliamente aplicable para futuros estudios que pretenden evaluar las interacciones proteína-membrana proximal. Mediante el uso de interacciones adicionales tethering / afinidad, la sofisticación de estos estudios de reconstitución de membrana se puede mejorar para imitar la complejidad adicional que se encuentra en la superficie de las membranas dentro de las células. Al mismo tiempo, las composiciones lipídicas se pueden modificar para imitar con mayor precisión los ambientes nativos de estos complejos macromoleculares. En resumen, este método proporciona un medio para examinar las contribuciones relativas de las proteínas y lípidos de membrana en la configuración de morfologías que durante proc celulares críticaseses.

<table><tbody><tr><td>Fosfatidilcolina (DOPC)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>fosfatidiletanolamina (DOPE)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>corazón bovino Cardiolipina (CL)</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de liposomas</td><td>268320010 Avanti Lípidos polares</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>rejillas de tinción negativas de Cu/Rh Tubo de</td> microfuga <td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de placa de</td> <td>microtitulaciónThermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tinte Azul Instantáneo Coomassie</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Colorante de carga</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malaquita Carbinol Verde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de amonio Tetrahidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Película de laboratorio</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Tecnai T12 100 keV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CentriVap refrigerado Concentrador</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Los estudios de proteínas integrales de membrana in vitro con frecuencia se complica por la presencia de un dominio transmembrana hidrófobo. Para complicar aún más estos estudios, la reincorporación de proteínas de membrana solubilizada con detergente en los liposomas es un proceso estocástico donde topología de la proteína es imposible de aplicar. Este trabajo ofrece un método alternativo para estas técnicas desafiantes que utiliza un andamio a base de liposomas. solubilidad de la proteína se ve reforzada por la supresión del dominio transmembrana, y estos aminoácidos se sustituyen con un resto de anclaje, tal como una etiqueta de His. Esta correa de sujeción interactúa con un grupo de anclaje (Ni 2+ coordinado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni 2+)) para marcado con His proteínas), que hace cumplir una topología de proteína uniforme en la superficie del liposoma. Se presenta un ejemplo en el que la interacción entre la proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) con una proteína de membrana, la fisión mitocondrial Factor (MFP), fue investigated utilizando este método andamio liposoma. En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de reclutar Mff eficiente Drp1 solubles a la superficie de los liposomas, que estimuló su actividad GTPasa. Por otra parte, Drp1 pudo tubulate la plantilla de lípidos decorados a Mff en presencia de lípidos específicos. Este ejemplo demuestra la eficacia de los liposomas de andamio usando ensayos estructurales y funcionales y destaca el papel de Mff en la regulación de la actividad Drp1.

Mientras que la interacción entre Drp1 y Mff ha demostrado ser importante para la fisión mitocondrial, esta interacción ha sido difícil de recapitular in vitro. Nuestro objetivo era emular mejor el entorno celular en el que Drp1 y Mff interactúan. Con este fin, los liposomas que contienen concentraciones limitantes de NTA (Ni 2+) grupos de cabeza se prepararon mediante rehidratación de una película de lípidos como se describió anteriormente. La solución de lípidos con...

Este artículo describe un método para evaluar las interacciones y ensamblajes de proteínas integrales de membrana in vitro con varios factores asociados en un entorno proximal de lípidos.

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

El objetivo general de esta técnica es capturar in vitro las interacciones proteína-proteína proximal lipídica. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la dinámica mitocondrial, como por ejemplo cómo las interacciones proteína-proteína en la membrana externa mitocondrial pueden verse afectadas por los lípidos accesorios. La principal ventaja de esta técnica es que la unión de los dominios de proteínas solubles a las plantillas de lípidos garantiza que se pueda lograr una confirmación más nativa.Además, las interacciones complejas entre las proteínas solubles y sus socios anclados pueden evaluarse en presencia de cofactores lipídicos definidos. Aunque utilizamos este método para investigar las interacciones de las proteínas en la maquinaria de fisión mitocondrial, también se puede aplicar a otros complejos de proteínas que se localizan en diversos compartimentos de membrana. Para demostrar este procedimiento estará Ryan, un estudiante de posgrado de mi laboratorio.Primero, combine soluciones de cloroformo de los lípidos deseados en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Evapore el solvente con gas nitrógeno seco mientras gira el tubo para formar una fina película lipídica. A continuación, retire el disolvente residual con el evaporador centrífugo durante una hora a 37 grados centígrados.A continuación, agregue tampón A precalentado para obtener una concentración final de lípidos de uno a dos milimolares. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados con vórtices ocasionales para resuspender completamente la mezcla de lípidos. Después de la incubación, transfiera la mezcla de lípidos a un tubo de ensayo de plástico y coloque el tubo en nitrógeno líquido durante aproximadamente 30 segundos hasta que esté completamente congelado.Luego coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos hasta que se descongele por completo. A continuación, prepare una extrusora de lípidos remojando cuatro soportes de filtro y un filtro de policarbonato en el tampón A y ensamblando la extrusora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extruya la solución lipídica a través del filtro 21 veces utilizando una presión suave y constante para garantizar una distribución homogénea del tamaño.Durante la extrusión, utilice una presión lenta y constante para garantizar la homogeneidad del tamaño de los liposomas. Con un filtro de una micra, esto es menos importante. Pero con tamaños de filtro más pequeños, puede introducir una heterogeneidad más aparente.Almacene los liposomas extruidos a cuatro grados centígrados. Incubar el factor de fisión mitocondrial marcado con His o Mff con liposomas de andamio durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente en tampón A y BME. Para un control libre de Mff, incube los liposomas con una proteína de control marcada con His, como GFP, para unirse y proteger el níquel-NTA expuesto.Agregue la proteína uno relacionada con la dinamina o Drp1 a la mezcla de liposomas e incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, transfiera cinco microlitros de la muestra a una lámina de película de laboratorio y coloque una rejilla de cobre-rodio recubierta de carbono sobre la muestra. Después de incubar durante un minuto, retire el exceso de líquido con papel de filtro y agregue una gota de acetato de uranilo al 2%.Después de incubar durante otro minuto, elimine el exceso de mancha con papel de filtro y transfiera la muestra a una caja de rejilla. Al día siguiente, tome imágenes de las muestras utilizando un microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 18.500 a 30.000X para observar los cambios ultraestructurales en las morfologías de proteínas y liposomas. Incubar Mff y Fis1 marcados con His con los liposomas del andamio durante 15 minutos a temperatura ambiente en tampón A y BME.Agregue Drp1 e incube cada mezcla durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente. Transfiera los tubos al termociclador ajustado a 37 grados centígrados e inicie las reacciones agregando GTP y cloruro de magnesio. En los puntos de tiempo deseados, transfiera 20 microlitros de cada mezcla de reacción a los pocillos de una placa de microtitulación que contenga cinco microlitros de EDTA 0,5 molar para quelar el magnesio y detener la reacción.A continuación, prepare un conjunto de patrones de fosfato diluyendo fosfato de potasio en tampón A y BME para calibrar los resultados. Añadir 20 microlitros de cada patrón a los pocillos que contengan cinco microlitros de EDTA 0,5 molar. Agregue 150 microlitros de reactivo de verde de malaquita a cada pocillo.Por último, lea el DO 650 cinco minutos después de cada adición. GTP se hidrolizará lentamente en presencia del reactivo verde de malaquita ácida. Por lo tanto, este reactivo debe agregarse a todos los pocillos de muestra dentro de los 10 minutos posteriores a la medición de la absorbancia para maximizar la relación señal/ruido.En ausencia de Drp1, ni Mff ni GFP dieron lugar a la deformación de la membrana. Y solo se observaron liposomas sin rasgos distintivos para los liposomas de andamio enriquecidos decorados con GFP o ESL. Sin embargo, cuando se añadió Drp1 a las plantillas de ESL decoradas con Mff, la remodelación de los liposomas fue evidente.Decoración del SL con actividad GTPasa mejorada Mff. Por el contrario, cuando los grupos principales de NTA expuestos se bloquearon con GFP marcado con His, se ablacionó esta actividad GTPasa aumentada. El anclaje de Fis1 que carece de su dominio transmembrana al SL, tampoco logró provocar una estimulación de la actividad GTPasa de Drp1.Al igual que en el SL, la adición de SL/Cl a Drp1 dio lugar a una ligera estimulación de la actividad de la GTPasa que se revirtió mediante la unión de Fis1 o GFP marcados con His a los liposomas. Se observó una sinergia entre Mff y cardiolipina, ya que la actividad de la GTPasa de Drp1 se estimuló 2,6 veces cuando se incubó con SL/CL decorado con Mff. Cuando las plantillas SL/PE/CL se decoraron con Mff, se mejoró la actividad de Drp1.La capacidad de Drp1 para remodelar los liposomas en túbulos lipídicos se mejoró con la adición de PE a los liposomas del andamio. Una vez dominados, estos andamios se pueden preparar y utilizar en horas si el procedimiento se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos de interacción de proteínas y lípidos, como la sedimentación y los ensayos de dispersión de luz, para caracterizar las interacciones funcionales.La aplicación de esta técnica permite a las personas que examinan la translocación de proteínas a una membrana biológica definida explorar las interacciones transitorias de proteínas y el impacto de cofactores lipídicos específicos en la formación y estabilización de ensamblajes celulares esenciales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Aquí presentamos dos protocolos ultrarrápidos para la reconstitución de proteínas de membrana en proteoliposomes fusogénicas y fusión de tales proteoliposomes con bicapas de lípidos de destino para la entrega de detergente libre de estas proteínas de membrana a la bicapa postfusion. La combinación de estos enfoques permite a Asamblea rápida y fácilmente controlado de los sistemas de membranas de varios componentes complejos.

Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes.

Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

La fusión de membranabiológica es catalizada por proteínas de fusión especializadas. La medición de las propiedades fusogénicas de las proteínas se puede lograr mediante ensayos de mezcla de lípidos. Presentamos un método para purificar la Drosophila atlastin recombinante, una proteína que media la fusión homotípica de la sala de urgencias, reconstituyéndola a liposomas preformados, y probando la capacidad de fusión.

Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos

La fusión mitocondrial es una reacción homeostática importante subyacente a la dinámica mitocondrial. Aquí se describe un sistema de reconstitución in vitro para estudiar la fusión de membrana interna mitocondrial que puede resolver el anclaje de membrana, acoplamiento, hemisfusión y apertura de poros. Se discute la versatilidad de este enfoque en la exploración de los sistemas de membrana celular.

Una plataforma de membrana modelo para la reconstitución de la dinámica de membrana mitocondrial

Este protocolo describe un método eficiente libre de células para la producción de proteoliposoma de alta calidad por el método de diálisis bicapa utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. Este método proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Este artículo presenta una reconstitución simple de redes de citoesqueletos dentro de vesículas gigantes separadas en fase. El método puede generalizarse y aplicarse a la encapsulación o confinamiento de una amplia gama de biomoléculas.

In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Aprende a reconstituir interacciones proteína-proteína-lípidos proximal in vitro usando andamios liposomas. Este método permite estudiar la dinámica mitocondrial y el efecto de lípidos accesorios en conformaciones nativas.

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

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