Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia
6 de marzo de 2017
Aquí se presenta un protocolo para medir la fuerza de las interacciones entre una superficie inorgánica bien definido y, o bien péptidos o aminoácidos mediante medidas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula usando un microscopio de fuerza atómica (AFM). La información obtenida de la medición es importante para entender mejor la interfase material peptídico-inorgánico.
El objetivo general de la técnica de espectroscopia de fuerza de una sola molécula es determinar la fuerza de adhesión y la naturaleza de las interacciones entre aminoácidos o péptidos con diferentes superficies. Este material puede ayudar a responder preguntas clave en el área de la química de superficies y ser utilizado para el desarrollo de nuevos compuestos y cordados. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información sobre la interacción entre la molécula deseada y las superficies a nivel de una sola molécula.
Para comenzar, compre voladizos AFM de nitruro de silicio equipados con puntas de silicio con un radio de voladizo nominal de dos nanómetros. Monte la punta en el soporte. Limpie cada uno de los voladizos AFM sumergiéndolos en etanol durante 20 minutos y luego séquelos a temperatura ambiente.
A continuación, coloque las puntas en una cámara de plasma y trate los voladizos exponiéndolos al plasma de oxígeno durante cinco minutos. Prepare una solución que contenga 15 partes de metiltrietoxisilano y una parte de tres aminoácidos propiltrietoxisilano y suspenda los voladizos tres centímetros por encima de la solución mientras se encuentra bajo una atmósfera inerte. Es importante que las puntas y el soporte no toquen la mezcla de silano.
Además, el silano es muy sensible a la humedad y, por lo tanto, estas puntas deben realizarse en una atmósfera inerte. Una vez sellado, conecte el desecador a una bomba de vacío y aplique vacío durante dos horas para formar una monocapa de los dos tipos de compuestos de silano mezclados en la superficie de los voladizos. Retire con cuidado las puntas y colóquelas en una placa caliente precalentada a 70 grados centígrados.
Deja que las puntas se sequen durante 10 minutos. Enfríe las puntas a temperatura ambiente antes de sumergirlas en una solución de Fmoc-PEG-NHS durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, sumerja las puntas en cloroformo durante cinco minutos y luego en DMF durante cinco minutos más.
Después de la incubación en DMF, desproteja los grupos Fmoc de las moléculas de PEG unidas sumergiendo las puntas en una solución de piperidina al 20% en DMF durante 30 minutos. Nuevamente, sumerja las puntas en DMF durante cuatro minutos y luego en N-metil-2-pirrolidona durante cuatro minutos adicionales. Para acoplar los aminoácidos en las puntas, sumergirlas durante una hora y media en una solución de acoplamiento de aminoácidos con una concentración total de 30 milimolares y cinco mililitros de N-metil-2-pirrolidona.
Para proteger los residuos restantes de PEG libres o no reactivos por el grupo acetilo, sumerja las puntas durante 30 minutos en una mezcla molar de 0,65 de cuatro partes de anhídrido acético y una parte de diisopropiletilamina y N-metil-2-pirrolidona. A continuación, sumerja secuencialmente las puntas funcionalizadas con aminoácidos peptídicos durante cuatro minutos cada una en NMP, cloroformo, etanol al 50% y agua antes de secar finalmente la punta al aire. Fije la superficie de prueba deseada a un soporte metálico del AFM con epoxi disponible en el mercado.
Luego, coloque el soporte metálico en el soporte de vidrio del AFM, que tiene la forma de una pequeña placa de Petri. Llene el portavasos con tampón TRIS. Y luego coloque el soporte metálico en la etapa AFM debajo del soporte de la punta.
A continuación, monte la punta del AFM en el cristal óptico del AFM. Coloque el bloque de vidrio óptico en el cabezal AFM. Y poner la cabeza de AFM en el escenario.
A continuación, calibre los voladizos AFM con constantes de resorte que oscilen entre 10 y 30 piconewtons por nanómetro. Una medición de fuerza típica da como resultado una curva de fuerza-distancia como las que se muestran aquí. El primer vistazo indica interacciones no específicas entre la punta y la superficie y el segundo vistazo se refiere al evento de adhesión específico.
A partir de varios cientos de curvas de fuerza-distancia, es posible construir un histograma trazando el número de eventos de adhesión frente a la fuerza. La aplicación de un ajuste gaussiano en estos histogramas determinará la fuerza más probable. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modificar químicamente las puntas de AFM con aminoácidos o péptidos y cómo realizar espectroscopia de fuerza de una sola molécula usando AFM.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para medir la fuerza de las interacciones entre superficies inorgánicas y péptidos o aminoácidos utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula con un microscopio de fuerza atómica (AFM). Comprender estas interacciones es fundamental para avanzar en el conocimiento en química de superficies y desarrollo de materiales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Química de superficies
- Espectroscopía de fuerza a nivel de molécula individual
- Ciencia de materiales
Antecedentes
- La espectroscopía de fuerza a nivel de molécula individual permite la medición de fuerzas de adhesión a nivel molecular.
- Esta técnica puede proporcionar información sobre las interacciones entre péptidos o aminoácidos y diversas superficies.
- Comprender estas interacciones es esencial para el desarrollo de nuevos materiales compuestos.
- El uso de microscopía de fuerza atómica (AFM) en este contexto mejora la precisión de las mediciones.
Objetivo del estudio
- Determinar la fuerza de adhesión entre péptidos o aminoácidos y superficies inorgánicas.
- Explorar la naturaleza de las interacciones moleculares a nivel de una sola molécula.
- Contribuir a los avances en la química de superficies y el diseño de materiales.
Métodos Utilizados
- Uso de cantileveres de microscopía de fuerza atómica (AFM) de nitruro de silicio con puntas de silicio.
- Limpieza de los cantileveres de AFM con etanol antes de las mediciones.
- Medición de las fuerzas de interacción mediante técnicas de AFM.
- Análisis de los datos para comprender las interfases entre péptidos y materiales inorgánicos.
Resultados Principales
- Medición exitosa de las fuerzas de adhesión entre péptidos/aminoácidos y superficies.
- Conocimientos sobre la naturaleza de las interacciones a nivel molecular.
- Aplicaciones potenciales en el desarrollo de nuevos materiales.
- Comprensión mejorada de las interfases entre péptidos y materiales inorgánicos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar interacciones moleculares.
- Los hallazgos pueden orientar investigaciones futuras en química de superficies y ciencia de materiales.
- La espectroscopía de fuerza a nivel de una sola molécula es una herramienta valiosa para comprender las fuerzas de adhesión.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender las interacciones a nivel molecular entre biomoléculas y superficies inorgánicas apoya la validación de objetivos en el desarrollo de biomateriales y reduce la incertidumbre mecanicista en las etapas iniciales del descubrimiento. La espectroscopía de fuerza a nivel de molécula individual permite la evaluación cuantitativa de las fuerzas de adhesión, proporcionando confianza predictiva en el cribado de biocompatibilidad de materiales. Este enfoque ayuda a reducir los riesgos asociados a hipótesis relacionadas con el ensuciamiento biológico, el diseño de compuestos y la funcionalización de superficies antes de realizar inversiones traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide las fuerzas de adhesión entre aminoácidos/péptidos y superficies para investigar hipótesis sobre el reconocimiento molecular.
- Valor operativo: Proporciona resolución a nivel de molécula individual para distinguir interacciones específicas de las no específicas en estudios de unión a dianas.
- Valor predictivo: Permite discriminar mediante fuerza los modos de unión para apoyar la identificación de compuestos prometedores en el diseño de biomateriales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera histogramas cuantitativos de fuerza de adhesión para comparaciones estandarizadas entre variantes de péptidos o químicas de superficie.
- Valor operativo: Utiliza curvas de fuerza-distancia basadas en microscopía de fuerza atómica (AFM) para establecer ensayos de interacción reproducibles y sin marcadores.
- Preparación del ensayo: Permite mapeo de fuerza de alto contenido para orientar la selección de secuencias de péptidos en campañas de cribado posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Relaciona datos de interacciones moleculares con mecanismos de formación de biopelículas relevantes para modelos de infección asociados a implantes.
- Modelado Preclínico: Facilita la evaluación de interfaces péptido-inorgánicas en sistemas relevantes para enfermedades, como superficies de catéteres o sensores.
- Reducción de Riesgos: Orienta la selección de materiales al cuantificar la propensión al ensuciamiento biológico mediante métricas de adhesión a nivel de molécula individual.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, donde la reducción de riesgos mecanicistas de las interacciones entre el blanco y la superficie precede al desarrollo del ensayo y a la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa los aspectos termodinámicos y cinéticos de la unión péptido-superficie para aclarar los mecanismos de unión.
- Selección: Genera salidas de distribución de fuerza que permiten clasificar candidatos peptídicos según su resistencia adhesiva.
- Análisis: Aplica ajuste gaussiano a histogramas de eventos adhesivos para extraer valores de fuerza más probables y facilitar la toma de decisiones cuantitativas.
- Investigación Traducional: Relaciona mediciones de fuerza con la evaluación del riesgo de bioensuciamiento en contextos relevantes para dispositivos médicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma adaptable para seleccionar diversas biomoléculas frente a diferentes recubrimientos inorgánicos o nanomateriales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad en los mecanismos de interacción al proporcionar mediciones directas de fuerza con resolución a nivel de una sola molécula.
- Valor operativo: Proporciona datos estandarizados y reproducibles de espectroscopía de fuerza entre laboratorios y sistemas de materiales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar en el desarrollo de biomateriales mediante la cuantificación temprana de la estabilidad en la interfaz.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos peptídicos basada en perfiles de interacción con superficies.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de AFM, química de superficies y manipulación de péptidos bajo condiciones inertes.
- Depende del acceso a sistemas de AFM con cantilever funcionales y aislamiento de vibraciones para mediciones de fuerza sensibles.
- Necesita la estandarización de los protocolos de silanización, PEGilación y acoplamiento entre diferentes usuarios para garantizar la consistencia del punzón.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a diferentes longitudes de péptidos, químicas de superficie o condiciones de tampón.
- Está limitado por el rendimiento de las mediciones a nivel de molécula individual y por la necesidad de cientos de curvas de fuerza para construir histogramas confiables.
