La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

El objetivo general de este procedimiento es explorar la función génica en Dermestes maculatus, un nuevo sistema modelo de insectos, que representa el diverso clado de escarabajos y facilita el estudio de preguntas de investigación básicas y aplicadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo, la biología evolutiva y más allá, al hacer posible probar la función de los genes en embriones y adultos de Dermestes. La principal ventaja de esta técnica es que el ARN de interferencia se puede utilizar para dirigirse a cualquier gen, basándose únicamente en la información de la secuencia, incluso en ausencia de una secuencia completa del genoma.

Los métodos introducidos aquí no solo proporcionan un enfoque para estudiar la función génica en Dermestes. También se pueden aplicar para desarrollar nuevos sistemas de modelos de insectos y, potencialmente, para controlar plagas de insectos. Para preparar una jaula de cría para un D. maculatus, primero extienda una capa delgada de virutas de madera en una jaula de insectos de tamaño mediano.

Coloque una sección de espuma de poliestireno en la jaula para permitir que las larvas tengan un entorno en el que pupar. Agregue de veinte a cincuenta escarabajos adultos o larvas de estadio tardío a la jaula. Coloque la comida húmeda para gatos en una placa de Petri o en un bote de pesaje, como fuente de alimento.

Cubra la jaula con un paño de malla y colóquela en una incubadora. Antes de comenzar la recolección de embriones, primero revise la jaula cuidadosamente para ver si hay embriones presentes y retírelos. Una vez que la jaula esté despejada, coloque una bola de algodón estirada en la jaula e incube la colonia a 30 grados centígrados.

Después de la ventana de tiempo adecuada, recoja la bola de algodón y retire a los adultos presentes, y colóquelos nuevamente en la jaula. Sobre un trozo de cartulina negra, pellizca suavemente la bola de algodón y rómpala lentamente en un filamento fino, de modo que los huevos presentes caigan sobre el papel negro. Tome una tapa de placa de Petri estándar y use un trozo de papel de filtro negro para cubrir el interior.

Pegue un trozo de cinta adhesiva de doble cara a lo largo del borde de un portaobjetos de microscopio estándar. Coloque el portaobjetos del microscopio sobre el papel de filtro negro de la tapa de la placa de Petri. Tomando el papel que contiene los embriones recolectados, golpee suavemente para transferir los embriones a la tapa de la placa de Petri.

Con un pincel, alinee los embriones en la cinta perpendicular al portaobjetos, con el extremo anterior o posterior hacia el borde. Para comenzar con el ARNi, primero tome de 2 a 4 microlitros de dsRNA en una punta de pipeta de microcargador de 20 microlitros. Inserte la punta en un capilar de vidrio preextraído, denominado aguja, y pipetee suavemente la solución en la aguja.

Fije la aguja en un soporte capilar de vidrio y luego ensamble el soporte capilar en el micromanipulador. A continuación, transfiera con cuidado el portaobjetos con los embriones adheridos a la platina del microscopio de disección. Mueva el portaobjetos para llevar un embrión al centro del campo y enfocar el microscopio.

Mientras mira el visor de disección, coloque la punta del capilar con el micromanipulador. Acerque la punta al final del primer embrión de la fila. Encienda el suministro de nitrógeno o aire y, a continuación, coloque el interruptor selector de entrada del solenoide en vacío.

Ajuste el regulador de presión de expulsión a 10-15 psi, dependiendo del aparato. Abra el capilar y la solución de dsRNA coloreada llenará la punta, lista para la inyección. Mueva la punta capilar hacia adelante y perfore suavemente el embrión.

Bajo los ajustes de presión ideales, ningún líquido embrionario fluirá hacia el capilar. Pise el interruptor de pie para expulsar el dsRNA en el embrión, hasta que se dispense la cantidad adecuada. Deja la punta dentro del embrión durante unos dos segundos y luego retírala con cuidado.

Una vez que se hayan inyectado todos los embriones, coloque el portaobjetos en una placa de Petri. Agregue una bola de algodón húmeda al plato, teniendo cuidado de que no entre en contacto con el tobogán. Cubra la placa de Petri y envuélvala con una película de sellado.

Etiquételo con el tipo de dsRNA, la concentración, la fecha, la hora y el número de embriones inyectados. Finalmente, coloque el plato en una incubadora a 30 grados centígrados hasta que los embriones eclosionen. Para realizar pRNAi, primero recoja pupas de la colonia.

Clasifique las pupas macho y hembra en dos platos separados y colóquelos en una incubadora de 30 grados centígrados. Revise las placas diariamente en busca de escarabajos cerrados y transfiera estos individuos a dos placas de Petri separadas para adultos machos y hembras. Alimente a estos adultos y mantenga las placas cada dos días, hasta que se hayan cerrado suficientes adultos para comenzar la inyección.

Una vez que se complete el grupo de adultos, anestesia a un escarabajo hembra y sostenga el lado ventral individual hacia arriba con una mano, sosteniendo la jeringa con la otra. Penetrar suavemente en la membrana de segmacoria entre los esternitos 2 y 3. Revise la escala de la jeringa y dispense lentamente alrededor de dos microlitros por hembra.

Después de la inyección, sostenga la aguja firmemente durante al menos 5 segundos y luego retírela con cuidado. Transfiera las hembras inyectadas a una placa de Petri con comida para gatos. Etiquete el plato de manera apropiada.

Coloque el plato en una incubadora a 30 grados centígrados. Después de 24 horas, transfiera las hembras inyectadas a una mini jaula y agregue un número igual de machos jóvenes no inyectados. Etiqueta la jaula y agrega comida para gatos.

Coloque la jaula en una incubadora a 30 grados centígrados para permitir el apareamiento. A continuación, se puede examinar la descendencia resultante para determinar los efectos del ARNp. Esta imagen muestra una descendencia de un individuo de ARNp inyectado con DS GFP, proteína fluorescente verde como control.

Aquí, al igual que con los individuos de tipo salvaje, la descendencia eclosionó con una raya pigmentada por segmento. Las rayas pigmentadas vecinas estaban separadas por un espacio no pigmentado. Después de parear el ARNp, la descendencia afectada eclosionó con rayas pigmentadas vecinas fusionadas, lo que indica límites segmentarios defectuosos.

La severidad fenotípica fue variable, pero las fusiones aparecieron consistentemente en ciertas regiones límite, lo que indica defectos similares a la regla de pares. De manera similar, los fenotipos de cutícula de los embriones no eclosionados después del derribo emparejado mostraron pérdida de segmentos abdominales, así como una longitud corporal más corta. La tinción de embriones tempranos con anticuerpo engrailado para examinar defectos moleculares mostró franjas de expresión de igual intensidad en cada segmento en los individuos control.

Por el contrario, se detectó una expresión reducida en franjas alternas en la descendencia de hembras inyectadas con dsRNA emparejado con Dmac. Este patrón de expresión reducida es consistente con el patrón de cutícula defectuoso observado en las larvas eclosionadas afectadas. Aquí, por primera vez, presentamos nuestro protocolo para derribar un gen de interés, durante el desarrollo embrionario temprano en Dermestes maculatus, utilizando ARN de interferencia.

Al intentar estos procedimientos, es importante recordar utilizar embriones o mujeres adultas en la etapa adecuada. Una vez dominado, se puede inyectar unos 100 embriones o 10 hembras adultas en media hora. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de embriones o la PCR cuantitativa para responder preguntas adicionales sobre los mecanismos reguladores de genes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar una colonia de laboratorio de Dermestes y realizar interferencias de ARN embrionario y parental en este escarabajo. En la actualidad, solo se dispone de un pequeño número de modelos de insectos para estudios funcionales. Las técnicas presentadas aquí allanan el camino para que los investigadores utilicen Dermestes como sistema modelo, ampliando el alcance de los insectos susceptibles de análisis genético molecular.