Name: La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a criar Dermestes maculatus y aplicar interferencia de ARN en embriones y adultos para estudiar función génica. Este método permite analizar fenotipos embrionarios en biología del desarrollo.

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Agradecemos a los Dres. Alison Heffer y Yong Lu por configurar el aparato de microinyección y compartir su invaluable conocimiento y experiencia con el ARNi de insectos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01GM113230 a L.P.).

Los autores no tienen nada que revelar.

Si bien se han desarrollado un pequeño número de sistemas de modelos sofisticados (ratones, moscas, gusanos) durante el siglo 20, el siglo 21 ha visto una ola de nuevos sistemas de los animales que se desarrollan en los laboratorios de todo el mundo. Estos nuevos sistemas permiten a los científicos para hacer frente a cuestiones comparativos y evolutivos que no pueden ser palpados utilizando sólo los sistemas modelo &quot;estándar&quot;. Este despliegue de nuevos modelos requiere el rápido desarrol...

En 1998, Fire y Mello informaron de que el ARN de doble cadena (dsRNA) puede inducir la inhibición de la función de genes en Caenorhabditis elegans 1. Esta respuesta desencadenada por dsRNA se denomina ARN de interferencia (RNAi), y se informó como el silenciamiento de genes mediada por ARNi ser conservadas en los animales, las plantas y los hongos 2-7. En las plantas y algunos animales, las funciones de RNAi sistémica, lo que significa que el efecto se pueden propagar a otras células / tejidos en los que no se introduce directamente ARN de doble cadena (revisado en 8-10). Los científicos han hecho uso de esta respuesta ARNi celular endógeno mediante el diseño de ARN de doble cadena para apuntar genes de interés, llamando así a la baja la función de genes sin manipular directamente el genoma (revisado en 11-14). RNAi es una herramienta poderosa para los estudios funcionales debido a las siguientes ventajas. En primer lugar, incluso con un mínimo de información de la secuencia de genes, un gen puede ser objetivo utilizando RNAi. Esto es especialmente importante para studies de organismos modelo que carecen de datos genómicos o transcriptómica. En segundo lugar, en los organismos donde la respuesta RNAi es robusta sistémica, mediada por RNAi desmontables gen se puede realizar en casi cualquier etapa de desarrollo. Esta característica es muy útil para estudiar la función de genes pleiotrópicos. En tercer lugar, en algunos casos, los efectos de RNAi se propagan a las gónadas y la progenie, como que los fenotipos se observan en la descendencia 15,16. Este fenómeno, conocido como parental RNAi (pRNAi), es especialmente ventajoso para los genes que afectan el desarrollo embrionario, tan numerosos descendencia producida por un solo padre inyectado puede examinarse sin manipulación directa de los huevos. Por estas razones, pRNAi es el método de elección. Sin embargo, si pRNAi es ineficaz, por ejemplo, para los genes necesarios para la ovogénesis, entonces embrionario RNAi (eRNAi) debe ser utilizado. En cuarto lugar, RNAi puede ser utilizado para generar el equivalente de una serie alélica en que la cantidad de dsRNA entregado se puede variar en un rango para producir débil para defectos fuertes. una gradación de fenotipos Tal puede ser útil para la comprensión de la función del gen cuando el gen está implicado en un proceso complejo y / o la pérdida completa de la función es letal. En quinto lugar, la entrega de dsRNA es generalmente fácil y factible, especialmente en animales que muestran robustas respuestas RNAi sistémicos. ARN de doble cadena puede ser introducido mediante microinyección 1,5, la alimentación / ingestión 17,18, remojo, 19,20 y virus / bacterias mediada por la entrega 21,22. En sexto lugar, a diferencia de algunos métodos de focalización / edición de genes, no hay necesidad para la detección de organismos portadores de la mutación o para llevar a cabo los cruces genéticos para generar homocigotos utilizando RNAi. Por lo tanto, en comparación con muchas otras técnicas para estudiar la función de genes, RNAi es rápido, barato, y se puede aplicar para pantallas de gran escala 23-25. La amplia utilidad del ARNi proporciona medios para llevar a cabo estudios funcionales en una amplia gama de organismos, la ampliación de la gama de especies disponibles para el estudio Beyond los sistemas modelo tradicional para el que se han desarrollado herramientas genéticas. Por ejemplo, se requieren estudios que utilizan sistemas que no son modelos para dar una visión de la evolución de los genes y las redes de genes mediante la comparación de las funciones de los ortólogos de especies que representan diferentes modos de desarrollo o exhibir características morfológicas distintas 26-29. Estos tipos de estudios proporcionarán una mejor comprensión de la diversidad biológica, con repercusiones tanto para la investigación básica y aplicada. Siendo el grupo animal más grande del planeta, los insectos proporcionan una gran oportunidad para explorar los mecanismos de la diversidad subyacente. Además, los insectos son generalmente pequeños, tienen ciclos de vida cortos, alta fecundidad, y son fáciles de criar en el laboratorio. En las últimas dos décadas, el ARNi se ha aplicado con éxito en los insectos que abarca órdenes, incluyendo dípteros (moscas verdaderas) 5, Lepidoptera (mariposas y polillas) 30, coleópteros (escarabajos) 16,31, himenópteros (Sawfmentiras, avispas, hormigas y abejas) 32, hemípteros (chinches), Isoptera (termitas) 34, Blattodea (cucarachas) 35, ortópteros (grillos, saltamontes, langostas y saltamontes) 36 y Phthiraptera (piojos) 37. La aplicación exitosa de RNAi ha proporcionado datos funcionales para el estudio de los patrones en la embriogénesis temprana (eje antero-posterior 32, eje dorso-ventral 28, la segmentación 26,38), la determinación del sexo 39,40, la biosíntesis de quitina / cutícula 41, ecdisona señalización 42, el comportamiento social de 43 años, y más. Métodos de ARNi desarrollados para diferentes especies de insectos pueden ser de beneficio adicional en que es probable que sea útil para el control de plagas (revisado en 44 a 46). RNAi efectos serán de genes específicos, así como específico de la especie, siempre que las regiones no conservadas se eligen para la orientación. Para las especies de insectos beneficiosos como las abejas y gusanos de seda, dirigidos a los genes vitales para la supervivencia devirus o parásitos para controlar la infección pueden proporcionar una nueva estrategia para proteger estas especies 47,48. Dermestes maculatus (D. maculatus), nombre común ocultar escarabajo, se distribuye en todo el mundo a excepción de la Antártida. Como un insecto holometabolous, el ciclo de vida de D. maculatus incluye embrionario, larvas, pupas y adultos etapas (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus se utiliza en museos para esqueletizar animales muertos y entomólogos forenses se puede utilizar para estimar el tiempo de la muerte 49,50. D. maculatus se alimenta de productos de origen animal, incluyendo canales, carne seca, queso y las pupas / capullos de otros insectos y por lo tanto causa daño a los hogares, los alimentos almacenados, y la seda, el queso, la carne y las industrias de 51,52. La aplicación de RNAi en este escarabajo podría proporcionar una forma eficiente y respetuosa con el medio ambiente para reducir al mínimo su impacto económico. Nuestro laboratorio ha utilizado D. maculatus como un nuevo mOdel insectos para estudiar la segmentación 53. Además de ser susceptible a la cría de laboratorio, D. maculatus es de interés para la investigación básica, ya que es un desarrollador intermedio de gérmenes, por lo que es una especie útil para estudiar la transición entre el desarrollo a corto y largo germen. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> Figura 1: Ciclo de vida de D. maculatus. Las fotografías de D. maculatus en diferentes etapas de la vida, como se indica. El ciclo de vida de huevo a adulto dura tres semanas a 30 ° C, pero ya a temperaturas más bajas. (A, F), los embriones recién puestos son de color blanco a amarillo claro y ovalados, de aproximadamente 1,5 mm de longitud. Embriogénesis toma ~ 55 horas a 30 ° C. (B, C y G) Las larvas tienen rayas pigmentadas oscuras y están cubiertas de pelos. Las larvas pasan por varios estadios en función del entorno y su duración puede extenderse hasta más de 1 cm. (D, H) (E, I) Poco después de la eclosión, pigmentación oscura aparece sobre el cuerpo del escarabajo adulto. Los adultos pueden vivir hasta varios meses y una hembra puede poner cientos de embriones durante su vida. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Anteriormente, hemos demostrado que el ARNi es eficaz en el derribo de genes en función de D. maculatus 53. Aquí nuestra experiencia crianza de colonias D. maculatus en el laboratorio es compartido junto con los protocolos de paso a paso, tanto para los padres embrionario y ARNi puesta en marcha, la inyección, la atención post-inyección, y el análisis fenotípico. Los métodos de derribo y análisis de genes mediada por dsRNA introducidos aquí no sólo proporcionar información detallada para abordar cuestiones de D. maculatus, sino que también tienen importancia potencial for la aplicación de RNAi en otros no modelo escarabajo / especies de insectos.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus escarabajos vivos</td><td>Nuestro laboratorio o Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>Nuestra cepa de laboratorio fue verificada por código de barras COI; No se puede descartar la variación de la cepa</td></tr><tr><td>de Carolina Comida húmeda para gatos</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>Trozos de carne con salsa. Se puede comprar en la mayoría de las tiendas de alimentos para mascotas y comestibles</td></tr><tr><td>Comida seca para perros</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Se puede comprar en la mayoría de las tiendas de alimentos para mascotas y comestibles</td></tr><tr><td>Jaula para insectos (tamaño mediano, 30,5 x 19 x 20,3 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>Para el mantenimiento de colonias. Puede usar una jaula más grande si es necesario</td></tr><tr><td>Jaula para insectos (tamaño mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>Para la recolección de embriones</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Bola de algodón</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kit de transcripción</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>Para 40 reacciones</td></tr><tr><td>Bomba neumática</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Soporte capilar</td><td>Micromanipulador WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro negro (90&nbsp; mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Colorante alimentario (verde)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de agujas (extractor de micropipetas)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio para microscopio</td> División <td>41351157</td><td></td><td>de Ciencias de la Vida en todo el mundo</td></tr><tr><td>Película de sellado (Parafilm M)</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa modelo 801 (10&nbsp; y micro; l)</td> <td>Aguja Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>(calibre 32)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>Solución de fijación (Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Tóxico, debe manipularse en la campana extractora</td></tr><tr><td>Pinza (DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (24 x 50 mm, n.º 1,5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Punta de pipeta con microcargador</td><td>Fisher E5242956003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de disección para inyección de embriones</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de disección para la visualización del fenotipo larvario</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. Microscopía DIC V12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

la cría y el doble-stranded rna mediada gen desmontables en el hide escarabajo, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Los avances en genómica han planteado la posibilidad de sondear la biodiversidad a una escala sin precedentes. Sin embargo, la secuencia por sí sola no será informativa sin herramientas para estudiar la función de los genes. Por lo tanto, el desarrollo y el intercambio de protocolos detallados para el establecimiento de nuevos sistemas modelo en los laboratorios, y de herramientas para llevar a cabo estudios funcionales, es crucial para aprovechar el poder de la genómica. Los coleópteros (escarabajos) son el clado más grande de insectos y ocupan prácticamente todos los tipos de hábitats del planeta. Además de proporcionar modelos ideales para la investigación fundamental, los estudios de escarabajos pueden tener impactos en el control de plagas, ya que a menudo son plagas de los hogares, la agricultura y las industrias alimentarias. Se presentan protocolos detallados para la cría y mantenimiento de colonias de laboratorio de D. maculatus y para llevar a cabo interferencias mediadas por dsRNA en D. maculatus. Se describen los procedimientos de ARNi embrionarios y parentales, incluida la configuración del aparato, la preparación, la inyección y la recuperación posterior a la inyección. También se presentan métodos para analizar los fenotipos embrionarios, incluida la viabilidad, los defectos de patrón en las larvas eclosionadas y las preparaciones de la cutícula para las larvas no eclosionadas. Estos ensayos, junto con la hibridación in situ y la inmunotinción para marcadores moleculares, hacen de D. maculatus un sistema modelo accesible para la investigación básica y aplicada. Además, proporcionan información útil para establecer procedimientos en otros sistemas modelo de insectos emergentes.

Laboratorio de los autores ha utilizado la tecnología de ARNi para estudiar la evolución funcional de los genes que regulan la segmentación en los insectos 53,55. Mientras que todos los insectos son segmentados, los genes que regulan este proceso parecen haber divergido durante las radiaciones de insectos 26,38,56-63. Cribados genéticos en Drosophila identificaron un conjunto de nueve pares de reglas de segmentación de los genes que son responsables de la p...

A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

El objetivo general de este procedimiento es explorar la función génica en Dermestes maculatus, un nuevo sistema modelo de insectos, que representa el diverso clado de escarabajos y facilita el estudio de preguntas de investigación básicas y aplicadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo, la biología evolutiva y más allá, al hacer posible probar la función de los genes en embriones y adultos de Dermestes. La principal ventaja de esta técnica es que el ARN de interferencia se puede utilizar para dirigirse a cualquier gen, basándose únicamente en la información de la secuencia, incluso en ausencia de una secuencia completa del genoma.Los métodos introducidos aquí no solo proporcionan un enfoque para estudiar la función génica en Dermestes. También se pueden aplicar para desarrollar nuevos sistemas de modelos de insectos y, potencialmente, para controlar plagas de insectos. Para preparar una jaula de cría para un D. maculatus, primero extienda una capa delgada de virutas de madera en una jaula de insectos de tamaño mediano.Coloque una sección de espuma de poliestireno en la jaula para permitir que las larvas tengan un entorn

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con...

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

En este protocolo, se describen dos estrategias que simultáneamente suprimen dos genes (genes desmontables doble) en las abejas de miel. A continuación te presentamos cómo utilizar la respuesta de extensión probóscide (PER) de ensayo para estudiar el efecto de la caída de dos genes de la miel de abeja percepción gustativa.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Mientras dsRNA alimentación en C. elegans es una poderosa herramienta para evaluar la función de los genes, los protocolos actuales para pantallas de alimentación a gran escala resultan en eficiencias desmontables variables. Se describe un protocolo mejorado para realizar a gran escala pantallas de alimentación de RNAi que se traduce en caída altamente eficaz y reproducible de la expresión génica.

Derribo Gene a gran escala en<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

ARN de interferencia (RNAi) basados ​​en técnicas de genes desmontables son el núcleo de la investigación Tribolium. Aquí, ofrecemos una visión general de nuestra técnica de RNAi larval en Tribolium castaneum. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que proporciona un acceso rápido a los fenotipos de pérdida de función, lo que permite a los investigadores estudiar las funciones de genes en diversos contextos.

La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina, Tribolium castaneum

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

La interferencia de ARN es una técnica ampliamente aplicable y poderosa para manipular la expresión génica en etapas específicas del desarrollo. Aquí, describimos los pasos necesarios para implementar esta técnica en el escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus,desde la adquisición de secuencias genéticas hasta el derribo de genes que afectan la estructura o el comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

Proporcionamos un protocolo detallado para la interferencia de ARN mediado por electroporación en insectos de la orden Odonata (libélulas y damiselas) utilizando la presa de cola azul (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) y la libélula pied skimmer libélula (Pseudothe zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Método de interferencia de ARN mediado por electroporación en Odonata

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

El presente protocolo describe las pautas paso a paso para las técnicas de operación de ARNi en P. americana.

Aplicaciones de la interferencia de ARN en cucarachas americanas

Aprenda a criar Dermestes maculatus y aplicar interferencia de ARN en embriones y adultos para estudiar función génica. Este método permite analizar fenotipos embrionarios en biología del desarrollo.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

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