La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

El objetivo general de este procedimiento es identificar de forma fiable las neuronas dopaminérgicas vivas en cultivos del mesencéfalo utilizando la expresión de eGFP impulsada por la tirosina hidroxlasa, la recolección de células individuales y la generación de bibliotecas de secuenciación de ARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la enfermedad de Parkinson y la adicción a las drogas, ya que permite realizar ensayos electrofisiológicos y de expresión génica en neuronas dopaminérgicas vivas identificadas en cultivo. La ventaja de esta técnica es que proporciona un medio para identificar de manera confiable las neuronas dopaminérgicas vivas en lugar de las fijas en cultivos mesencefálicos ventrales primarios.

La primera parte del procedimiento será la encargada de demostrar la primera parte del procedimiento a cargo de Charlene Kim, una técnica del laboratorio de Henry Lester. Comience estabilizando la cabeza de un embrión de ratón con pinzas firmemente colocadas en el hocico, de modo que la superficie dorsal sea accesible. Con las pinzas sostenidas con la otra mano, pellizque la capa de piel y el cráneo justo antes de la cresta del mesencéfalo y retire la piel y el cráneo cautelosamente a lo largo de la línea media.

Coloque las pinzas alrededor de la cresta con una punta entre la corteza y el mesoncéfalo y la otra sobre el cerebelo. Pellizca y retira todo el mesencéfalo. Coloque el mesencéfalo en una placa de Petri con HBSS frío bajo un microscopio de disección.

Bajo el microscopio de disección, voltee el segmento del cerebro para que el lado ventral sea accesible. Ahora hay cuatro cuadrantes visibles. Extirpe todas las meninges y la vasculatura agarrando suavemente las meninges con fórceps y tirando hacia arriba alejándolas del cerebro.

A continuación, coloque una pinza de pinza en el ventrículo aproximadamente en el centro del segmento. Luego, para separar el mesencéfalo, haga un pellizco dorsalmente y luego pellizque medialmente a cada lado. Tome los dos cuadrantes inferiores haciendo cortes laterales en ambos lados.

El área tegmental ventral y la sustancia negra pars compacta se encuentran en la sección ventral inferior, que parece densa. Coloque el tejido disecado que contiene tanto el VTA como el SNC en HBSS fresco en un área separada de la placa de Petri. Después de diseccionar todos los segmentos del cerebro, use fórceps y un bisturí número 11 para cortar cada sección del mesencéfalo en pedazos de aproximadamente el mismo tamaño.

A continuación, utilice una punta de pipeta P1000 de diámetro ancho para transferir todos los segmentos del mesencéfalo cortados en cuartos a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de permitir que el tejido se asiente y eliminar el HBSS, agregue 500 microlitros de solución de papaína. Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de la incubación, use una punta P1000 de diámetro ancho para transferir solo los segmentos del mesencéfalo a una alícuota de un mililitro de solución de DNasa I y permita que los segmentos se asienten en el fondo del tubo. Luego, transfiera solo los segmentos del mesencéfalo a un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de solución de parada en frío. Sustituya el segundo enjuague por un mililitro de solución de parada fresca y pipetee hacia arriba y hacia abajo siete veces con una punta de pipeta P1000 para triturar las células.

A continuación, subyaca la suspensión celular pipeteando lentamente 200 microlitros de solución de BSA al 4% en el fondo del tubo. Después de la centrifugación a 280 x g durante seis minutos, aspire el sobrenadante con un P1000 y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio de siembra. Realice un recuento de células con hemocitómetro y luego diluya la suspensión celular a 1000 células por microlitro con medio de siembra.

Coloque 120 microlitros de la suspensión celular en placas de cultivo recubiertas de poli-D-lisina, poli-L-ornitina y laminina inmediatamente después de la aspiración de laminina, para garantizar que el recubrimiento no se seque y forme una superficie irregular. Luego, después de una hora de incubación, agregue cuidadosamente tres mililitros de medio de cultivo a un área sin semillas de la placa de cultivo para minimizar la interrupción de las células. Después de tres semanas de cultivo, enjuague la placa de cultivo con dos mililitros de PBS de Dulbecco sin RNasa.

Retire el DPBS. Luego reemplácelo con un mililitro de DPBS fresco para cosechar. Utilice el conjunto de filtros GFP y el objetivo 40X en un microscopio de efluorescencia invertida para identificar las neuronas fluorescentes TH positivas en los cultivos.

Utilice el micromanipulador para pipetear sobre el soma celular. A continuación, utilice un tubo de plástico conectado al puerto lateral del soporte de la micropipeta para aplicar una succión suave con el fin de aspirar la neurona en la micropipeta de vidrio. Retire inmediatamente la micropipeta que contiene la célula de la solución de baño y coloque la punta dentro de una colección de tubos de PCR de 0,2 mililitros que contenga tampón de reacción.

Rompe la punta contra el costado del tubo cerca de la parte inferior. A continuación, coloque una aguja de jeringa estéril de calibre 21 en la parte posterior de la micorpipeta y aplique presión para expulsar el líquido restante de la punta rota de la micropipeta. Centrifugar el tubo de recolección durante cinco segundos con una microcentrífuga de escritorio y luego congelarlo en hielo seco.

Mientras trabaja en la cabina de PCR con reactivos en hielo, o en un bloque de enfriamiento, prepare la primera mezcla maestra de cepa más un 10% de volumen adicional a temperatura ambiente. Y un microlitro de tres cebadores primarios, uno y un microlitro de picos de ARN cuantificados a la muestra. A continuación, incubar la muestra en el termociclador durante tres minutos a 72 grados centígrados y, a continuación, colocar las muestras directamente en la gradilla del refrigerador de PCR.

A continuación, añada 5,5 microlitros de la mezcla maestra preparada al tubo de reacción en una gradilla de enfriamiento de PCR y mezcle pipeteando suavemente. Después de centrifugar el tubo durante cinco segundos, incube en un termociclador ajustado a los parámetros que ahora se muestran en la pantalla. Para purificar el ADNc de la primera hebra, agregue 25 microlitros de perlas magnéticas a temperatura ambiente en vórtice a la muestra.

Mezcle pipeteando todo el volumen hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. A continuación, incubar a temperatura ambiente durante ocho minutos para permitir que el ADNc se una a las perlas. A continuación, coloque las muestras y las perlas magnéticas en el dispositivo de separación magnética hasta que el líquido parezca completamente transparente y no queden perlas en el sobrenadante.

Aspirar y desechar el sobrenadante. Gire la muestra durante cinco segundos para recoger el líquido del costado del tubo. Coloque las muestras en el dispositivo de separación magnética durante 30 segundos.

A continuación, retire todo el sobrenadante restante con la pipeta P10 para dejar sólo las perlas con ADN unido. Agregue 50 microlitros de la mezcla maestra de PCR ds-cDNA y luego ejecute el programa de PCR de síntesis de segunda cadena para obtener el ADNc bicatenario. Este histograma muestra el número de genes codificantes de proteínas detectados en bibliotecas de secuenciación de ARN dopaminérgico de una sola célula generadas a partir de células positivas para TH-eGFP en fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas.

Se detectaron entre 6.000 y 8.000 genes de proteínas en las bibliotecas de células individuales. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en cuatro o cinco semanas, incluyendo el tiempo para derivar las células, permitir la maduración de las células en cultivo, la recolección de células y los pasos de generación de bibliotecas, la secuenciación de las bibliotecas y el análisis preliminar. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un espacio de trabajo libre de ARNasa para la generación de bibliotecas de búsqueda de ARN y la recolección de células, para mantener técnicas estériles durante el cultivo de células y para hacer pipetas con el diámetro adecuado para la recolección de células individuales.

No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como usar una campana extractora, evitar el contacto con la piel y los ojos, mantenerse alejado del calor y las llamas abiertas, y usar la ropa de protección personal adecuada. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la expresión génica y el análisis de redes génicas, para responder a preguntas adicionales, como cómo los tratamientos farmacológicos afectan a la expresión de proteínas en las células dopaminérgicas.