Name: La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprende a identificar neuronas dopaminérgicas vivas en cultivos de mesencéfalo utilizando expresión de eGFP impulsada por tirosina hidroxilasa y secuenciación de ARN. Este método permite realizar análisis de expresión génica y electrofisiológicos en neuronas individuales para investigar la enfermedad de Parkinson.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (DA017279, AG033954, DA037743), la Fundación Michael J. Fox y la Iniciativa de Innovación de Caltech que financia el Laboratorio de Genética y Genómica Millard y Muriel Jacobs en el Instituto de Tecnología de California. Agradecemos a Brian Williams por optimizar el protocolo de biblioteca RNA-Seq y por brindar asistencia. Agradecemos a Henry Amrhein por su entrenamiento computacional. Agradecemos a Barbara J. Wold por el uso de su equipo y espacio de laboratorio. Agradecemos a Igor Antoshechkin por la secuenciación de la biblioteca y por la gestión de las instalaciones.

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<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
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<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
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<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
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<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí aislamos células individuales a partir de una población heterogénea utilizando una etiqueta fluorescente, a continuación, estudiar cada celda con una sola célula de ARN-ss. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que cosecharon y se secuenció eran neuronas dopaminérgicas de hecho, en base a la presencia de los siguientes tres transcripciones de genes relacionados con el DA, TH, DDC y SLC6A3. Todas las células TH-EGFP positivas expresaron estos tres genes según la evaluación de RNA-Seq. Esto es co...

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo incurable, relacionada con la edad. La causa de este trastorno relativamente común sigue siendo poco conocida. Hay una pérdida generalizada neuronal en todo el cerebro, con la degeneración neuronal pronunciada de las neuronas dopaminérgicas en la Substantia Nigra (SNC), que conduce a las características clínicas de diagnóstico de la bradicinesia, rigidez y temblor. cultivos mixtos primarios que contienen las neuronas dopaminérgicas SNc son especialmente relevantes para la enfermedad de Parkinson. Área tegmental ventral (VTA) neuronas dopaminérgicas se han implicado en la recompensa y la adicción. Ventral mesencefálico (VM) primarias embrionarios culturas mixtas contienen tanto las neuronas dopaminérgicas Snc y VTA (DA) y las neuronas GABAérgicas. VM cultivos primarios pueden ser útiles para los ensayos de neuroprotección y para dilucidar la vulnerabilidad selectiva de las neuronas dopaminérgicas. No hay manera confiable para identificar las células dopaminérgicas en cultivo basándose en la morfología. Élre desarrollamos técnicas para identificar y cosechar las neuronas dopaminérgicas individuales, y construir una sola célula, bibliotecas de secuenciación de ARN de alto rendimiento. Presentamos los datos de ARN del transcriptoma representativos de una sola neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Este protocolo se puede utilizar para la neuroprotección, neurodegeneración, y los ensayos farmacológicos para estudiar los efectos de diversos tratamientos sobre el transcriptoma DA / GABA. Debido a que las neuronas dopaminérgicas representan una pequeña minoría de las neuronas expresadas en cultivos primarios de VM, la capacidad de identificar de forma fiable estas neuronas en cultivos vivos permitirá una gama mejorada de los estudios de una sola célula. Estas nuevas técnicas facilitarán los avances en la comprensión de los mecanismos que tienen lugar a nivel celular y pueden tener aplicaciones en los campos de la neurociencia y la biología molecular en otro lugar.

<table><tbody><tr><td>Corporación</td><td>Bioquímica Papain Worthington &nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>Solución salina balanceada por Hanks (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Suero Equino</td><td>Donante Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Medium: Medio neurobasal</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Medios de cultivo que contienen una forma estabilizada de L-glutamina, L-alanil-L-glutamina: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>Concentración final de 0,5 mM.</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x solución madre, 1x concentración final.</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L2020</td><td>Almacenado a -20 &deg; C en 20 y micro; L alícuotas</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I (DNasa)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta azules P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri poco profunda de 10 mm</td><td>VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 y deg; C Baño</td><td></td><td></td><td></td>de agua</tr><tr><td>37 &deg; C, incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de 5% de humedad,</tr><tr><td>16% de paraformaldehído (PFA)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Equitech &nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>Solución madre al 100%, concentración final al 1%.</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas - 2x3 dientes</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas - Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Solución tamponada con fosfato (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G Aguja</td><td>BD PrecisionGlide Aguja</td><td>305167</td><td>100 agujas</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>modelo P-87</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Instrumento Sutter</td><td>&nbsp; Kit de secuenciación MP-285</td><td></td></tr><tr><td>: Kit de ARN ultra bajo SMARTer para secuenciación de Illumina Clontech</td><td></td><td>634936</td><td>100 rnxs, incl. Kit Advantage2PCR</td></tr><tr><td>oligonucleótido (12 y micro; M): Oligonucleótido SMARTer IIA (12 y micro; M)</td><td></td><td></td><td>Del kit SMARTer&nbsp;</td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa (100 unidades)</td><td>Transcriptasa</td><td></td> inversa <td>SMARTcribe Del kit SMARTer&nbsp;</td></tr><tr><td>Imprimación 1</td><td>3' Cartilla CDSIIa&nbsp;</td><td></td><td>Del SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS Imprimación</td><td></td> PCR <td>Del SMARTer Kit</td></tr><tr><td>50x 2 mezcla de polimerasa</td><td>50x Mezcla de polimerasa</td><td></td> Advantage 2 <td>Del SMARTer Kit</td></tr><tr><td>10x Tampón</td><td></td> de <td>PCR 10x Advantage 2</td><td>Del SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Picos de ARN</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Rack de enfriamiento</td> de <td>PCR IsoFreeze Rack de enfriamiento de PCR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de preparación de muestras de ADN&nbsp;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 Muestras</td></tr><tr><td>Mezcla maestra</td> de <td>PCR Nextera Mezcla maestra de PCR (NPM)</td><td></td><td>Del kit Nextera&nbsp;</td></tr><tr><td>Cóctel de cebadores PCR (PPC)&nbsp;</td><td>Cóctel de cebadores PCR Nextera (PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Del kit Nextera</td></tr><tr><td>Fluorómetro</td><td>El Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis&nbsp;</td><td>Bioanalizador Agilent 2100.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnéticas: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Toallita de ARNasa: Toallitas de ARNasa Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Tamaño 100</td></tr><tr><td>Hojas Qubit ds HS Kit de ensayo</td><td>Sondas moleculares&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 ensayos</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel: Qiaquick Kit de extracción de gel Qiagen</td><td>&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar</td> <td>de vidrio (Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm de diámetro exterior)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (o equivalente)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secuenciador</td><td>Illumina HiSeq instrumento</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT tirosina hidroxilasa-eGFP cepa de ratón&nbsp;</td><td></td><td>Número de inventario MMRRC: 000292-UNC</td><td>Stock Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat / Centro Regional de Investigación de Ratón Mutante</td></tr></tbody></table>

la identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando arn-secuenciación y promotor impulsado th expresión de egfp

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> En la enfermedad de Parkinson (PD) hay una pérdida neuronal generalizado en todo el cerebro con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas pronunciada en la SNC, que conduce a bradicinesia, rigidez y temblor. La identificación de la vida neuronas dopaminérgicas en cultivos primarios ventral mesencefálico (VM) usando un marcador fluorescente proporciona una forma alternativa para estudiar la vulnerabilidad selectiva de estas neuronas sin depender del inmunotinción de células fijadas. En este sentido, aislar, disociar, y la cultura neuronas de ratón VM durante 3 semanas. A continuación, identificar las neuronas dopaminérgicas en los cultivos utilizando eGFP fluorescencia (dirigido por un promotor tirosina hidroxilasa (TH)). Las neuronas individuales se recogen en tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidrio. A continuación, se lisan las células recogidas, y llevamos a cabo la síntesis de ADNc y &quot;tagmentation&quot; transposón mediada para producir bibliotecas de ARN-Seq sola celda 1, 2,culo = &quot;xref&quot;&gt; 3, 4, 5. Después de pasar una revisión de control de calidad, las bibliotecas de unicelulares son secuenciados y posterior análisis se lleva a cabo para medir la expresión génica. Presentamos los resultados del transcriptoma para dopaminérgica individual y neuronas GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en la neurociencia y la biología molecular.

Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón que expresa eGFP impulsado por una secuencia de promotor de la tirosina hidroxilasa, la cosecha de las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma de ARN usando ARN-seq (Figura 1). Los datos mostraron que 100% de las células TH-eGFP-positivos que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas, en base a la presencia...

En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar de forma fiable las neuronas dopaminérgicas vivas en cultivos del mesencéfalo utilizando la expresión de eGFP impulsada por la tirosina hidroxlasa, la recolección de células individuales y la generación de bibliotecas de secuenciación de ARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la enfermedad de Parkinson y la adicción a las drogas, ya que permite realizar ensayos electrofisiológicos y de expresión génica en neuronas dopaminérgicas vivas identificadas en cultivo. La ventaja de esta técnica es que proporciona un medio para identificar de manera confiable las neuronas dopaminérgicas vivas en lugar de las fijas en cultivos mesencefálicos ventrales primarios.La primera parte del procedimiento será la encargada de demostrar la primera parte del procedimiento a cargo de Charlene Kim, una técnica del laboratorio de Henry Lester. Comience estabilizando la cabeza de un embrión de ratón con pinzas firmemente colocadas en el hocico, de modo que la superficie dorsal sea accesible. Con las pinzas sostenidas con la otra mano, pellizque la capa de piel y el cráneo justo antes de la cresta del mesencéfalo y retire la piel y el cráneo cautelosamente a lo largo de la línea media.Coloque las pinzas alrededor de la cresta con una punta entre la corteza y el mesoncéfalo y la otra sobre el cerebelo. Pellizca y retira todo el mesencéfalo. Coloque el mesencéfalo en una placa de Petri con HBSS frío bajo un microscopio de disección.Bajo el microscopio de disección, voltee el segmento del cerebro para que el lado ventral sea accesible. Ahora hay cuatro cuadrantes visibles. Extirpe todas las meninges y la vasculatura agarrando suavemente las meninges con fórceps y tirando hacia arriba alejándolas del cerebro.A continuación, coloque una pinza de pinza en el ventrículo aproximadamente en el centro del segmento. Luego, para separar el mesencéfalo, haga un pellizco dorsalmente y luego pellizque medialmente a cada lado. Tome los dos cuadrantes inferiores haciendo cortes laterales en ambos lados.El área tegmental ventral y la sustancia negra pars compacta se encuentran en la sección ventral inferior, que parece densa. Coloque el tejido disecado que contiene tanto el VTA como el SNC en HBSS fresco en un área separada de la placa de Petri. Después de diseccionar todos los segmentos del cerebro, use fórceps y un bisturí número 11 para cortar cada sección del mesencéfalo en pedazos de aproximadamente el mismo tamaño.A continuación, utilice una punta de pipeta P1000 de diámetro ancho para transferir todos los segmentos del mesencéfalo cortados en cuartos a un tubo cónico de 15 mililitros. Después de permitir que el tejido se asiente y eliminar el HBSS, agregue 500 microlitros de solución de papaína. Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos.Después de la incubación, use una punta P1000 de diámetro ancho para transferir solo los segmentos del mesencéfalo a una alícuota de un mililitro de solución de DNasa I y permita que los segmentos se asienten en el fondo del tubo. Luego, transfiera solo los segmentos del mesencéfalo a un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de solución de parada en frío. Sustituya el segundo enjuague por un mililitro de solución de parada fresca y pipetee hacia arriba y hacia abajo siete veces con una punta de pipeta P1000 para triturar las células.A continuación, subyaca la suspensión celular pipeteando lentamente 200 microlitros de solución de BSA al 4% en el fondo del tubo. Después de la centrifugación a 280 x g durante seis minutos, aspire el sobrenadante con un P1000 y vuelva a suspender las células en un mililitro de medio de siembra. Realice un recuento de células con hemocitómetro y luego diluya la suspensión celular a 1000 células por microlitro con medio de siembra.Coloque 120 microlitros de la suspensión celular en placas de cultivo recubiertas de poli-D-lisina, poli-L-ornitina y laminina inmediatamente después de la aspiración de laminina, para garantizar que el recubrimiento no se seque y forme una superficie irregular. Luego, después de una hora de incubación, agregue cuidadosamente tres mililitros de medio de cultivo a un área sin semillas de la placa de cultivo para minimizar la interrupción de las células. Después de tres semanas de cultivo, enjuague la placa de cultivo con dos mililitros de PBS de Dulbecco sin RNasa.Retire el DPBS. Luego reemplácelo con un mililitro de DPBS fresco para cosechar. Utilice el conjunto de filtros GFP y el objetivo 40X en un microscopio de efluorescencia invertida para identificar las neuronas fluorescentes TH positivas en los cultivos.Utilice el micromanipulador para pipetear sobre el soma celular. A continuación, utilice un tubo de plástico conectado al puerto lateral del soporte de la micropipeta para aplicar una succión suave con el fin de aspirar la neurona en la micropipeta de vidrio. Retire inmediatamente la micropipeta que contiene la célula de la solución de baño y coloque la punta dentro de una colección de tubos de PCR de 0,2 mililitros que contenga tampón de reacción.Rompe la punta contra el costado del tubo cerca de la parte inferior. A continuación, coloque una aguja de jeringa estéril de calibre 21 en la parte posterior de la micorpipeta y aplique presión para expulsar el líquido restante de la punta rota de la micropipeta. Centrifugar el tubo de recolección durante cinco segundos con una microcentrífuga de escritorio y luego congelarlo en hielo seco.Mientras trabaja en la cabina de PCR con reactivos en hielo, o en un bloque de enfriamiento, prepare la primera mezcla maestra de cepa más un 10% de volumen adicional a temperatura ambiente. Y un microlitro de tres cebadores primarios, uno y un microlitro de picos de ARN cuantificados a la muestra. A continuación, incubar la muestra en el termociclador durante tres minutos a 72 grados centígrados y, a continuación, colocar las muestras directamente en la gradilla del refrigerador de PCR.A continuación, añada 5,5 microlitros de la mezcla maestra preparada al tubo de reacción en una gradilla de enfriamiento de PCR y mezcle pipeteando suavemente. Después de centrifugar el tubo durante cinco segundos, incube en un termociclador ajustado a los parámetros que ahora se muestran en la pantalla. Para purificar el ADNc de la primera hebra, agregue 25 microlitros de perlas magnéticas a temperatura ambiente en vórtice a la muestra.Mezcle pipeteando todo el volumen hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. A continuación, incubar a temperatura ambiente durante ocho minutos para permitir que el ADNc se una a las perlas. A continuación, coloque las muestras y las perlas magnéticas en el dispositivo de separación magnética hasta que el líquido parezca completamente transparente y no queden perlas en el sobrenadante.Aspirar y desechar el sobrenadante. Gire la muestra durante cinco segundos para recoger el líquido del costado del tubo. Coloque las muestras en el dispositivo de separación magnética durante 30 segundos.A continuación, retire todo el sobrenadante restante con la pipeta P10 para dejar sólo las perlas con ADN unido. Agregue 50 microlitros de la mezcla maestra de PCR ds-cDNA y luego ejecute el programa de PCR de síntesis de segunda cadena para obtener el ADNc bicatenario. Este histograma muestra el número de genes codificantes de proteínas detectados en bibliotecas de secuenciación de ARN dopaminérgico de una sola célula generadas a partir de células positivas para TH-eGFP en fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas.Se detectaron entre 6.000 y 8.000 genes de proteínas en las bibliotecas de células individuales. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en cuatro o cinco semanas, incluyendo el tiempo para derivar las células, permitir la maduración de las células en cultivo, la recolección de células y los pasos de generación de bibliotecas, la secuenciación de las bibliotecas y el análisis preliminar. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un espacio de trabajo libre de ARNasa para la generación de bibliotecas de búsqueda de ARN y la recolección de células, para mantener técnicas estériles durante el cultivo de células y para hacer pipetas con el diámetro adecuado para la recolección de células individuales.No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como usar una campana extractora, evitar el contacto con la piel y los ojos, mantenerse alejado del calor y las llamas abiertas, y usar la ropa de protección personal adecuada. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la expresión génica y el análisis de redes génicas, para responder a preguntas adicionales, como cómo los tratamientos farmacológicos afectan a la expresión de proteínas en las células dopaminérgicas.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Las neuronas dopaminérgicas desempeñan un papel regulador vital en el cerebro. Su pérdida se asocia con la enfermedad de Parkinson. En este vídeo, mostramos cómo generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas centrales a partir de mesencéfalo de ratón embrionario. Tales cultivos son útiles para estudiar la extrema vulnerabilidad de estas neuronas a diversos estreses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Identificación del receptor de dopamina D1-alfa en el Núcleo accumbens es fundamental para clarificar la disfunción del receptor D1 durante una enfermedad del sistema nervioso central. Se realizó un análisis para un RNA nuevo en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en un área específica del cerebro.

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

Se ha establecido un método para reactivar las células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de Drosophila cultivados. Usando este método, el papel de las señales sistémicas se puede desacoplar de las señales intrínsecas del tejido en la regulación de la inactividad, entrada y salida de las células madre neurales.

Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados

Este protocolo describe el cultivo celular de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo humano, seguido de la tinción inmunológica y la generación de perfiles fenotípicos neuronales a partir de imágenes microscópicas adquiridas de alto contenido que permiten la identificación de variaciones fenotípicas debidas a modulaciones genéticas o químicas.

Perfil fenotípico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo derivadas de células madre humanas

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Este estudio presenta un método robusto para aislar ARNm axonales utilizando inserciones de membrana porosas, permitiendo la separación total de neuronas frente a neuritas y la purificación de ARN. Combinado con RTddPCR, el enfoque permite la cuantificación absoluta de transcritos de baja copia, facilitando estudios sobre el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad, reproducibilidad y amplia aplicabilidad experimental.

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Aprende a identificar neuronas dopaminérgicas vivas en cultivos de mesencéfalo utilizando expresión de eGFP impulsada por tirosina hidroxilasa y secuenciación de ARN. Este método permite realizar análisis de expresión génica y electrofisiológicos en neuronas individuales para investigar la enfermedad de Parkinson.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP (Video) | JoVE Journal

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

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