Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios

El objetivo general de este procedimiento es demostrar métodos para estudiar la estructura y función mitocondrial en tejido vivo y fijo en el organismo modelo Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología mitocondrial. Como los mecanismos reguladores de la función mitocondrial.

La principal ventaja de esta técnica es que realiza un análisis detallado de la relación estructura/función mitocondrial. Después de clasificar cinco moscas hembras anestesiadas de acuerdo con el protocolo de texto, bajo el microscopio de disección, use dos pares de pinzas para cortar el tórax del abdomen. Luego, transfiera con cuidado los abdómenes al segundo pocillo del plato.

Usando un par de pinzas para sostener el abdomen en el extremo posterior, use el otro par de pinzas para empujar lentamente los ovarios hacia afuera. A continuación, utilice las pinzas para sujetar un ovario individual por el extremo posterior opaco y muévalo con cuidado al tercer pocillo de la placa para burlarse o fijarlo. Cepille con cuidado la vaina protectora alrededor de los ovarios, usando un par de pinzas para sujetar el extremo posterior y barriendo ligeramente una aguja de burla desde el extremo posterior hasta el extremo anterior.

Para preparar cámaras recubiertas de poliliseno, coloque dos gotas separadas de 20 microlitros de polilisene en la cubierta del vidrio de una placa de Petri con fondo de vidrio. Seque las placas al aire a 37 grados centígrados durante una hora y delinee la polilisina en la parte inferior de la placa. Configure los parámetros de escaneo en el microscopio confocal abriendo el software de adquisición de imágenes y, en la pestaña de adquisición, configure los parámetros de escaneo adecuados.

Marque las casillas de series temporales, blanqueo y regiones para abrir las pestañas individuales. A continuación, introduzca los valores de los parámetros de adquisición adecuados en cada pestaña. A continuación, coloque un ovario disecado y cardado en una región marcada recubierta de polilisina y use una aguja de burla para separar el ovario y separar los ovarios.

Coloque una gota de 10 microlitros de medio de disección de insectos sobre el ovario, asegurándose de cubrir toda el área recubierta de polilisina. Luego, cubre la placa de Petri. Inmediatamente después de montar el ovario, coloque la muestra en la platina del microscopio y utilice el ocular para localizar rápidamente el campo de interés en el tejido vivo.

Haga clic en vivo para obtener una imagen en vivo del campo de interés seleccionado y, a continuación, haga clic en Detener para detener el escaneo en vivo. Si es necesario, ajuste los parámetros de adquisición para que la señal fluorescente detectada esté por debajo de los niveles de saturación con el fondo definido según lo establecido ajustando los valores de compensación. Desde la pestaña gráfico, utilice la herramienta de dibujo Bézier para dibujar un pequeño ROI para demarcar la zona de blanqueo de fotos en la imagen adquirida por escaneo.

A continuación, realice la adquisición de imágenes, haciendo clic en iniciar experimento. Para llevar a cabo la tinción en vivo con colorantes mitocondriales fluorescentes, diluya el stock de tinciones en medio de disección tibio hasta las concentraciones finales de trabajo. Después de que la disección y la provocación se hayan demostrado anteriormente, coloque los ovarios en 200 microlitros de solución de tinción en un pocillo de una placa de disección.

Cubra el plato con una caja envuelta en papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube el pañuelo durante 10 minutos. A continuación, lave los ovarios manchados con fórceps para moverlos con cuidado a tres pocillos consecutivos que contengan medio sin mancha. Para la tinción conjunta con TMRE, en la tinción mitocondrial general compatible, primero se debe realizar la tinción con TMRE y, a continuación, sin lavar el tejido, transferir inmediatamente la muestra a la tinción mitocondrial general.

Después de lavar y montar los ovarios como se demostró anteriormente en este video, para realizar imágenes confocales en la muestra, marque la casilla de sección en Z para abrir la pestaña. Gire la rueda de enfoque hacia la parte inferior de la muestra mientras se está escaneando en vivo y haga clic en establecer primero para definir la sección Z más inferior. A continuación, mueva la rueda de enfoque en la dirección opuesta para definir la sección superior.

Realice la adquisición de imágenes haciendo clic en iniciar experimento. En el caso de la microscopía xviva en vivo, los datos deben obtenerse dentro de los 15 minutos posteriores al montaje del tejido, de lo contrario, los resultados experimentales pueden verse afectados por alteraciones de la fisiología debido a la muerte posterior del tejido. Inmediatamente después de la disección, bajo una campana extractora, coloque los ovarios en 200 microlitros de PFA fresco a temperatura ambiente en el pocillo de un plato de disección de vidrio.

Incuba el tejido durante 15 minutos para fijarlo. Después de lavar los ovarios en PBS de acuerdo con el protocolo de texto, mientras aún está en PBS, provoque los ovarios para quitar cuidadosamente la vaina de fibra protectora que puede dificultar el acceso al antígeno del anticuerpo. Permeabilice los ovarios irritados colocándolos en un tubo de microfusible con 500 microlitros de tritan al 0,5 por ciento x 100 en PBS.

A continuación, coloque el tubo en una caja cubierta y póngalo a 25 RPM durante 30 minutos. Retire el PBS/TX de acuerdo con el protocolo de texto, bloquee el tejido agregando 200 microlitros de BSA disueltos en PBS/TX al 0,5 por ciento. Incubar las muestras en el balancín a temperatura ambiente durante una hora.

Después de retirar la solución bloqueante, añadir anticuerpos antirrabiosos contra la desiclina E y anti-ATPB para ratones. Incuba el tejido en el balancín a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, use PBS-TX para lavar los ovarios tres veces durante 15 minutos cada una.

A continuación, añadir 200 microlitros de los anticuerpos secundarios adecuados y PBS-TX fresco e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar el pañuelo dos veces, agregue ganchos al tercer lavado. Luego, con una micropipeta de un mililitro, retire los ovarios inmunoteñidos del tubo de microfusión y colóquelos en un pocillo nuevo de un plato de disección de vidrio que contenga 200 microlitros de PBS.

Agregue una gota de medio de montaje a base de glicerol a un portaobjetos de vidrio y agregue los ovarios inmunoteñidos uno por uno al medio de montaje. Bajo un microscopio de disección, mientras sostiene la porción opaca del ovario con fórceps, use una aguja de burla para arrancar suavemente los ovarios transparentes de las cámaras opacas de los óvulos maduros. Luego, retire las cámaras de huevos maduros del medio de montaje.

Coloque un cubreobjetos en la corredera y presione ligeramente para asegurarse de que el medio de montaje se extienda uniformemente. Seque las muestras al aire durante 15 minutos antes de usar esmalte de uñas para sellar los bordes. Finalmente, realice la microscopía confocal según sea necesario.

Como se muestra aquí, el giro dirigido a una de las nubes mitocondriales asociadas con las células de nerse conduce a una pérdida de más del 50 por ciento de la señal fluorescente de los ROI azules y blancos que rodean el ROI rojo en 200 segundos, mientras que el ROI de control amarillo se blanquea mínimamente. Los ovarios de Drosophilla mostraron una disminución en la señal con una profundidad de tejido, y es importante discernir la profundidad máxima de tejido dentro de la cual los floróforos, como TMRE y mitostain, se pueden detectar durante la obtención de imágenes en vivo. Un análisis cualitativo de la tinción conjunta con TMRE y la tinción mitocondrial general, muestra que el germarium drisophilla exhibe un mayor potencial mitocondrial por unidad de masa en la etapa 2B.

En esta figura, el análisis semicualitativo demuestra la diferencia en el potencial mitocondrial por unidad de masa entre los AFC y los MBC analizados desde una cámara de huevos de etapa 9. Estas imágenes revelan que la absorción de mitosox se produce en las células del folículo mitótico y postmitótico de Drisophila. En este experimento, la tinción coinmunológica identifica una señal de deciclina elevada que se superpone con la señal mitocondrial de ATPB y los clones de nole DRP1 negativos para GFP en el germarium y en una cámara de huevos en etapa 9.

Los métodos descritos pueden modificarse y emplearse para estudiar la función de la estructura mitocondrial en otros tejidos de Drisophila. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar, teñir e obtener imágenes de ovarios drisófilos fijos y vivos para estudiar la estructura y función mitochonrial.