Name: Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda métodos para analizar la estructura y función mitocondrial en tejidos vivos y fijos de Drosophila melanogaster. Esta técnica permite estudiar los mecanismos reguladores de la función mitocondrial con precisión.

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Agradecemos a Leena Patel y Diamond Woodard por ayudar en la preparación del medio Drosophila y al Dr. Igor Chesnokov por proporcionar acceso al microscopio estereoscópico conectado a la cámara.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
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<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos críticos dentro del Protocolo Photobleaching: Prevención de photobleaching indebida de muestras fluorescentes es absolutamente necesario para la realización de la microscopía confocal eficiente. Por lo tanto, el tiempo utilizado para localizar muestras a través del ocular o para establecer los parámetros de adquisición de imágenes a través del modo de escaneado directo debe reducirse al mínimo para reducir al mínimo photobleaching. E...

Las mitocondrias se describen clásicamente como el centro energético celular, ya que son los principales asientos de la producción de energía en las células diferenciadas. Por otra parte, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el metabolismo, la generación de calor, la modificación de los lípidos, calcio y homeostasis redox, la orquestación de los procesos de señalización celular, etc 1. Las mitocondrias juegan también un papel activo en la inducción de muerte celular 2, así como en la regulación del ciclo celular 3. Tal multifuncionalidad plantea las siguientes cuestiones fundamentales: a) ¿cómo mitocondrias realizan todas estas funciones simultáneamente y b) hay piscinas mitocondriales específicos o subzonas que están especializados para funciones distintas? En este contexto, es importante observar que las mitocondrias multifuncionales son dinámicas en su forma, tamaño, y la estructura dentro de las células individuales y que la forma de estado estacionario de las mitocondrias pueden variar entre los tipos de células. Décadas de investigación de diversos laboratoriosoratorios sugieren que la alteración de la forma mitocondrial, tamaño y estructura, colectivamente llamados dinámica mitocondrial, es crucial para el mantenimiento de varias funciones mitocondriales 4,5,6. Estos resultados plantean la posibilidad de que las mitocondrias pueden cumplir con su multifuncionalidad en virtud de su dinamismo estructural. Extensas se están realizando esfuerzos para comprender la relación estructura-función mitocondrial. El dinamismo de la estructura mitocondrial se mantiene principalmente por su capacidad para someterse a eventos de fisión y de fusión entre sí. La fisión de grandes mitocondrias los convierte en elementos mitocondriales más pequeños, mientras que la fusión entre dos pequeñas mitocondrias y los integra en un elemento más grande mitocondrial 7. Por otra parte, la fusión transitoria de dos mitocondria puede ocurrir para permitir la mezcla de su contenido. Los sucesos de fisión y la fusión de las membranas mitocondriales interna y externa son cuidadosamente rigen por specIFIC conjuntos de proteínas. La maquinaria núcleo de fisión se compone de la proteína relacionada con dynamin-1 (Drp1), que se reclutó desde el citosol a las mitocondrias por su interacción con cierto bona proteínas mitocondriales fide (por ejemplo, fis1 o Mff1), mientras que la función Drp1 también puede ser regulada por otras proteínas en la superficie mitocondrial 4. Aunque Drp1 opera en la membrana externa, sus capacidades de fisión impacto de la membrana interna, así. La orquestación de la fisión de las membranas mitocondriales externas e internas no se entiende bien. Por otra parte, la fusión de la membrana interna se rige en el núcleo por las actividades de OPA1, mientras mitofusins gobiernan la fusión de la membrana externa 5. El resto de los eventos que contrarrestan de fisión y de fusión de mitocondrias dictan la forma mitocondrial de estado estable en una célula. Por ejemplo, la represión de la fisión mitocondrial daría lugar a una fusión completa y sin oposición, mientras que el exceso de actividad de las mitocondriasl fisión daría lugar a la fragmentación de las mitocondrias 3. El estudio de la relación estructura-función mitocondrial implica principalmente dos enfoques complementarios: a) análisis de los fenotipos celulares de Organismos y después de la manipulación genética de las proteínas de la fisión / fusión mitocondrial y b) las evaluaciones directas de la estructura y la función mitocondrial. Es digno de mención que los análisis genéticos no siempre pueden revelar la funcionalidad directa de la molécula en cuestión (en este caso, las proteínas de fisión / fusión mitocondrial), como pueden surgir los fenotipos debido a los efectos secundarios. Por lo tanto, es de suma importancia para el desarrollo y el uso de herramientas para estudiar la estructura y la función mitocondrial directamente. Cualquier evaluación de la estructura mitocondrial implica varias herramientas de microscopía. El uso de microscopía de fluorescencia de células vivas ha avanzado mucho los estudios de dinámica mitocondrial, ya que el dinamismo mitocondrial se puede monitorizar tanto cualitativa como cuantitatIVELY utilizando las herramientas y técnicas de microscopía de fluorescencia 8 apropiadas. Herramientas basadas en la microscopía de fluorescencia se han desarrollado para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los tejidos vivos melanogaster y Drosophila fijos, elucidar la importancia de dinamismo mitocondrial in vivo 9. Estos y métodos relacionados se describen aquí, con el objetivo de estudiar la estructura y la función mitocondrial en el ovario Drosophila. El ovario de Drosophila consiste en la línea germinal y somática linajes, que surgen de sus respectivas células madre adultas que residen en el germarium 10,11. Dieciséis células germinales sincitial (GCS) quedan encapsulados por las células del folículo somáticas (FCS) para formar cámaras de huevos individuales que emergen de la germarium (Figura 1). Uno de los 16 GC se confirmen a convertirse en un ovocito, y los restantes 15 GC se desarrollan en células enfermeras que apoyan el crecimiento de la cámara de ovocitos, Facilitando la maduración del huevo antes de que sea puesto a nadie. La mayoría de las FCs se someten a 9 rondas de divisiones mitóticas antes de que salgan del ciclo celular mitótico para diferenciar terminales en una capa de células epiteliales modelado que consiste en células anterior del folículo (AFCS), las células del folículo posterior (PFC), y las células del cuerpo principal (MBC) . Las cámaras de huevos consecutivos están conectados por las células tallo, que son las células que también se derivan de los bloques FC temprano en el desarrollo diferenciados. Mitocondrial forma regulada por la proteína mitocondrial Drp1 fisión participa activamente en el proceso de diferenciación durante el desarrollo normal de la capa de FC ovario de Drosophila 9,12. Aquí se describen los métodos usados en estos estudios para identificar la participación de Drp1 en el desarrollo de la capa de células del folículo Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Medios de Grace (medio de disección de insectos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehído AQ</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (tinción mitocondrial general)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstituir y Alícuota</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina éster etílico perclorato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstituir y Alícuota</td></tr><tr><td>MitoSox (tinción de Mito-Ros)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstituir y Alícuota</td></tr><tr><td>PoliLisina</td><td>MP Biomédica</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Viales para moscas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Moscas cónicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Vial para moscas</td><td>Lugs Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Láminas cónicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Alimento para Drosophila (Alimento para Drosophila)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo ciclina E (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo ATPB [3D5] - Marcador mitocondrial</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Portaobjetos de</td> <td>microscopioFisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cubierta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp; Fondo de vidrio Mircrowell Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Levadura seca activa</td><td></td> Microscopio confocal <td>Fisher Scientific</td> ICN10140001 <td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Soporte de pasadores niquelado Fine</td><td>Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins Fine</td><td>Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de cerbatana</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis</td> Código <td>abierto</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Microscopio Macro Zoom</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Cámara digital refrigerada, 12 bits, monocromo;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudiar mitocondrial estructura y función en drosophila los ovarios

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

El análisis de la relación estructura-función mitocondrial es necesario para una comprensión profunda de los mecanismos reguladores de la funcionalidad mitocondrial. La microscopía de fluorescencia es una herramienta indispensable para la evaluación directa de la estructura y función mitocondrial en células vivas y para estudiar la relación estructura-función mitocondrial, que está modulada principalmente por las moléculas que gobiernan los eventos de fisión y fusión entre mitocondrias. Este artículo describe y demuestra métodos específicos para estudiar la estructura y función mitocondrial en tejido vivo y fijo en el organismo modelo Drosophila melanogaster. El tejido de elección aquí es el ovario de Drosophila, que puede aislarse y hacerse susceptible para la microscopía confocal en vivo ex vivo. Además, el artículo describe cómo manipular genéticamente la proteína de fisión mitocondrial, Drp1, en ovarios de Drosophila para estudiar la participación de la fisión mitocondrial impulsada por Drp1 en la modulación de la relación estructura-función mitocondrial. El amplio uso de estos métodos se demuestra tanto en los datos ya publicados como en los nuevos. Los métodos descritos pueden ampliarse aún más hacia la comprensión del impacto directo de los nutrientes y/o factores de crecimiento en las propiedades mitocondriales ex vivo. Dado que la desregulación mitocondrial subyace a la etiología de diversas enfermedades, se prevé que los métodos innovadores descritos desarrollados en un organismo modelo genéticamente tratable, Drosophila, contribuyan significativamente a la comprensión de los detalles mecanicistas de la relación estructura-función mitocondrial y al desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a las mitocondrias.

Los métodos descritos se pueden utilizar para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los ovarios de Drosophila vivas y fijos (Figura 2B). Se proporcionan algunos ejemplos de los resultados anticipados obtenidos con los métodos descritos. Disección del ovario Drosophila: Cuando diseccionado adicional, los abdómenes cortadas (Figura 3B) de la totalidad d...

El análisis de la relación estructura-función mitocondrial es necesario para una comprensión profunda de los mecanismos reguladores de la funcionalidad mitocondrial. En este trabajo se describen y demuestran métodos específicos para estudiar la estructura y función mitocondrial en ovarios vivos y fijos de Drosophila.

Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar métodos para estudiar la estructura y función mitocondrial en tejido vivo y fijo en el organismo modelo Drosophila melanogaster. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología mitocondrial. Como los mecanismos reguladores de la función mitocondrial.La principal ventaja de esta técnica es que realiza un análisis detallado de la relación estructura/función mitocondrial. Después de clasificar cinco moscas hembras anestesiadas de acuerdo con el protocolo de texto, bajo el microscopio de disección, use dos pares de pinzas para cortar el tórax del abdomen. Luego, transfiera con cuidado los abdómenes al segundo pocillo del plato.Usando un par de pinzas para sostener el abdomen en el extremo posterior, use el otro par de pinzas para empujar lentamente los ovarios hacia afuera. A continuación, utilice las pinzas para sujetar un ovario individual por el extremo posterior opaco y muévalo con cuidado al tercer pocillo de la placa para burlarse o fijarlo. Cepille con cuidado la vaina protectora alrededor de los ovarios, usando un par de pinzas para sujetar el extremo posterior y barriendo ligeramente una agu

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Investigación

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Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en...

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

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El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

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Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

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In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

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3D ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila revelado por tomografía electrónica serie-sección

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Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios

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