Protocolo Experimental para la detección de Las cianobacterias En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

El objetivo general de este procedimiento es determinar la presencia de múltiples cepas de cianobacterias en muestras líquidas y sólidas mediante un inmunoensayo de microarrays de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del medio ambiente, el monitoreo y la gestión del agua, como la presencia de toxinas producidas por bacterias productoras de protoxinas antes de que las floraciones se hagan visibles a simple vista. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden monitorizar simultáneamente múltiples cepas de cianobacterias y múltiples muestras en un periodo de tres o cuatro horas, tanto in situ como en el laboratorio.

Por lo tanto, estos métodos pueden proporcionar información sobre la biodiversidad. También se puede aplicar a otros campos, como la monitorización de instalaciones agrícolas, la detección de vida en entornos de tensión o la exploración planetaria. Por lo general, las personas nuevas en este método no tendrán dificultades.

Debido a la simplicidad en el procesamiento de la muestra y a la facilidad de interpretación de los resultados. Después de producir y purificar anticuerpos de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 100 microlitros de DMSO en un vial comercial que contenga colorante para etiquetar, un miligramo de proteína. Una vez que el tinte se haya disuelto, etiquete los anticuerpos purificados agregando dos microlitros del tinte a 50 microlitros de cada preparación de anticuerpos.

Mantenga las reacciones de etiquetado a temperatura ambiente bajo agitación continua en una plataforma vibratoria durante una hora. Después de purificar los anticuerpos marcados de acuerdo con el protocolo de texto, cargue una pequeña alícuota en un espectrofotómetro y mida la absorbancia a 280 y 650 nanómetros. Calcule la eficiencia del etiquetado siguiendo las recomendaciones del proveedor.

Para hacer un CYANOCHIP, prepare 30 microlitros de cada anticuerpo purificado mezclando un miligramo por mililitro de anticuerpo en un tampón de impresión de proteínas 1X con 01% de volumen por volumen de Tween 20. Prepare 30 microlitros de las siguientes soluciones de impresión como controles. 1X tampón de impresión de proteínas con 01% de volumen por volumen de Tween 20.

Cada proteína A purifica suero preinmune a un miligramo por mililitro en tampón de impresión de proteínas 1X con 01%Tween 20 y un millgramo por mililitro de BSA y 1X tampón de impresión de proteínas con 01%Tween 20. Añada 30 microlitros por pocillo de las soluciones de impresión preparadas a las microplacas de 384 pocillos de alta calidad. Después de configurar el robot de impresión y los sustratos de portaobjetos de acuerdo con el protocolo de texto, localice todos los anticuerpos y los controles en las diapositivas en un patrón de puntos triplicado de aproximadamente 180 a 200 micras de diámetro de punto.

Para el muestreo en el medio ambiente, use una jeringa estéril para recolectar de uno a 100 mililitros de líquidos y concentre las células pasando la muestra a través de un filtro de tamaño de poro de tres micras. Si es necesario, recoja muestras sólidas de rocas o suelos y guárdelas en tubos estériles. Las muestras se pueden analizar en un pequeño laboratorio de campo.

Agregue un mililitro de tampón de incubación de extracción para recuperar la biomasa recolectada en el filtro y use un espatular para raspar el filtro en un tubo de 15 mililitros. Con un procesador ultrasónico portátil, o pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, se agrega y homogeneiza la muestra. Además, pese hasta 0,5 gramos de la muestra sólida en un tubo separado de 10 mililitros y agregue hasta dos mililitros de tampón de extracción.

Sumerja una sonda sonicadora en el tubo y sonique con un procesador ultrasónico portátil u otro dispositivo de ultrasonidos. Mientras mantiene la muestra en hielo, realice al menos cinco ciclos de 30 segundos a 30 kilohercios, deteniéndose durante 30 segundos entre sonicaciones. Para preparar un extracto filtrado para el inmunoensayo, use una jeringa de 10 mililitros acoplada a un soporte de filtro de nailon de cinco a 20 micras del tamaño de un poro para filtrar la solución en un tubo de 1,5 mililitros para eliminar la arena, la arcilla y otros materiales gruesos.

Con los puntos de microarray hacia abajo, coloque el portaobjetos sobre una gota de 100 a 200 microlitros de solución de bloqueo e incube durante tres a cinco minutos. Con pinzas con punta de plástico y evitando las zonas de microarrays, recoja con cuidado el portaobjetos. Sumerja el portaobjetos en una solución de bloqueo nueva e incube el portaobjetos con una agitación leve durante 30 minutos.

Para secar el portaobjetos, colóquelo en una centrífuga adaptada para portaobjetos de microscopio y gírelo brevemente. Coloque el portaobjetos en un casete de hibridación de microarrays de tres por ocho pocillos siguiendo las instrucciones del proveedor. Alternativamente, después de modificar el patrón de impresión de anticuerpos, configure un casete hecho a medida, como el que se muestra aquí, o simplemente use portaobjetos de cubierta para la configuración.

Después del ensamblaje del portaobjetos y el casete, pipetee hasta 50 microlitros de cada extracto de muestra o diluya el mismo en tampón de incubación de extracción en cada pocillo del casete. Alternativamente, cargue las muestras en otros dispositivos de incubación o simplemente use portaobjetos de cubierta. Como control en blanco, pipetee 50 microlitros de tampón TBSTRR en al menos dos pocillos separados del casete.

Incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora y mezclar pipeteando cada 15 minutos, o incubar a cuatro grados centígrados durante 12 horas. Para lavar los microarrays, coloque el casete y golpéelo con cuidado sobre papel absorbente limpio. A continuación, lave los pocillos añadiendo 150 microlitros de tampón de incubación de extracción a cada uno y retire el tampón golpeando el papel absorbente como antes.

Repite el lavado tres veces más. A cada pocillo, agregue 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos fluorescentes que contiene los 17 anticuerpos de la cepa anticianobacteriana. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora o a cuatro grados centígrados durante 12 horas.

Para lavar los microarrays, coloque con cuidado el casete y golpéelo suavemente sobre papel absorbente limpio. A continuación, añada 150 microlitros de tampón de incubación de extracción antes de retirarlo dando golpecitos sobre una toalla de papel. Repite el lavado tres veces.

A continuación, desmonte el casete y sumerja la corredera en una solución PBS 0.1X para un enjuague rápido. Centrifugar rápidamente como antes para secar el portaobjetos. Con un escáner fluorescente, escanee el portaobjetos en busca de fluorescencia en el pico máximo de emisión para el tinte fluorescente rojo lejano.

Tome varias imágenes de los microarrays con diferentes parámetros de escaneo cambiando el valor de ganancia. Finalmente, cargue la cuadrícula, cuantifique, luego procese y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. El inmunoensayo múltiple CYANOCHIP que se muestra en este video se utilizó para probar la identificación simultánea de las especies de cianobacterias de agua dulce más relevantes que se enumeran en esta tabla.

Las muestras de agua recolectadas en la orilla de un reservorio de agua dulce se analizaron mediante el ensayo de microarrays. Las principales reacciones inmunológicas positivas correspondieron a anticuerpos contra las especies planctónicas de cianobacterias microcystis y contra las especies bentónicas de leptolyngbya. Se obtuvieron señales fluorescentes más bajas para las especies planctónicas nostocales aphanizomenon, anabaena, microcystis flos-aquae y las especies bentónicas rivularias.

El microarray también se validó mediante el ensayo de una alfombra microbiana seca antártica para probar la presencia de marcadores de cianobacterias. Se produjeron reacciones positivas en los anticuerpos contra las cianobacterias bentónicas, las especies de anabaena y las especies de leptolyngbya. Se detectaron reacciones inmunológicas positivas adicionales con anticuerpos contra cianobacterias planctónicas, como especies de Microcystis, especies de Aphanizomenon y especies de Planktothrix rubescens.

Finalmente, esas señales se obtuvieron de anticuerpos contra otras especies bentónicas, incluidas las especies de tolypothrix y las especies de anabaena. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas, si se realiza correctamente, excluyendo la producción y nivelación de anticuerpos. Mediante la incubación simultánea de la muestra y los anticuerpos fluorescentes, se puede ahorrar una hora.

Al intentar estos procedimientos, es importante recordar que debe preparar la mezcla de anticuerpos fluorescentes con su anticuerpo en su dilución de trabajo óptima. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía óptica o la extracción de ADN y una amplificación específica por PCR, para responder a preguntas adicionales, como la concentración del suelo o para confirmar el tipo de cepa detectada. Tras su desarrollo, esta técnica abrirá el camino para que los investigadores en el campo de la monitorización ambiental exploren los cuerpos de agua, en procesos de bicultivo, gestión de agua dulce o estudios de ecología microbiana, independientemente del tipo de muestra.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo marcar anticuerpos con fluorescencia, manipular micromatrices de anticuerpos, realizar inmunoensayos multiplex y analizar e interpretar los resultados de inmunoensayos de microarrays. No olvide que trabajar con ultrasonidos puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de dispositivos de protección auditiva u otras medidas de cuidado específicas al realizar estos procedimientos.