Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

Este protocolo fue publicado originalmente por el Dr. Gary Bunker y sus colegas, y permite el cultivo de neuronas hipocampales embrionarias con alta densidad y gran pureza, suspendiendo las neuronas sobre una capa de células gliales. Este resultado es fundamental para nuestros otros resultados cruciales del hipocampo, ya que permite que las neuronas crezcan a bajas densidades con pocas células gliales contaminantes. Por lo tanto, este cultivo es ideal para imágenes de alta resolución y análisis funcional de la tipografía y neuronas maduras en cultivo.

La post-maduración de este protocolo debería acelerar la adaptación por parte de nuevos investigadores, ya que existen varios estados clave durante el procedimiento que son difíciles de describir, por lo que este los guía paso a paso. Este protocolo consta de tres poblaciones independientes necesarias para el cultivo de neuronas primarias de alta calidad. Estos procesos incluyen el cultivo de células gliales, la creación y recubrimiento de laminillas, y la preparación de células nerviosas del hipocampo.

Para comenzar, se debe obtener tejido cortical de rata posnatal temprano según se describe en el protocolo escrito. Aunque no se muestra directamente aquí, tenga en cuenta que el paso de disección mostrado más adelante en este protocolo es casi idéntico a los utilizados para la disección cortical. Por esta razón, se destacarán los pasos relevantes durante el procedimiento de disección hipocampal que se muestra más adelante en este video.

A partir del Paso Seis del protocolo escrito, retire el HBSS del tejido cortical recolectado y luego pique el tejido lo más finamente posible utilizando tijeras. Añada suficiente HBSS al tejido picado para transferir los fragmentos de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros, y luego complete el volumen hasta 12 mililitros añadiendo HBSS. Añada 1,5 mililitros de tripsina al 2,5 % y 1,5 mililitros de solución de ADNasa a 10 miligramos por mililitro, invierta para mezclar y luego incube la mezcla resultante en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 12 minutos.

Triture el tejido de 10 a 15 veces utilizando una pipeta de Pasteur de vidrio y luego incúbelo en el baño de agua durante otros tres minutos. Asegúrese de que todos los fragmentos de tejido se hayan sedimentado en el fondo del tubo, luego filtre el sobrenadante hacia un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 5 mililitros de BGS. Añada 13,5 mililitros de HBSS y 1,5 mililitros de 2.5&trypsin al tubo que contiene los fragmentos restantes de tejido no digerido, inviértalo para mezclar y luego incúbelo en el baño de agua durante 10 minutos adicionales.

Después de la incubación, triture el tejido remanente de 10 a 15 veces y luego filtre en el tubo que contiene el filtrado inicial. A continuación, enjuague el filtro haciendo pasar a través de él 3 mililitros adicionales de BGS. En este punto, el filtrado puede dividirse en varios tubos para facilitar tanto el equilibrio como la resuspensión del sedimento celular.

Centrifugar las suspensiones durante seis minutos a 130 G. Después de la centrifugación, observar que el fondo del sedimento presenta un aspecto ligeramente rojizo, debido a la presencia de componentes sanguíneos. Eliminar los sobrenadantes, luego agregar 1 mililitro de medio glial a cada tubo, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Transferir las porciones de cada sedimento que no presenten este aspecto rojizo a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros.

Añada hasta 2 mililitros de medio glial por cría para re-suspender el tejido combinado, y transfiera cada 2 mililitros de la suspensión a 18 mililitros de medio glial precalentado en un frasco de cultivo de 75 centímetros cuadrados. Incube el frasco en un incubador a 37 grados Celsius, 5%CO2. Al día siguiente de sembrar las células, cambie el medio en cada frasco por medio glial fresco.

Téngase en cuenta que en este momento, el cultivo será una mezcla de astrocitos y otros tipos celulares no deseados. Para eliminar los tipos celulares no astrocíticos, los frascos deben agitarse con fuerza aproximadamente cuatro días después de sembrarlos. Para ello, enjuague los frascos con HBSS, luego añada 10 mililitros de HBSS fresco a cada frasco y agítelos vigorosamente de cinco a diez veces.

Aspire el HBSS y enjuague dos veces más con HBSS. A continuación, agregue 20 mililitros de medio glial y devuelva los frascos al incubador como antes. Tenga en cuenta que, aunque este procedimiento es enérgico, los astrocitos deseados para el cultivo permanecerán fuertemente adheridos a la superficie del frasco.

Para mantener los cultivos de astrocitos, cambie el medio a medio glial fresco dos veces por semana hasta que sean confluentes. Una vez confluentes, las células pueden congelarse para su uso futuro según se describe en el protocolo escrito. Las células gliales deben sembrarse en placas al menos 14 días antes de iniciar el cultivo de neuronas, como se describe en el protocolo escrito.

Sumerja las laminillas en ácido nítrico concentrado y sométalas a sonicación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tenga cuidado, ya que el ácido nítrico concentrado es extremadamente corrosivo. Tenga en cuenta también que algunos laboratorios prefieren remojar las laminillas en ácido nítrico durante la noche utilizando rejillas de cerámica para tinción.

Deseche cuidadosamente el ácido nítrico en la campana extractora de gases según las directrices institucionales, luego enjuague las laminillas tres veces con agua desionizada. Sumerja las laminillas en agua y sométalas nuevamente a ultrasonido durante 30 minutos. A continuación, retire el agua y enjuague las laminillas otras tres veces.

Sumerja los cubreobjetos en 50 mililitros de agua y luego autoclávelos. En una cabina de flujo laminar estéril, retire el agua y agregue de 20 a 30 mililitros de etanol para enjuagar. Añada otros de 20 a 30 mililitros de etanol y luego transfiera los cubreobjetos y el etanol a una placa de Petri de 100 milímetros.

Utilizando pinzas romas, transfiera las laminillas de color a placas de Petri de 60 mililitros, cuatro a cinco por placa, y luego déjelas secar al aire colocando las laminillas inclinadas contra el borde de la placa. Una vez que el etanol haya evaporado, regrese las laminillas a posición horizontal. Derrita 10 gramos de parafina en un frasco de vidrio resistente al calor y manténgala a una temperatura de aproximadamente 150 a 200 grados Celsius.

La temperatura ideal puede requerir algunos ajustes, y temperaturas incorrectas pueden dificultar la producción de pies de parafina del tamaño adecuado. Sumerja una pipeta de Pasteur en la parafina y luego toque rápidamente tres puntos cercanos al borde de cada cubreobjetos. Las gotas de parafina se solidificarán formando perlas de aproximadamente 3 a 5 milímetros de altura y de 1 a 2 milímetros de diámetro, y servirán para crear un espacio entre las neuronas en el cubreobjetos y la capa mono de células gliales debajo.

Obtenga placas que contengan cubreobjetos previamente preparados con pies de parafina. Añada 200 microlitros de poli-l-lisina y tampón borato a la superficie de cada cubreobjeto, y deje que la solución repose sobre los cubreobjetos durante la noche, cubiertos a temperatura ambiente. La superficie que se recubrirá debe ser la misma en la que se encuentran las perlas de parafina.

Si se limpia adecuadamente, el poli-l-lisina debería extenderse fácilmente para cubrir la superficie del cubreobjetos. A la mañana siguiente, lave los cubreobjetos dos veces sumergiéndolos en agua estéril durante dos horas cada vez. Después del lavado final, reemplace el agua con 4 mililitros de medio de siembra por placa.

Tenga en cuenta que es importante que la superficie de las laminillas no se seque después de haber sido recubiertas con poli-l-lisina. Coloque las placas con las laminillas en un incubador a 37 grados Celsius. Las laminillas recubiertas deben incubarse durante al menos 24 horas antes de iniciar el cultivo de neuronas.

Obtenga una rata preñada de día embrionario 18 o 19 y eutanásiala mediante un método aprobado. Rocíe la parte inferior de la rata con etanol al 70 %, luego realice una incisión media desde la región púbica hasta el final de la cavidad abdominal. Para evitar contaminación, tenga cuidado de cortar solo a través de la piel en este paso.

Sterilice los instrumentos de disección utilizando etanol al 70 %, luego corte la pared abdominal para exponer el útero. Retire los dos cuernos uterinos y colóquelos en un recipiente estéril. En una cabina de flujo laminar estéril, elimine las membranas uterinas que rodean los fetos, seguidamente separe las cabezas y colóquelas en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 20 mililitros de HBSS.

Extraiga los cerebros e inmediatamente colóquelos en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga 2 mililitros de HBSS sobre hielo. Recolecte solo dos o tres cerebros por placa para permitir espacio suficiente para el siguiente paso. Bajo un microscopio estereoscópico, retire las meninges desde la línea media de los hemisferios cerebrales.

A continuación, diseccionar los hipocampos. Tenga en cuenta que el hipocampo puede distinguirse como una estructura con forma de media luna en la superficie medial del hemisferio cortical, y es fácil de extraer ya que está limitado lateralmente por un ventrículo. Una vez liberado, colocar los hipocampos en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga 4,5 mililitros de HBSS y mantenerlos sobre hielo.

Téngase en cuenta que los pasos realizados hasta este momento también son válidos para la disección cortical, excepto en que se conservan las cortezas en lugar de los hipocampos. Para la disección cortical, el siguiente paso sería separar la corteza del resto del cerebro, como se muestra aquí, y luego recolectar las cortezas y el HBSS como se indicó anteriormente. Una vez que todo el tejido hipocampal haya sido recolectado en HBSS, transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros.

Añada 5 mililitros de tripsina al 2,5 %, luego incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Retire suavemente la solución de tripsina mediante pipeta de Pasteur, dejando el tejido hipocampal intacto en el fondo del tubo. Lave el tejido dos veces añadiendo suavemente 5 mililitros de HBSS, incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos y luego retírelo nuevamente mediante pipeta de Pasteur, asegurándose de no perturbar el tejido en el fondo.

Mientras espera el paso de incubación mostrado anteriormente, prepare dos variantes de pipetas pulidas con llama para la disociación del tejido. Para ello, exponga brevemente la punta de la pipeta Pasteur de vidrio a una llama y luego examine la punta de la pipeta. Para la primera variante, repita este paso hasta que los bordes de la punta de la pipeta queden suavizados, pero el diámetro permanezca sin cambios.

Para el segundo, repita hasta que los bordes estén suavizados y el diámetro de la punta se haya reducido aproximadamente a la mitad. Es importante practicar para encontrar el diámetro ideal que asegure que el tejido se disocie y produzca células individuales sin dañar estas células en el proceso. Después del segundo lavado, aforar el volumen total a 5 mililitros añadiendo un volumen suficiente de HBSS al tejido.

Homogenice el tejido del hipocampo primero con aproximadamente 10 pasadas a través de la pipeta normal de bordes lisos, y luego con cinco a 10 pasadas adicionales a través de la pipeta de diámetro de punta reducido. El objetivo aquí es obtener una solución homogénea de células sin grumos de tejido, o con muy pocos. Determine la densidad celular utilizando un hemocitómetro.

Los rendimientos típicos son de aproximadamente 800.000 a un millón de células por cría. Transfiera un volumen suficiente de la suspensión celular a placas que contengan cubreobjetos recubiertos con poli-l-lisina en 4 mililitros de medio de siembra, para obtener una densidad de siembra entre 100.000 y 500.000 células por placa de 60 milímetros, según el experimento previsto. Coloque las placas en un incubador a 37 grados Celsius con 5 % de CO₂.

Después de tres o cuatro horas, transfiera las laminillas con neuronas adheridas a placas que contengan células gliales y medio NBG. Esto debe hacerse de manera que el lado en el que se sembraron las neuronas quede orientado hacia abajo, en dirección a la capa de células gliales. Añada un total de cuatro o cinco laminillas por placa de glia.

Dos o tres días después de sembrar, agregue la solución de aerocele a una concentración final de cinco micromoles por placa para detener el crecimiento de las células gliales. Alimente las células una vez por semana reemplazando 2 mililitros del medio viejo con 2,5 mililitros de medio fresco en cada alimentación. El medio adicional agregado tiene como finalidad compensar la evaporación a lo largo del tiempo.

Y solo se cambia una porción del medio para garantizar un acondicionamiento consistente del medio por parte de las células gliales. Estos cultivos suelen mantenerse sanos durante al menos un mes. Las neuronas se fijaron con paraformaldehído al 4%, luego se incubaron con anticuerpos primarios para la imagen de fluorescencia.

Como se observa en las tinciones inmunoquímicas para Tau y MAP2, estas neuronas desarrollan una extensa arborización con axones y dendritas bien desarrollados. Las neuronas maduras también desarrollan espinas sinápticas identificadas mediante la localización selectiva de Drebrin One, que se oponen estrechamente a especializaciones pre-sinápticas identificadas mediante inmunotinción para sinapsina. Estas neuronas primarias son adecuadas para estudios funcionales y estructurales de neuronas y sinapsis, incluyendo estudios de transducción de señales, polaridad neuronal, tráfico subcelular, y desarrollo y plasticidad sináptica, entre otros.

Este video debe ayudar a comprender y ejecutar con precisión varios pasos clave de este protocolo. El cumplimiento adecuado del método descrito debe dar como resultado una cultura de neuronas sanas, de alta densidad, con arborización extensa y sinapsis bien desarrolladas morfológica y funcionalmente.