Name: Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
Description: Aprende a cultivar neuronas primarias de hipocampo a baja densidad sobre monocapa glial. Este método permite obtener cultivos de alta pureza ideales para imágenes de alta resolución y ensayos funcionales de neuronas maduras.

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Todos los experimentos y protocolos que utilizan animales de laboratorio fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Manitoba y se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. 1. Preparación de instrumentos, tampones y soluciones <ol><li> Esterilizar en autoclave todos los equipos de la disección, pipetas Pasteur de vidrio, puntas de pipeta, aparato de filtro, y agua desionizada. </li><li> Preparar un 20% (w / v; 1,1 M) solución madre de glucosa en agua desionizada y se filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar una solución de piruvato de sodio 100 mM en agua desionizada y el filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar solución salina equilibrada de calcio y de magnesio libre Hank (CMF-HBSS) haciendo una solución de 10% HBSS (10x), HEPES 10 mM, y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina en agua desionizada. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. </li><li> Preparar 10 mg / ml de desoxirribonucleasa I (ADNasa) en CMF-HBSS,y luego filtrar-esterilizar y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar medio glial haciendo una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), 95 U / ml de penicilina-estreptomicina, y 10-15% de suero de crecimiento bovina (BGS) en medio esencial mínimo (MEM). NOTA: Como se indica en el protocolo, una solución de 5% BGS se puede utilizar si es necesario para frenar la proliferación celular. Suero de Caballo se puede utilizar en lugar de BGS, pero tenga en cuenta que cada lote debe ser probado antes de su uso debido a la variación inter-lote. Almacenar la solución preparada a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. Aunque muchos laboratorios utilizan FBS, se observó consistentemente que el crecimiento glial en BGS es tan robusto como en FBS. BGS se deriva de suero de ternera fetal que se complementa con componentes químicamente definidos. Además, BGS es sustancialmente más económico que FBS. </li><li> Preparar el crecimiento de neuronas y medio de mantenimiento (neurobasal-B27, NBG) haciendo una solución de 1x B27 suplemento y 0,5 mM de L-glutamina en 500 ml de Neurobasal Medium. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. L-glutamina puede estar sustituido con GlutaMAX, que ha sido sugerido para ser más estable en el medio de crecimiento. </li><li> Preparar la neurona medio de siembra al hacer una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), piruvato de sodio 1 mM (a partir de la solución estéril), y 10% BGS en MEM. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. </li><li> Preparar una solución de citarabina 1 mM (Ara-C) y el filtro a esterilizar. Alícuota en porciones de 1 ml y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar una solución de mM APV 100 en NaOH esterilizada-filtro de 100 mN. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Disolver 1 mg / ml de poli-L-lisina en tampón de borato, pH 8,5 (50 mM de ácido bórico y bórax 12 mM) y el filtro a esterilizar. Alícuota y almacenar a -20 ° C. En lugar de poli-L-lisina, se puede usar poli-L-ornitina que puede ser menos tóxico para las células. </li></ol> 2. Glia Cultura Preparación <ol><li> Preparar cultivo celular astroglia cortical <ol><li&gt; Obtener crías de rata dentro de las 24 horas siguientes al nacimiento. Coloque los cachorros en el hielo para anestesiar a ellos. </li><li> Pulverizar las crías con 70% de etanol y decapitar a ellos. </li><li> Colocar las cabezas en un plato de 100 mm en el hielo que contiene 15 ml CMF-HBSS. </li><li> Diseccionar cada cerebro cortando el cuero cabelludo, abrir el cráneo, cortando el tronco cerebral, y luego transferir el cerebro a 60 mm placas de Petri en el hielo que contenía 3 ml CMF-HBSS. </li><li> Separar los hemisferios cerebrales del hipocampo y luego tira lejos las meninges que rodean ellos. Ejercer precaución adecuada para asegurar la contaminación mínima a partir de fibroblastos meníngeos. fibroblastos meníngeos en la cultura puede competir con la glía para el crecimiento y ser perjudiciales para la salud de las neuronas. Recoge todas las hemisferios cerebrales en un 60 mm placa de Petri en el hielo que contiene 5 ml CMF-HBSS. </li><li> Eliminar la CMF-HBSS y luego picar el tejido cortical recogido tan finamente como sea posible usando resorte-tijeras-micro disección. </li><li> Añadir suficiente CMF-HBSS para la chuletatejido ped. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir las piezas de tejido a un tubo de 15 ml. Llevar el volumen total a 12 ml mediante la adición de CMF-HBSS. </li><li> Añadir 1,5 ml de cada uno de 2,5% de tripsina y 10 mg / ml de solución de DNasa. Incubar la mezcla resultante a 37 ° C en un baño de agua durante 12 min. </li><li> Se tritura el tejido 10-15 veces usando una pipeta Pasteur de vidrio, y más en incubar en un baño de agua a 37 ° durante 3 min. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de papel de la lente o de una malla de filtro en un tubo de 50 ml que contenía 5 ml de BGS. Esto se hace para eliminar trozos de tejido no disociado. Alternativamente, utilizar tamices de células disponibles comercialmente. </li><li> Añadir 13,5 ml de CMF-HBSS y 1,5 ml de 2,5% de tripsina al tubo que contiene las piezas de tejido restantes y además incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 10 min adicionales. </li><li> Se tritura el tejido restante una vez más, y luego filtrar la suspensión de nuevo en el tubo de 50 ml que contiene el filtrado inicial. A continuación, enjuagar la lepapel ns con 3 ml de BGS. El volumen final debe ser de aproximadamente 38 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión que contiene las células gliales disociadas durante 6 min a 130 x g. deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. Asegúrese de que las células sedimentadas en el fondo no se vean perturbadas. La parte inferior de la pastilla aparece ligeramente rojizo que contienen componentes de la sangre. </li><li> Transferencia de las células gliales en 1 ml de medio glial en un tubo nuevo, teniendo cuidado de no perturbar la porción rojizo de la pastilla. </li><li> Añadir hasta 2 ml de medio glial por pup para resuspender el combinado disociarse células gliales. Por ejemplo, se utilizaron si 10 crías, y después el volumen total resuspensión fuera 20 ml. </li><li> Preparar matraz de cultivo de uno 75 cm 2 de células por cachorro. Añadir 18 ml de medio de glial pre-calentado a cada matraz. </li><li> Transferencia de 2 ml de suspensión celular a cada matraz y se incuban en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Después de un día, reemplazar con 20 ml glial medio. En esta etapa, el cultivo es una mezcla de glial y otros tipos de células no deseadas. </li><li> Cuatro días después de sembrar las células, agitar vigorosamente los matraces para desalojar las células no de astrocitos. Para ello, enjuagar los matraces una vez con CMF-HBSS, y luego añadir 10 ml fresco CMF-HBSS a cada matraz. Agitar vigorosamente los matraces de 5-10 veces, y luego aspirar fuera de la CMF-HBSS. Enjuague dos veces con CMF-HBSS y, a continuación añadir 20 ml de medio de glial. NOTA: Este paso es crucial para asegurar la eliminación de tipos de células no objetivo, y no debe dar lugar a la pérdida de los astrocitos deseados. </li><li> Reemplazar con medio glial fresco dos veces a la semana hasta que las células son confluentes (Figura 1). </li></ol></li><li> glía congelación <ol><li> Una vez que son confluentes las culturas, aspirar fuera el medio y lavar la monocapa de células con 10 ml de CMF-HBSS. </li><li> Añadir 10 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a cada matraz y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> matraces golpear suavemente para desalojar las células. Añadir 1 ml BGS to cada matraz y la transferencia de las suspensiones de células en tubos de 15 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 130 xg durante 6 min. Descartar el sobrenadante resultante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de glial. </li><li> Preparar el medio de congelación glial (dimetilsulfóxido 1-parte y 4 partes BGS). Añadir 0,5 ml de esta solución a cada uno de 4 viales criogénicos por matraz. </li><li> Transferir 0,5 ml de suspensión celular a cada vial, y a continuación, congelar las células lentamente mediante la colocación de los viales en un recipiente aislado en un congelador C -80 ° durante la noche. Después de un día, la transferencia de los viales a un congelador de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li><li> Chapado revivió glía <ol><li> glía Plate 1-2 semanas antes del día de la cultura de las neuronas. </li><li> Preparar un ml tubo 50 con 10 ml calentó medio glial. </li><li> Descongelar 1 vial congelado de la glía en un baño de agua a 37 ° durante 2-3 min. </li><li> Transferir el contenido del vial en el tubo de 50 ml que contiene 10 ml de medio de glial. </li><li> centrifuge el tubo durante 5 minutos a 130 xg y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 20 ml de medio de glial. </li><li> Añadir 3 ml de medio de glial fresco a cada una de las placas de cultivo (60 mm), y luego transferir 1 mL de la suspensión celular a cada plato. Incubar los cultivos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Alimentar las células dos veces a la semana. Si la densidad celular alcanza% de confluencia 50 mucho antes de la cultura día neurona, cambiar a medio glial que contiene 5% BGS para ralentizar la tasa de crecimiento glial. La confluencia deseada de la monocapa glial para la cultura neurona es 50% - 70%. </li><li> Reemplazar el medio glial con medio NBG (6 ml / placa) 1-2 días antes de la cultura neurona. </li></ol></li></ol> 3. Coverslip Preparación <ol><li> Limpieza y Preparación de perlas de parafina <ol><li> Sumergir cubreobjetos en ácido nítrico concentrado (70% peso / peso; PRECAUCIÓN: altamente corrosivo) y someter a ultrasonidos ellos durante 30 min a temperatura ambiente. Otros laboratorios han found que es beneficioso para incubar los cubreobjetos en ácido nítrico al 70% en bastidores de cerámica durante 12-24 h a temperatura ambiente en su lugar. </li><li> desechar cuidadosamente el ácido nítrico en una campana de humos química designada de acuerdo a las directrices institucionales. Lavar los cubreobjetos 3-5 veces con agua desionizada. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en agua desionizada y someter a ultrasonidos de nuevo durante 30 min (omitir si siguiendo el método alternativo). </li><li> Eliminar el agua desionizada y enjuagar los cubreobjetos otras tres veces. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en 50 ml de agua desionizada y esterilizarlas en autoclave. Alternativamente, esterilizar los cubreobjetos a 225 ° C en un horno durante 6 h. Si se utiliza este enfoque alternativo, vaya al paso 3.1.9. </li><li> Una vez tratada en autoclave, transferir los cubreobjetos a una campana de flujo laminar estéril para los pasos siguientes. </li><li> Eliminar el agua desionizada y enjuague con 20-30 ml de etanol al 100%. </li><li> Añadir 20-30 ml de etanol al 100% y transferir los cubreobjetos y seetanol a una placa de Petri de 100 mm. </li><li> Use pinzas romas para transferir cubreobjetos de 60 mm placas de Petri, 4-5 cubreobjetos por placa, y luego permitir que se seque al aire apoyándose los cubreobjetos contra el borde del plato. Una vez que el etanol se ha evaporado, sentar las cubreobjetos plana en la superficie. </li><li> Transferir 10 g de parafina a una botella de vidrio resistente al calor adecuado. Derretir la parafina y mantenerla a aproximadamente 150-200 ° C sobre una placa caliente durante al menos 1 h. La temperatura ideal a la que la parafina se debe calentar puede tomar algunos ajustes. temperaturas no ideales puede conducir a la dificultad para producir el tamaño correcto de las perlas de parafina. El período de espera después de la fusión ayuda a asegurar una temperatura constante durante todo el líquido. </li><li> Sumergir una pipeta Pasteur en la parafina, y luego rápidamente tocarlo para tres puntos cerca del borde de cada cubreobjetos (cada punto es aproximadamente de 120 ° de separación). Las gotas se solidifican en perlas de aproximadamente 0,3-0,5 mm de alto y 1,0-2,0 mm de diameter y funcionará para proporcionar un espacio entre las neuronas en el cubreobjetos y la monocapa glial a continuación (Figura 2). </li><li> Esterilizar los platos bajo luz UV durante 30 min, y luego cubrir con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente. cubreobjetos preparados pueden ser almacenados y utilizados hasta por un mes. perlas de parafina se debe permitir que se adhieran a los cubreobjetos durante al menos una semana antes de su uso. Esto evitará que la parafina se desprenda durante los pasos restantes del protocolo. </li></ol></li><li> Los cubreobjetos de recubrimiento con poli-L-lisina <ol><li> Obtener placas de Petri que contienen cubreobjetos previamente preparadas con las perlas de parafina. </li><li> Añadir 200! L de poli-L-lisina en tampón de borato a la superficie de cada cubreobjetos y dejar que la solución se asiente en los cubreobjetos durante la noche, cubierto, a temperatura ambiente. Escudo la misma superficie que aquella en la que están situadas las perlas de parafina. Tenga en cuenta que si se limpian adecuadamente, la poli-L-lisina debe propagarse fácilmentepara cubrir la superficie del cubreobjetos. </li><li> Después de un día, lavar los cubreobjetos dos veces por remojo en agua desionizada estéril para 2 h cada vez. Después del lavado final, reemplazar el agua con 4 ml de medio de chapado neuronal por plato. Tenga en cuenta que es importante que la superficie de los cubreobjetos no permitir que se seque después de haber sido revestido con poli-L-lisina. </li><li> Colocar las cápsulas que contienen cubreobjetos-en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Los cubreobjetos recubiertos deben incubarse durante al menos 24 h antes de la cultura neurona. Esto se hace para preparar el medio para el cultivo de neuronas. </li></ol></li></ol> 4. La disección del hipocampo y neuronas Plating <ol><li> Obtener una rata preñada (día embrionario 18-19, medido desde el día del descubrimiento tapón vaginal) y la eutanasia por decapitación isoflurano anestesiados u otro método aprobado. </li><li> Pulverizar la parte inferior de la rata con 70% de etanol, y luego hacer una incisión de la región púbica throuf al extremo de la cavidad abdominal. Para evitar la contaminación, tener cuidado de cortar sólo a través de la piel en este paso. </li><li> Enjuagar los instrumentos de disección de nuevo con 70% de etanol, y luego se corta a través de la pared abdominal para exponer el útero. Retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un 100 mm placa de Petri estéril. </li><li> Realizar los pasos restantes en una campana de flujo laminar. Retire la membrana uterina que rodea a los fetos. Decapitar a ellos y colocar las cabezas en una placa de Petri de 100 mm que contiene 20 ml CMF-HBSS. </li><li> Diseccionar el cerebro e inmediatamente colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 2 ml CMF-HBSS en hielo. Recoger sólo 2-3 cerebros por placa para permitir espacio suficiente para el paso siguiente. </li><li> Bajo un microscopio de disección tira lejos las meninges de la línea media de los hemisferios cerebrales, y luego diseccionar los hipocampos y colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 4,5 ml CMF-HBSS. Tenga en cuenta que el hipocampo puede ser distinguido como una estruc forma de media lunatura en la superficie medial del hemisferio cortical, y es fácil de eliminar, ya que está bordeado lateralmente por un ventrículo. </li><li> Transferir el tejido del hipocampo recogido y CMF-HBSS a un tubo de 15 ml. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina, y luego se incuba a 37 ° C durante 10 min. La papaína se puede utilizar en lugar de la tripsina, ya que es más suave y puede aumentar el rendimiento. </li><li> eliminar suavemente la solución de tripsina por pipeta Pasteur, dejando el tejido del hipocampo no alterados en la parte inferior del tubo. </li><li> Lavar suavemente el tejido dos veces con 5 ml CMF-HBSS mientras que la incubación a 37 ° C durante 5 min. Después del segundo lavado, llevar el volumen total a al menos 5 ml mediante la adición de un volumen suficiente de CMF-HBSS al tejido. Si hay hipocampos de más de 10 crías, hasta 8 ml CMF-HBSS se puede añadir. </li><li> Preparar dos variantes de pipetas pulida al fuego para la disociación del tejido. La punta de una variante es del diámetro normal de la pipeta, pero con bordes smoothened pulida al fuego. La otra varihormiga es uno con el diámetro de la punta reducido a la mitad. Brevemente exponer la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en diagonal a una fuente de llama, y ​​luego examinar las puntas de las pipetas. <ol><li> Repita este paso hasta que el borde de la punta había sido smoothened o el diámetro se ha reducido. Es importante practicar para encontrar el diámetro ideal para asegurar que el tejido se disocia para producir células individuales sin dañar estas células. </li></ol></li><li> Se tritura el tejido del hipocampo primero por cerca de 10 pases a través de una pipeta Pasteur de vidrio normal, de bordes lisos, y luego un adicional de 5 a 10 pases a través de la pipeta con el diámetro reducido. El objetivo es obtener una solución homogénea de células sin o con muy pocos grumos de tejido. </li><li> Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Típicamente, se obtienen 0,8 a 1,0 millones de células por pup cuando se combinan hipocampos de los dos hemisferios. </li><li> Transferir un volumen suficiente de la suspensión de células a platosque contiene cubreobjetos de poli-L-lisina en 4 ml medio de siembra para obtener una densidad de placas de 300.000 células por placa de 60 mm. La densidad de las células puede variar de 100.000 a 500.000, dependiendo del experimento previsto. </li><li> Después de 3-4 h, transferir los cubreobjetos con las neuronas unidos a platos que contienen células gliales en medio NBG. Esto debe hacerse de tal manera que el lado en el que se sembraron las neuronas se enfrenta hacia abajo hacia la capa de células glial. Añadir un total de 4-5 cubreobjetos por placa de células gliales. </li><li> Dos o tres días después de la siembra, añadir la solución de Ara-C a una concentración final de 5 mM por placa para detener el crecimiento glial. </li><li> Alimentar a las células una vez a la semana mediante la sustitución de 2 ml de la vieja medio con 2,5 ml de medio fresco en cada alimentación. El medio extra añadido es para compensar la evaporación con el tiempo, y sólo una parte del medio se cambia para garantizar acondicionado coherente del medio por las células gliales. Estos cultivos son típicamente sanos durante al menos un mes (La Figura 3). la supervivencia neuronal se puede mejorar mediante la adición de APV al medio de cultivo a una concentración final de 100? M. APV es un antagonista del receptor NMDA y promueve la supervivencia mediante la reducción de la excitotoxicidad del glutamato. </li></ol>

<ol><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+after+ChR2+in+neurons--views+from+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community.</a> Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).</li>
<li>Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cell biology of synaptic plasticity.</a> Science. 334, 623-628 (2011).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80, 704-717 (2013).</li>
<li>Luscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+AMPA+receptor+cycling+in+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity.</a> Neuron. 24, 649-658 (1999).</li>
<li>Varoqueaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+determine+synapse+maturation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuroligins determine synapse maturation and function.</a> Neuron. 51, 741-754 (2006).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li>
<li>Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+6-cyano-7-nitroquinoxaline-2%2C3-dione+with+the+N-methyl-D-aspartate+receptor-associated+glycine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site.</a> Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. 2, 339-370 (1998).</li>
<li>Hanisch, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+a+source+and+target+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as a source and target of cytokines.</a> Glia. 40, 140-155 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que el método &quot;sandwich&quot; de las neuronas que el cultivo haya sido bien descrito en otras partes 2, 11, hay varios pasos a lo largo del protocolo que son muy difíciles de describir en texto por sí solo, que puede conducir a la frustración para los investigadores que desean adoptarlo. El método se puede dividir en tres grandes flujos de trabajo: cultura glial, preparación cubreobjetos y cultivo de neuronas y de mante...

El cerebro está organizado en intrincadas redes de neuronas. La contribución de las neuronas individuales a la actividad de red y la función cerebral puede ser estudiada por la alteración selectiva de su composición molecular y perturbación de sus propiedades fisiológicas. La manipulación genética y química de las neuronas individuales es posiblemente más fácil en neuronas cultivadas que en el tejido del cerebro intacto, sin el estorbo de la heterogeneidad y complejidad celular de este último. Las neuronas en cultivo desarrollan axonal bien definido y cenadores dendríticas y forman extensas conexiones sinápticas entre sí. Mientras que la cultura de las neuronas de animales adultos o de otras regiones del sistema nervioso es posible, cultivos de hipocampo embrionarias son frecuentemente preferidos debido a su población celular piramidal definida y una densidad relativamente baja glial 1, 2. Las neuronas del hipocampo cultivadas a baja densidad en cultivo son particularmente AMEnable al estudio de la localización subcelular, el tráfico de proteínas, la polaridad neuronal y desarrollo de sinapsis. Las neuronas en cultivo también se han empleado ampliamente en el estudio de los procesos moleculares en la plasticidad sináptica 3, 4, 5, 6. Preparaciones de cultivos de neuronas de ratones con deleciones genéticas globales que no sobreviven después del nacimiento han sido especialmente útil en el estudio de funciones celulares y sinápticas de ciertos genes 7. Al igual que en el cerebro, las neuronas del hipocampo en cultivo dependen de soporte trófico de las células gliales. Esto complica su cultura, y ha llevado al desarrollo de varios métodos diferentes de los que se toma este apoyo. Un método comúnmente utilizado implica chapado neuronas directamente sobre una monocapa de células gliales 8, o permitiendo que las células gliales contaminantes de la hipp adquiridotejido ocampal a proliferar y formar una monocapa debajo de las neuronas 9. Si bien este método ha encontrado cierto éxito, la impureza de la cultura neuronal resultante es desventajoso para los experimentos de imagen. Otro método utilizado comúnmente de la cultura neurona es dejar de salida del alimentador glial capa por completo, y en lugar de proporcionar soporte trófico en la forma de un medio de crecimiento definido 10. A continuación, se describe el método de &quot;banquero&quot; de la cultura de la neurona 2, 11 &quot;sándwich&quot; o. Este método consiste en placas las neuronas del hipocampo en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales separadas por perlas de cera de parafina. Esto facilita cultivo a largo plazo de una población homogénea de neuronas sin contaminar glia permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son mayores de edad o nivel de madurez suficiente,los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Instrumentos de disección</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzas</td> <td>4Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzas (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Preparación de tejidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (2.5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Portafiltros Swinnex, 25&nbsp; mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Se utiliza como filtro de células. Ensamble primero con filtro y autoclave</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grado 105 Pañuelo de limpieza de lentes</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Utilizado como filtro de células. Montaje primero en portafiltros y autoclave</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio con filtro de algodón</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank's sin calcio, magnesio y rojo fenol (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino (Dnasa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Quemador bunsen de butano</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td>Centrífuga <td>modelo 65</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Cultivo de tejidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm)</td><td>Placa</td> de Petri <td>Fisher FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Suero de</td><td></td> caballo Fisher FB0875713A <td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Se puede usar en lugar de BGS, pero cada lote debe probarse debido a la variación entre lotes. Se recomienda la inactivación por calor del suero.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Se puede utilizar en lugar de L-glutamina en el medio NBG</td></tr><tr><td>Plato de cultivo (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo (75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Citarabina (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Suero de crecimiento bovino (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>Se recomienda la inactivación por calor antes de su uso.</td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-fosfonopentanoico ácido (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Coverslip Preparación</fuerte></td>Tetraborato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio decahidratado (bórax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Cera de parafina</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Horno de convección por gravedad</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Se utiliza para el método alternativo de limpieza de cubreobjetos discutido en el protocolo</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico (sonicador)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Anachemia</td> de<td>ácido nítrico</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Gradillas de tinción de cerámica</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Se utiliza para el método alternativo de limpieza de cubreobjetos discutido en el protocolo</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&nbsp; GmbH</td><td>1001/18</td><td>El fabricante es muy importante, ya que las neuronas no se adhieren bien al vidrio de menor calidad&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Miscelánea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa estériles</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Se utiliza con la jeringa BD para Jeringa de esterilización por filtro</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Se utiliza con filtros de jeringa estériles VWR para la esterilización por volutado</td></tr> Baño de agua <tr><td>Microscopio invertido</td><td>Fisher</td><td>Scientific</td> 15-460-16Q Olympus CKX41 <td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéril cónicos de 15 mL</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estériles cónicos de 50 ml</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

baja densidad primaria del hipocampo neurona cultura

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

La capacidad para sondar la estructura y fisiología de las células nerviosas individuales en cultivo es crucial para el estudio de la neurobiología, y permite la flexibilidad en la manipulación genética y química de las células individuales o redes definidas. Tal facilidad de manipulación es más sencilla en el sistema de cultivo reducido en comparación con el tejido cerebral intacta. Aunque existen muchos métodos para el aislamiento y crecimiento de estas neuronas primarias, cada uno tiene sus propias limitaciones. Este protocolo describe un método para el cultivo de baja densidad y de roedores de alta pureza neuronas del hipocampo embrionarias en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales. Esta &#39;cultura sándwich&#39; permite el crecimiento exclusiva a largo plazo de una población de neuronas permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son de edad suficiente o nivel de madurez, los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales. Las neuronas grown por este método normalmente sobrevivir durante varias semanas y desarrollar amplias pérgolas, conexiones sinápticas, y propiedades de la red.

En este método &quot;sandwich&quot; de cultivo de células de nervio primario, las neuronas del hipocampo (Figura 3) crecen en una cama de células gliales (Figura 1) separadas por perlas de parafina (Figura 2). Esto asegura que las neuronas crezcan selectivamente en cubreobjetos de vidrio con la contaminación de células glial mínima, pero reciben soporte trófico adecuada de la glía que crecen en la placa de cultivo tisular. Típicamente, l...

Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Este protocolo fue publicado originalmente por el Dr. Gary Bunker y sus colegas, y permite el cultivo de neuronas hipocampales embrionarias con alta densidad y gran pureza, suspendiendo las neuronas sobre una capa de células gliales. Este resultado es fundamental para nuestros otros resultados cruciales del hipocampo, ya que permite que las neuronas crezcan a bajas densidades con pocas células gliales contaminantes. Por lo tanto, este cultivo es ideal para imágenes de alta resolución y análisis funcional de la tipografía y neuronas maduras en cultivo.La post-maduración de este protocolo debería acelerar la adaptación por parte de nuevos investigadores, ya que existen varios estados clave durante el procedimiento que son difíciles de describir, por lo que este los guía paso a paso. Este protocolo consta de tres poblaciones independientes necesarias para el cultivo de neuronas primarias de alta calidad. Estos procesos incluyen el cultivo de células gliales, la creación y recubrimiento de laminillas, y la preparación de células nerviosas del hipocampo.Para comenzar, se debe obtener tejido cortical de rata posnatal temprano según se describe en el protocolo escrito. Aunque no se muestr

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La disección y el crecimiento de las células de un área del cerebro individuales facilita la investigación de los parámetros celulares y fisiológicos. Se describe un método para el cultivo de células primarias que produce neuronas enriquecido las culturas en un ambiente libre de suero.

Cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratas recién nacidas P0

Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

El video muestra un método para cultivar neuronas de hipocampos murinos. Inicialmente, los hipocampos se someten a una digestión enzimática para descomponer la matriz de tejido extracelular. Posteriormente, el tejido digerido se interrumpe mecánicamente para aislar las neuronas individuales. Finalmente, estas neuronas se cultivan en células alimentadoras gliales.

Una técnica para cultivar neuronas del hipocampo de ratón

Este video muestra el método de cultivo de neuronas embrionarias criopreservadas, que implica la descongelación controlada, la dilución con un medio neurobasal y la siembra en una placa recubierta de poli-L-lisina. La incubación posterior favorece el crecimiento y el mantenimiento de las conexiones neuronales.

Generación de un cultivo de neuronas primarias de baja densidad a partir de neuronas embrionarias congeladas

Este video muestra el método para cultivar neuronas de ultra baja densidad en presencia de una capa alimentadora de neuronas de alta densidad. Establece un cocultivo de neuronas de densidad variable, lo que garantiza una proximidad física cercana. Los factores de crecimiento secretados por las neuronas de alta densidad ayudan a la supervivencia y el crecimiento neuronal, manteniendo las neuronas de ultra baja densidad durante un período de tiempo más largo.

Generación de un cultivo neuronal de ultra baja densidad utilizando una capa alimentadora de neuronas de alta densidad

Los cultivos neuronales embrionarios primarios disociados del hipocampo son útiles para investigar los mecanismos de señalización implicados en la muerte neuronal. El sexado de los embriones antes del aislamiento y disociación del hipocampo permite la preparación de cultivos masculinos y femeninos separados, lo que permite al investigador identificar e investigar la señalización celular específica del sexo.

Cultivos neuronales estratificados por sexo para estudiar las vías de muerte de las células isquémicas

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Los cultivos de baja densidad de neuronas primarias del hipocampo generalmente requieren una capa alimentadora de glía para suministrar factores neurotróficos y mantener la longevidad. Describimos aquí un método simplificado para cultivar neuronas de ultra baja densidad en cubreobjetos de vidrio en presencia de una capa alimentadora de neuronas de alta densidad, lo que facilita la investigación de mecanismos neuronal-autónomos específicos.

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Este protocolo muestra cómo emplear la microscopía de superresorción para estudiar la co-localización de proteínas en cultivos neuronales primarios.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Un stock congelado de neuronas listo para usar es una herramienta poderosa para evaluar las funciones sinápticas. Aquí, introducimos un cultivo primario fácil de baja densidad a partir de material congelado utilizando una placa de 96 pocillos.

Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando existencias congeladas de neuronas embrionarias del hipocampo

Aprende a cultivar neuronas primarias de hipocampo a baja densidad sobre monocapa glial. Este método permite obtener cultivos de alta pureza ideales para imágenes de alta resolución y ensayos funcionales de neuronas maduras.

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