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Las instalaciones de RMN fueron financiadas por la Región Norte, el CNRS, el Instituto Pasteur de Lille, la Comunidad Europea (FEDER), el Ministerio de Investigación francés y la Universidad de Ciencias y Tecnologías de Lille. Agradecemos el apoyo de TGE RMN THC (FR-3050, Francia), FRABio (FR 3688, Francia) y las instalaciones centrales de RMN y RPE Health and Biology de Lille. Nuestra investigación está respaldada por subvenciones del LabEx (Laboratorio de Excelencia), DISTALZ (Desarrollo de Estrategias Innovadoras para un enfoque Transdisciplinario de la enfermedad de Alzheimer), EU ITN, TASPPI y ANR BinAlz.

1. Producción de 15 N, 13 C-Tau (Figura 1) <ol><li> Transformar pET15b-Tau T7 recombinante plásmido de expresión de 13,14 en BL21 (DE3) células bacterianas competentes de Escherichia coli 15. NOTA: el ADNc que codifica para la más larga (441 residuos de aminoácidos) isoforma Tau se clona entre los sitios de restricción NcoI y XhoI en el plásmido pET15b. <ol><li> Mezclar suavemente 50 l de BL21 competente (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonias por g de ADN plásmido, con 100 ng de ADN plasmídico en un tubo de plástico 1,5 ml. NOTA: codón de uso optimizado cepas bacterianas para la expresión de ADNc eucariota no son esenciales para producir Tau humano. </li><li> Colocar la mezcla de células en hielo durante 30 min y después de choque térmico de 10 segundos a 42 ° C. Coloque el tubo de nuevo en hielo durante 5 minutos y añadir 1 ml de la temperatura ambiente LB (Luria-Bertani). Incubar la suspensión bacteriana a 37 ° C durante 30 min bajo suaveagitación. </li></ol></li><li> Extender el uso de un asa de siembra de 100 l de suspensión de células uniformemente sobre una placa de agar de medio LB que contiene 100 mg / ml de antibiótico ampicilina. </li><li> Incubar la placa de selección durante 15 horas a 37 ° C. </li><li> Mantenga la placa de selección a 4 ° C hasta que proceder a la etapa de cultivo, para un máximo de 2 semanas aproximadamente. NOTA: un stock de glicerol de cultivo bacteriano (50% de glicerol), almacenados a -80 ° C, se puede preparar para iniciar el cultivo en una etapa posterior. </li><li> Añadir 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml mM CaCl 2 100, 10 ml 100x MEM vitamina complemento, 1 ml 100 mg / ml de ampicilina a 1 L de sales M9 autoclave (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 , 0,5 g de NaCl). NOTA: Un precipitado blanco se forma después de la adición de la solución de CaCl 2 a las sales M9 que se disipa rápidamente. </li><li> Solubilizar 300 mg de N 15, C-13 medio completo, 1 g de 15NH 4 Cl y 2 g de 13 C 6 -glucosa en 10 ml de medio M9. Filtros de esterilizar la solución isótopo usando un filtro de 0,2 micras, directamente en el medio M9. </li><li> Suspender el uso de una inoculación de bucle una colonia de pET15b-Tau transformado bacterias de la placa de selección en 20 ml de medio LB suplementado con 100 mg / ml de ampicilina. </li><li> Incubar el medio inoculado a 37 ° C durante aproximadamente 6 horas. </li><li> Medir la densidad óptica a 600 nm (OD 600) en 1 ml de una dilución de diez veces de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico. NOTA: La turbidez del cultivo bacteriano correspondiente a OD 600 de 3,0 a 4,0 indica que se alcanza la fase de crecimiento de saturación. </li><li> Añadir 20 ml del cultivo LB saturado a 1 L de medio de crecimiento M9 suplementado con ampicilina (100 mg concentración final / ml), en 2 de plástico L matraz Erlenmeyer de cultura desconcertado. </li><li> Colocar el frasco de cultivo en una incubadora programable ajustado a 10 °C y 50 rpm. Programar la incubadora para cambiar a 200 rpm y 37 ° C temprano en la mañana del día siguiente. </li><li> Medida OD 600 en 1 ml de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico. Añadir 400 l de 1 M de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) solución madre (mantenido a -20 ° C) cuando OD 600 alcanza un valor de aproximadamente 1,0 para inducir la expresión de la proteína tau recombinante. </li><li> Continuar la incubación a 37 ° C durante un 3 horas más. Recoger las células bacterianas por centrifugación a 5000 xg durante 20 min. </li><li> Congelar el sedimento bacteriano a -20 ° C. Mantener congelado hasta la etapa de purificación, por un período prolongado si es necesario. </li></ol> 2. Purificación de 15 N, 13 C-Tau (Figura 2) <ol><li> Autoclave de intercambio catiónico (CEX) amortiguadores de purificación a 121 ° C bajo 15 psi durante 20 min. tampones se almacenan a 4 ° C. </li><li> Descongelar el pellet de células bacterianas y resuspender a fondo en 45 mlde extracción CEX Un tampón (50 mM de tampón NaPi pH 6,5, EDTA 1 mM) recién suplementado con 1x de cóctel inhibidor de la proteasa (1 comprimido) y DNAseI (2.000 unidades). </li><li> Romper las células bacterianas usando un homogeneizador de alta presión a 20.000 psi. 3-4 pases son necesarios. Centrifugar a 20.000 xg durante 40 min para eliminar el material insoluble. </li><li> Calentar el extracto de células bacterianas durante 15 minutos a 75 ° C usando un baño de agua. NOTA: se observa un precipitado blanco después de unos pocos minutos. </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 20 min y mantener el sobrenadante que contiene la proteína Tau estable al calor. </li><li> Almacenar a -20 ° C hasta la siguiente etapa de purificación, si es necesario. </li><li> Realizar una cromatografía de intercambio catiónico sobre una resina CEX fuerte embalado como una columna de 5 ml cama usando una cromatografía líquida rápida de proteínas del sistema (FPLC) (Figura 3 A). <ol><li> Ajuste del caudal de 2,5 ml / min. </li><li> Equilibrar la columna en tampón A CEX </li><li> Cargar el climatizada- 60-70 mlextracto que contiene Tau usando una bomba de muestra, o, alternativamente, la bomba A, en función del sistema. Recoger el flujo a través de análisis para verificar que la proteína Tau es vinculante de manera eficiente a la resina (ver 2.8). </li><li> Lavar la resina con CEX Un tampón hasta que la absorbancia a 280 nm es de nuevo a valor de línea base. </li><li> Eluir Tau de la columna usando un gradiente de NaCl de tres pasos obtenido por aumento gradual de tampón CEX B (CEX un tampón con 1 M NaCl). Programa de la FPLC de la siguiente manera: primero el paso del gradiente a un tampón de 25% CEX B en 10 volúmenes de columna (CV) para llegar a NaCl 250 mM, segundo paso a un tampón de 50% CEX B en 5 CV para llegar a NaCl 500 mM, y tercera etapa al 100% de tampón B en CEX 2 CV para llegar a 1 M de NaCl. Recoger fracciones de 1,5 ml durante los pasos de elución. </li></ol></li><li> Analizar 10 l de las fracciones recogidas durante la etapa de elución mediante SDS-PAGE (12% de gel de SDS-acrilamida) y tinción con Coomassie (Figura 3 A) 16. Compruebe la etapa de carga en la columna a su vez por Analyzing 10 l de el flujo a través. </li><li> Elija las fracciones que contienen Tau y agrupar estas fracciones para el siguiente paso. </li><li> Realizar un intercambio de tampón en fracciones que contienen Tau agrupados (Figura 3 B). <ol><li> Equilibrar una columna de desalación de 53 ml G25 resina de lecho compacto (26 x 10 cm) en mM de bicarbonato de amonio 50 (tampón volátil) utilizando un sistema de FPLC. </li><li> Set velocidad de flujo a 5 ml / min. Se inyecta la muestra de Tau en la columna a través de un bucle de inyección de 5 ml. Recoger fracciones correspondientes al pico de absorción a 280 nm. </li><li> Repetir la inyección 3-4 veces, dependiendo del volumen de la piscina inicial CEX. </li></ol></li><li> Calcular la cantidad de proteína Tau purificada utilizando el área del pico del cromatograma a 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mUA * ml). NOTA: El coeficiente de extinción de la proteína Tau a 280 nm es 7,550 M -1 cm -1. Tau no contiene residuos de Trp. </li><li> La piscina todas las fracciones Tau. </li><li> aliquot la muestra en tubos que contenían el equivalente de 1 a 5 mg de Tau. Elija estos tubos de modo que el volumen de la solución es pequeño comparado con el volumen del tubo (por ejemplo, 5 ml de la solución en un tubo de 50 ml). </li><li> Perforar agujeros en las tapas de los tubos utilizando una aguja. Tau congelar las muestras a -80 ° C. </li><li> muestras Liofilizar Tau. proteína liofilizada Tau puede mantenerse a -20 ° C durante largos períodos de tiempo. </li></ol> 3. En Vitro La fosforilación de 15 N-Tau <ol><li> Disolver 5 mg de Tau liofilizado en 500 l de tampón de fosforilación (Hepes 50 mM · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, NaCl 50 mM). </li><li> Añadir ATP 2,5 mM (25 l de solución madre 100 mM mantuvieron a -20 ° C), DTT 1 mM (1 l de solución madre de M 1 se mantuvieron a -20 ° C), mM EGTA 1 (2 l de una acción 0,5 M solución), 1x cóctel inhibidor de proteasa (25 l de una acción 40x obtenida disolviendo 1 comprimido en tampón de 1 ml fosforilación) y 181; M activado su-ERK2 (250 l en tampón de conservación de 10 mM Hepes, pH 7,3, DTT 1 mM, 5 mM MgCl2, NaCl 100 mM y glicerol al 10%, almacenado a -80 ° C) en un volumen total de la muestra de 1 ml. NOTA: El activado su-ERK2 se puede preparar en la casa 5,8 por fosforilación con la quinasa MEK. </li><li> Incubar 3 horas a 37 ° C. </li><li> Calentar la muestra a 75 ° C durante 15 min para inactivar ERK quinasa. </li><li> Centrifugar a 20.000 xg durante 15 min. Recoger y guardar el sobrenadante. </li><li> Desalar la muestra de proteína en 50 mM de bicarbonato de amonio usando una columna de 3,45 ml G25 resina de lecho empaquetado (1,3 x 2,6 cm), que es adecuado para una muestra de 1 ml. </li><li> Ejecutar un 12% SDS-PAGE 16 con 2,5 l de la muestra de proteína para comprobar tanto su integridad y la fosforilación eficiente (Figura 4). </li><li> Liofilizar la muestra Tau fosforilada. Guarde el polvo a -20 ° C. </li></ol> 4. La adquisición de espectros de RMN (Figura 5) <ol><li> Solubilizar 4 mg de liofilizado 15 N, 13 C ERK fosforilada-Tau en 400 l de tampón RMN (NaPi 50 mM o 50 mM Tris- deuterados d11 .CL, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM y DTT 1 mM). </li><li> Añadir 5% D 2 O para el bloqueo de campo del espectrómetro de RMN y TMSP 1 mM (3- (trimetilsilil) sal de sodio 4 ácido propiónico-2,2,3,3-d)) como referencia de señal de RMN interna. Añadir 10 l de una solución social de 40x completo cóctel inhibidor de proteasa. </li><li> Transferir la muestra en un tubo de RMN de 5 mm usando una jeringa electrónica con una aguja larga o una pipeta Pasteur. Cerrar el tubo de RMN utilizando el émbolo. Eliminar cualquier burbuja de aire atrapada entre el émbolo y el líquido por los movimientos de émbolo. </li><li> Se coloca el tubo de RMN en una ruleta. Ajuste su posición vertical en la ruleta con el calibre adecuado para la cabeza de la sonda de RMN utilizado, de tal manera que la mayor parte de la solución de muestra habrá dentro de la bobina RMN. </li><li> Iniciar el flujo de aire: haga clic en Levanton la ventana de sistema de control de imán. Colocar con cuidado el spinner con el tubo en el flujo de aire en la parte superior de la cavidad del imán. Detener el flujo de aire (click ascensor) y dejar que el tubo de descender en su lugar dentro de la cabeza de la sonda en el imán. </li><li> Ajuste la temperatura a 25 ° C (298 K). </li><li> Utilizar la sintonización semiautomático y la congruencia de la cabeza de la sonda para optimizar la transmisión de energía. Escriba ATMM en la línea de comandos. </li><li> Bloquear la frecuencia del espectrómetro utilizando la señal de D2O de la muestra, en el canal de deuterio. Haga clic en la ventana de bloqueo de sistema de control de imán. </li><li> Iniciar el procedimiento de calce para optimizar la homogeneidad del campo magnético en la posición de la muestra. Escriba topshim interfaz gráfica de usuario en la línea de comando para abrir la ventana de cuña. Haga clic en Inicio en la ventana de cuña. Comprobar el valor de la variación estándar B0 residual para verificar que las cuñas son óptimas (menos de 2 Hz es bueno). </li><li> Calibrar el parámetro p1 (longitud de un protónpulso de radiofrecuencia en microsegundos), que es necesario para obtener una rotación de giros de protones 90 °. Objetivo para el impulso de 360 ° utilizando un espectro 1D de protones del agua (Figura 6). </li><li> Ajustar la frecuencia de desplazamiento estableciendo el parámetro o1 (en Hz) a la frecuencia de protones del agua en el espectro 1D (Figura 6). </li><li> Iniciar la adquisición de un espectro de protón 1D (secuencia de impulsos con la secuencia de esclusa para la supresión de la señal de agua, por ejemplo zggpw5) para verificar las señales de la muestra (Figura 7). Adaptar el número de exploraciones a la concentración relativa de proteínas. Zg escriba en la línea de comandos para iniciar la adquisición. </li><li> Configurar parámetros adicionales para la adquisición de un 2D [1 H, 15 N] espectro HSQC (pulso secuencia hsqcetfpf3gpsi, las Figuras 8-9). <ol><li> Para un 15 N, 13 C etiquetado de la muestra, desacoplar 13 C durante la evolución indirecta 15N. </li><li&gt; Establecer el número de puntos y el ancho espectral (ppm) en el 1H (F2) y 15 N dimensiones (F1). NOTA: Adaptar el número de puntos de datos de adquisición al campo espectrómetro para mantener un número similar de Hz por punto y limitar los tiempos de desacoplamiento: utilizar 3.072 puntos a 900 MHz y 2.048 puntos a 600 MHz, en la dimensión 1H. </li><li> Optimizar los parámetros adicionales en las secuencias de pulsos, lo que corresponde a los retrasos, longitudes de pulso, que se compensan las frecuencias, niveles de potencia. Tipo obre la base de la línea de comandos para visualizar todos los parámetros relevantes para el experimento. </li></ol></li><li> Establecer parámetros para la adquisición de un 3D [1 H, 15 N, 13 C] espectro HNCACB (secuencia de pulsos hncacbgpwg3d, Figura 10A) a 600 MHz. </li><li> Establecer parámetros para un 3D [1 H, 15 N, 15 N] experimento HNCANNH (pulso secuencia hncannhgpwg3d) a 600 MHz. Establecer el número de puntos de 2048 en el 1 y H, 64y 128 puntos en las dos 15 N dimensiones. Definir las anchuras espectrales como 14, 25, 25 partes por millón (ppm) centrado en el 4.7, 119, 119 ppm en el 1 H, 15 N y 15 N dimensiones. Duración de adquisición con 16 exploraciones es de 1 día y 22 hr. </li></ol> 5. Identificación de los sitios de fosforilación <ol><li> Los espectros de proceso utilizando software de adquisición y procesamiento de RMN. <ol><li> Realizar una transformación de Fourier de los datos (Figura 7). Tipo de pies para un espectro 1D, XFB para un espectro 2D o ft3d para un espectro 3D, en la línea de comandos. </li><li> Fase y la referencia de todos los espectros (Figura 7C) usando las ventanas interactivas. </li></ol></li><li> Identificar las resonancias de interés en el HSQC 2D potencialmente correspondiente a los residuos fosforilados Ser y Thr (Figura 9, la caja roja). </li><li> Planos del extracto (es decir, 2D 1 H- 13 C espectros) a partir deel espectro C 3D 1 H-15 N 13 N 15 utilizando los desplazamientos químicos de las resonancias de interés en el 2D. Utilice el cursor de dimensión 2 (W2) para elegir la frecuencia de 15 N correspondiente al plano (W1-W3) para ser visualizado (Figura 10B). </li><li> Recoger las frecuencias de resonancia de &#39;CA&#39; y 13 núcleos &#39;CB&#39; C de la &#39;i&#39; y residuos &#39;i-1&#39; (conjunto más débil de las señales en comparación con los del residuo i) para cada [1 H, 15 N] resonancia de interés en el espectro HNCACB 3D haciendo clic en la resonancia, en el menú del modo de puntero encontrar / agregar pico, para añadir el valor del desplazamiento químico en un archivo de lista de pico. <ol><li> Identificar el tipo de residuo IR, pSer o pThr, mediante la comparación de los desplazamientos químicos en el pico de la lista de valores conocidos de CA y CB desplazamientos químicos de pSer y pThr 17. </li><li> Identificar la presencia de un residuo Pro en la posición 1 + i por una característica adicional de 2 ppm de desplazamiento of el valor del desplazamiento químico CA 18. </li><li> Comparación de los valores de desplazamiento químico de las resonancias de CA y CB que corresponde al residuo i-1 a una tabla de los desplazamientos químicos previstos para Tau residuos de aminoácidos 19 para identificar la naturaleza del residuo en la posición i-1. </li></ol></li><li> Recoger las frecuencias de resonancia de 15 N núcleos de la &quot;i&quot; y residuos &#39;I-1&#39; para cada una de resonancia [1 H, 15 N] de interés en el espectro HNCANNH. </li><li> Compara los 15 N valores de desplazamiento químico a la asignación de desplazamiento químico de la proteína Tau 20 - 23. </li><li> Comparación de los dipéptidos identificados con la secuencia de Tau para definir la asignación específica de la secuencia. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos utilizado la espectroscopía de RMN para caracterizar muestras de Tau enzimáticamente modificados. La expresión recombinante y la purificación se describe aquí para la proteína tau humana de longitud completa de manera similar se pueden utilizar para producir mutantes Tau o Tau dominios. Isotópicamente la proteína es necesaria enriquecido para espectroscopía de RMN, lo que exige de expresión recombinante. La identificación de sitios de fosforilación requiere la asignación de resonancia y una proteína doblemente mar...

Uno de los principales retos de la atención sanitaria en el siglo 21 son enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Tau es una proteína asociada a los microtúbulos que estimula la formación de microtúbulos (MT). Tau está igualmente implicado en varias enfermedades neurodegenerativas, llamados tauopatías, de los cuales el más conocido es AD. En estos trastornos, auto-tau agregados en filamentos helicoidales emparejados (PHFs) y se encuentra modificada por muchos residuos de acuerdo con las modificaciones posteriores a la traducción (PTMs) como la fosforilación 1. La fosforilación de la proteína tau está implicada tanto en la regulación de su función fisiológica de estabilización MT y la pérdida patológica de función que caracteriza las neuronas AD. Además, la proteína Tau, cuando se integra en PHFs en las neuronas enfermas, es invariablemente hyperphosphorylated 2. A diferencia de tau normal que contiene 2-3 grupos fosfato, la Tau hiperfosforilada en PHFs contiene 5-9 Phosphatgrupos e 3. Hiperfosforilación de Tau corresponde tanto a un aumento de la estequiometría en algunos sitios y a la fosforilación de los sitios adicionales que se denominan sitios patológicos de fosforilación. Sin embargo, existe superposición entre los patrones normales de un adulto de la fosforilación de AD y, a pesar de las diferencias cuantitativas en el nivel 4. Cómo algunos eventos de fosforilación función de influencia y la disfunción del Tau sigue siendo desconocida. Nuestro objetivo es descifrar la regulación Tau por PTM a nivel molecular. Para profundizar en la comprensión de los aspectos moleculares de Tau, tenemos que hacer frente a los desafíos técnicos. En primer lugar, Tau es una proteína intrínsecamente desordenados (IDP) cuando se aíslan en solución. Tales proteínas carecen de estructura tridimensional bien definido en condiciones fisiológicas particulares y requieren métodos biofísicos para estudiar su función (s) y las propiedades estructurales. Tau es un paradigma para la clase creciente de desplazados internos, a menudo se encuentran asociados conpatologías tales como enfermedades neurodegenerativas, por lo tanto aumentando el interés de comprender los parámetros moleculares que subyacen a sus funciones. En segundo lugar, la caracterización de la fosforilación de Tau es un reto analítico, con 80 sitios de fosforilación potenciales a lo largo de la secuencia de la isoforma más larga de Tau 441 amino-ácido. Un número de anticuerpos Se han desarrollado contra epítopos fosforilados de Tau y se utilizan para la detección de Tau patológico en neuronas o tejido cerebral. fosforilación eventos pueden tener lugar en al menos 20 lugares elegidos por las quinasas dirigidas por prolina, la mayoría de ellos en las proximidades de la región rica en prolina. El cualitativa (qué sitios?) Y cuantitativo (lo estequiometría?) La caracterización es difícil, incluso por las más recientes técnicas MS 5. espectroscopía de RMN se puede utilizar para investigar proteínas desordenadas que son altamente sistemas dinámicos constituidos de conjuntos de confórmeros. espectroscopía de RMN de alta resolución fue aplied para investigar la estructura y función de la proteína Tau. Además, la complejidad del perfil de fosforilación de Tau condujo al desarrollo de herramientas moleculares y nuevos métodos de análisis utilizando RMN para la identificación de sitios de fosforilación de 6 - 8. NMR como un método de análisis permite la identificación de sitios de fosforilación de tau de una manera global, la visualización de todas las modificaciones de sitio único en un único experimento, y la cuantificación de la extensión de la incorporación de fosfato. Este punto es esencial, ya que aunque los estudios de fosforilación de Tau abundan en la literatura, la mayoría de ellos se han realizado con anticuerpos, dejando un alto grado de incertidumbre sobre el perfil completo de fosforilación y por lo tanto el verdadero impacto de los eventos de fosforilación individuales. quinasas recombinantes incluyendo PKA, 3β-glucógeno sintasa quinasa (GSK3), dependiente de ciclina quinasa 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), la quinasa dependiente de ciclina 5 (CDK5) / p25 actoproteína ivator, quinasa 2 extracelular de señal regulada (ERK2) y microtúbulos afinidad de regulación de quinasa (MARK), que muestran actividad de fosforilación hacia Tau, se pueden preparar en una forma activa. Además, los mutantes Tau que permiten la generación de isoformas específicas de la proteína Tau con patrones de fosforilación bien caracterizados se utilizan para descifrar el código de la fosforilación de Tau. Espectroscopía de RMN se utiliza entonces para caracterizar muestras de Tau enzimáticamente modificados 6 - 8. Aunque la fosforilación in vitro de Tau es más difícil que pseudo-fosforilación como por mutación de seleccionado Ser / Thr en residuos de ácido glutámico (Glu), este enfoque tiene sus méritos. De hecho, ni los de impacto ni de interacción parámetros estructurales de la fosforilación siempre se pueden imitar por los ácidos glutámico. Un ejemplo es el motivo a su vez observado alrededor de fosfoserina 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), que no se reproduce con mutaciones Glu 9. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aquí, la preparación de Tau marcado isotópicamente para las investigaciones de RMN se describirá primero. proteína tau fosforilada por ERK2 se modifica en numerosos sitios descritos como sitios de fosforilación patológicos, y por lo tanto representa un modelo interesante de tau hiperfosforilada. Se presenta un protocolo detallado de Tau en la fosforilación in vitro por ERK2 quinasa recombinante. ERK2 se activa por la fosforilación por la proteína quinasa activada por mitógeno / ERK quinasa (MEK) 10-12. Además de la preparación de proteína modificada, marcado isotópicamente Tau, la estrategia NMR utilizado para la identificación de la PTM se describe.

<table><tbody><tr><td>plásmido de expresión T7 recombinante pET15B</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Mantener a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) competente para la transformación E. coli bacterias</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Mantener a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Caldo LB esterilizado en autoclave, Lennox &nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Medio de Crecimiento Bacteriano</td></tr><tr><td>MEM complementos vitamínicos 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Medio de Crecimiento Bacteriano Suplemento</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO medio completo</td><td>en polvo Sigma</td><td>608297</td><td>Suplemento de Medio de Crecimiento Bacteriano</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>Isótopo</td></tr><tr><td>13C6-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Isótopos</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>mantener a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>1 comprimido en 1 ml es una solución 40x que se puede mantener a -20 & grados; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Mantener a -20 &deg; </td></tr><tr><td>Homogeneizador C (EmulsiFlex-C3)</td>La lisis <td>de AVESTIN</td><td></td><td>se realiza a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Marcador de proteína MW sin teñir</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>quinasa MEK1 humana activa, GST Etiquetado Sigma</td><td></td><td>M8822</td><td>Mantener a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; Sistema de cromatografía pura</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC HiTrap</td></tr><tr><td>SP Sepharose FF (columna de 5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Columnas de cromatografía de intercambio catiónico</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalinización</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Columna desalinizadora de proteínas</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Columna desalinizadora de proteínas</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Tampón de RMN deuterado</td></tr><tr><td>5 mm Microtubo simétrico SHIGEMI D2O (juego de 5 tubos internos y externos)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>RMN Shigemi Tubes</td></tr><tr><td>eVol kit-kit de inicio de jeringa electrónica</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipeteo</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII con cabezal criogénico de triple resonancia</td><td>Espectrómetro de RMN</td><td>Bruker</td><td></td> para adquisición de datos</tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance con cabezal de sonda criogénica de triple resonancia</td><td>Espectrómetro de RMN</td> <td>Bruker</td><td></td> para adquisición de datos</tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software de adquisición y procesamiento para experimentos de RMN</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard y D. G. Kneller)</td><td></td><td>Software de análisis de datos de RMN</td></tr></tbody></table>

nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Los agregados de la proteína Tau neuronal se encuentran dentro de las neuronas de los pacientes con enfermedad de Alzheimer. El desarrollo de la enfermedad se acompaña de un aumento de la fosforilación anormal de Tau. En el curso de la investigación molecular de las funciones y disfunciones de Tau en la enfermedad, se utiliza la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para identificar las múltiples fosforilaciones de Tau. Presentamos aquí protocolos detallados de producción recombinante de Tau en bacterias, con enriquecimiento isotópico para estudios de RMN. Se describen los pasos de purificación que aprovechan la estabilidad térmica y el alto punto isoeléctrico de Tau. El protocolo de fosforilación in vitro de Tau por ERK2 activado recombinante permite generar múltiples fosforilaciones. La muestra de proteína está lista para la adquisición de datos en el momento de la emisión de estos pasos. A continuación, se considera la configuración de parámetros para iniciar la grabación en el espectrómetro. Finalmente, se explica la estrategia para identificar los sitios de fosforilación de Tau modificada, basada en datos de RMN. Se discute el beneficio de esta metodología en comparación con otras técnicas utilizadas para identificar sitios de fosforilación, como la inmunodetección o la espectrometría de masas (MS).

La figura 3A muestra un pico de absorción principal a 280 nm observados durante el gradiente de elución. Este pico corresponde a la proteína Tau purificada como se ve en el gel de acrilamida por encima del cromatograma. La Figura 3B muestra un pico de absorción bien separados a 280 nm y un pico de conductividad, asegurándose de que el desalado de la proteína es eficiente. La Figura 4 muestra la proteína gel de cambio observado por análisis de SDS-PAGE 16 característico de la fosf...

Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

El objetivo general de esta metodología es identificar la fosforilación múltiple de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear utilizando la proteína tau como caso de estudio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la regulación molecular relacionada con la enfermedad, como el impacto de la fosforilación en la interacción de la proteína con su socio molecular. La principal ventaja de esta técnica es que podemos identificar la fosforilación específica del sitio en una proteína desordenada y relacionarla con cambios estructurales y funcionales.Este método puede proporcionar información sobre la función. También se puede aplicar a otras proteínas como los restos desordenados de la proteína ADN del virus aPtc Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia mediante el desarrollo de proteínas, inhibidores de la interacción proteica. Este método será demostrado por Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa y Hamida Merzougui, los estudiantes de doctorado de nuestro grupo.Para comenzar, mezcle suavemente 50 microlitros de células BL21 competentes con 100 nanogramos de ADN plasmídico, formando de 10 a 15 millones de colonias por microgramo de ADN plasmático en un tubo de plástico de 1,5 mililitros. Después de colocar la mezcla de células en hielo durante 30 minutos, aplíquela durante 10 segundos a 42 grados centígrados. A continuación, vuelva a colocar el tubo en hielo durante cinco minutos antes de añadir un mililitro de Luria Bertani o LB medio a temperatura ambiente.Incubar la suspensión bacteriana a 37 grados centígrados durante 30 minutos bajo una agitación suave. Con un esparcidor, esparza 100 microlitros de la suspensión celular de manera uniforme sobre una placa de agar de medio LB que contenga 100 microgramos por mililitro de antibiótico ampicilina. Incubar la placa de selección durante 15 horas a 37 grados centígrados.A continuación, solubilice 300 miligramos de medio enriquecido con nitrógeno 15 y carbono 13, un gramo de cloruro de amonio con nitrógeno 15 y dos gramos de glucosa marcada con carbono 13 en 10 mililitros de medio M9. Filtre: esterilice la solución de isótopos directamente en el medio M9 utilizando un filtro de 0,2 micras. Con una pipeta de pasteur, suspenda una colonia de bacterias transformadas en plasma recombinante de la placa de selección en 20 mililitros de medio LB, suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina.Incubar el medio inoculado a 37 grados centígrados durante aproximadamente seis horas. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros o OD600 utilizando un mililitro de una dilución diez veces mayor de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico. A continuación, añada 20 mililitros del cultivo LB saturado a un litro de medio de crecimiento M9 suplementado con ampicilina en un matraz de cultivo con deflector de vidrio Erlenmeyer de dos litros.Coloque el matraz de cultivo en una incubadora programable configurada a 10 grados centígrados y 50 RPM. Programe la incubadora para que cambie a 200 RPM y 37 grados centígrados temprano en la mañana del día siguiente. Mida el OD600 en un mililitro de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico.Agregue 400 microlitros de una solución madre molar de IPTG cuando el OD600 alcance un valor de aproximadamente 1.0 para inducir la expresión de proteína tau recombinante. Después de incubar las células bacterianas a 37 grados centígrados durante tres horas adicionales, recójalas por centrifugación a 5.000 veces g durante 20 minutos. Descongele la pastilla de células bacterianas y vuelva a suspenderla completamente en 45 mililitros de tampón de intercambio catiónico A, recién suplementado con 1x cóctel de inhibidores de proteasa DNasel 1.Altere las células bacterianas utilizando un homogeneizador de alta presión a 20.000 PSI, son necesarias de tres a cuatro pasadas para alterar adecuadamente las células. Centrifugar las células rotas a 20.000 veces g durante 40 minutos para eliminar el material insoluble. Caliente el extracto de células bacterianas durante 15 minutos a 75 grados centígrados usando un baño de agua.Se observará un precipitado blanco después de unos minutos. A continuación, centrifugar el extracto calentado a 15.000 veces g durante 20 minutos y mantener el sobrenadante que contiene la proteína tau estable al calor. A continuación, realice la cromatografía de intercambio catiónico en una resina CEX fuerte empaquetada como una columna de lecho de 5 mililitros utilizando un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas.Ajuste el caudal a 2,5 mililitros por minuto y equilibre la columna en tampón CEX A. A continuación, cargue el extracto de tau calentado de 60 a 70 mililitros con una bomba de muestra, recoja el flujo para analizarlo y verificar que la proteína tau se une de manera eficiente a la resina. Lave la resina con tampón CEX A hasta que la absorbancia a 280 nanómetros vuelva al valor de referencia.Programe el FPLC con un gradiente de hasta 25% de tampón CEX B en volúmenes de 10 columnas para alcanzar 250 milimolares de cloruro de sodio. Siga esto con un tampón CEX B al 50% en volúmenes de cinco columnas para alcanzar 500 milimolares de cloruro de sodio. Finalmente, aumente el gradiente al 100% de tampón CEX B en dos volúmenes de columna para alcanzar un molar de cloruro de sodio.Recoja fracciones de 1,5 mililitros durante las etapas de elución. A continuación, realice un intercambio de tampón en la tau que contiene fracciones agrupadas. Equilibre una columna de desalinización con un lecho empacado de resina G25 de 53 mililitros en tampón de bicarbonato de amonio de 15 milimolares utilizando un sistema FPLC.Ajuste el caudal a cinco mililitros por minuto e inyecte la muestra de tau en la columna a través de un circuito de inyección de cinco mililitros. Recoge las fracciones correspondientes al pico de absorción a 280 nanómetros. Agrupe todas las fracciones de tau antes de colocar la muestra en los tubos.Elija estos tubos de modo que el volumen de la solución sea pequeño en comparación con el volumen del tubo. A continuación, perfore los agujeros en los tapones de los tubos con una aguja antes de congelar las muestras de tau a menos 80 grados centígrados para su posterior liofilización. Solubilice cuatro miligramos de nitrógeno 15 liofilizado y carbono 13 erk tau fosforilado en 400 microlitros de tampón de RMN.Agregue un cinco por ciento de óxido de deuterio para el bloqueo de campo del espectrómetro de RMN y un TMSP milimolar como referencia de señal de RMN interna. Además, agregue 10 microlitros de una solución madre de 40 EK de un cóctel completo de inhibidores de proteasa. Transfiera la muestra en un tubo de RMN de cinco mililitros utilizando una jeringa electrónica con una aguja larga o utilizando una pipeta pasteur.Cierre el tubo de RMN con el émbolo. Elimine las burbujas de aire atrapadas entre el émbolo y el líquido moviendo el émbolo. Coloque el tubo de RMN en una ruleta.Utilice el calibre adecuado para ajustar su posición vertical en el spinner, de modo que la mayor parte de la solución de muestra esté dentro de la bobina de RMN. A continuación, inicie el flujo de aire en el instrumento de RMN haciendo clic en levantar en la ventana del sistema de control de imanes. Coloque con cuidado el spinner con el tubo en el flujo de aire en la parte superior del orificio del imán.Luego detenga el flujo de aire y deje que el tubo descienda a su lugar dentro de la cabeza de la sonda dentro del imán. Después de permitir que la muestra se equilibre a 25 grados centígrados, escriba ATMM en la línea de comandos para realizar el ajuste semiautomático y la coincidencia del cabezal de la sonda para optimizar la transmisión de potencia. A continuación, haga clic en bloquear en la ventana del sistema de control de imanes para activar el bloqueo de frecuencia de campo del espectrómetro.Inicie el procedimiento de calce para optimizar la homogeneidad del campo magnético en la posición de la muestra escribiendo primero TopShim GUI en la línea de comandos para abrir la ventana de calza. A continuación, haga clic en iniciar en la ventana de corrección. Compruebe la desviación estándar B0 residual para verificar que las cuñas son óptimas.A continuación, calibra el parámetro P1, que es la longitud de un pulso de radiofrecuencia de protones en microsegundos. Este parámetro es necesario para obtener una rotación de 90 grados de la magnetización del espín del protón. Apunta al pulso de 360 grados usando un espectro unidimensional de protones de agua.Ajuste el desplazamiento de frecuencia ajustando el parámetro O1 a la frecuencia del agua de protones en el espectro unidimensional. Finalmente, inicie la adquisición del espectro de protones unidimensional escribiendo ZG en la línea de comandos. Un resultado representativo de la purificación de tau recombinante muestra un pico de absorción importante a 280 nanómetros observado durante el gradiente de elución.Este pico corresponde a la proteína tau purificada como se ve en el gel de acrilamida sobre el cromatograma. El cromatograma para desalinizar la tau purificada recombinante muestra que el pico de absorción a 280 nanómetros y el pico de conductividad están bien separados, lo que garantiza que la desalinización de la proteína sea eficiente para el paso de liofilización. El espectro de RMN unidimensional de nitrógeno recombinante 15 tau a 900 megahercios confirma que se puede detectar una señal de RMN de la muestra de proteína.Una buena relación señal/ruido indica que los parámetros básicos de adquisición se han ajustado correctamente. El espectro bidimensional de la proteína fosforilada muestra buena resolución, las resonancias son estrechas y están bien separadas. Las resonancias en la región del espectro recuadrada en rojo corresponden a los residuos fosforilados.Después de ver este vídeo, debería ser capaz de producir una proteína recombinante con un etiquetado fácil de seleccionar, para purificar esta proteína y establecer el parámetro básico para la adquisición de datos de espectro. Una vez dominado, este protocolo se puede hacer en dos semanas si se organiza correctamente. No olvide que la espectroscopia de RMN utiliza imanes muy potentes a los que no se debe acercar con objetos metálicos.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que estas otras proteínas son sensibles a la lisis de proteasas y se deben tomar una serie de precauciones para evitar la degradación de la muestra. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos como la RMN de estado sólido para investigar los agregados similares a los amiloides que a menudo se forman por proteínas desordenadas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología química exploraran compuestos activos con potencial serapático en sistemas modelo in vitro.

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Bioquímica

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Espectroscopía de resonancia magnética nuclear para identificar múltiples fosforilaciones en proteínas

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Aprende a identificar múltiples fosforilaciones en proteínas intrínsecamente desordenadas mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear, utilizando la proteína Tau como modelo. Este método permite determinar sitios específicos de modificación y vincularlos con cambios estructurales y funcionales, proporcionando información valiosa para el desarrollo de terapias contra enfermedades neurodegenerativas.

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas (Video) | JoVE Journal

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

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