Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

El objetivo general de esta metodología es identificar la fosforilación múltiple de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear utilizando la proteína tau como caso de estudio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la regulación molecular relacionada con la enfermedad, como el impacto de la fosforilación en la interacción de la proteína con su socio molecular. La principal ventaja de esta técnica es que podemos identificar la fosforilación específica del sitio en una proteína desordenada y relacionarla con cambios estructurales y funcionales.

Este método puede proporcionar información sobre la función. También se puede aplicar a otras proteínas como los restos desordenados de la proteína ADN del virus aPtc Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia mediante el desarrollo de proteínas, inhibidores de la interacción proteica. Este método será demostrado por Clement Danis, Clement Despres, Luiza Bessa y Hamida Merzougui, los estudiantes de doctorado de nuestro grupo.

Para comenzar, mezcle suavemente 50 microlitros de células BL21 competentes con 100 nanogramos de ADN plasmídico, formando de 10 a 15 millones de colonias por microgramo de ADN plasmático en un tubo de plástico de 1,5 mililitros. Después de colocar la mezcla de células en hielo durante 30 minutos, aplíquela durante 10 segundos a 42 grados centígrados. A continuación, vuelva a colocar el tubo en hielo durante cinco minutos antes de añadir un mililitro de Luria Bertani o LB medio a temperatura ambiente.

Incubar la suspensión bacteriana a 37 grados centígrados durante 30 minutos bajo una agitación suave. Con un esparcidor, esparza 100 microlitros de la suspensión celular de manera uniforme sobre una placa de agar de medio LB que contenga 100 microgramos por mililitro de antibiótico ampicilina. Incubar la placa de selección durante 15 horas a 37 grados centígrados.

A continuación, solubilice 300 miligramos de medio enriquecido con nitrógeno 15 y carbono 13, un gramo de cloruro de amonio con nitrógeno 15 y dos gramos de glucosa marcada con carbono 13 en 10 mililitros de medio M9. Filtre: esterilice la solución de isótopos directamente en el medio M9 utilizando un filtro de 0,2 micras. Con una pipeta de pasteur, suspenda una colonia de bacterias transformadas en plasma recombinante de la placa de selección en 20 mililitros de medio LB, suplementado con 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Incubar el medio inoculado a 37 grados centígrados durante aproximadamente seis horas. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros o OD600 utilizando un mililitro de una dilución diez veces mayor de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico. A continuación, añada 20 mililitros del cultivo LB saturado a un litro de medio de crecimiento M9 suplementado con ampicilina en un matraz de cultivo con deflector de vidrio Erlenmeyer de dos litros.

Coloque el matraz de cultivo en una incubadora programable configurada a 10 grados centígrados y 50 RPM. Programe la incubadora para que cambie a 200 RPM y 37 grados centígrados temprano en la mañana del día siguiente. Mida el OD600 en un mililitro de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico.

Agregue 400 microlitros de una solución madre molar de IPTG cuando el OD600 alcance un valor de aproximadamente 1.0 para inducir la expresión de proteína tau recombinante. Después de incubar las células bacterianas a 37 grados centígrados durante tres horas adicionales, recójalas por centrifugación a 5.000 veces g durante 20 minutos. Descongele la pastilla de células bacterianas y vuelva a suspenderla completamente en 45 mililitros de tampón de intercambio catiónico A, recién suplementado con 1x cóctel de inhibidores de proteasa DNasel 1.

Altere las células bacterianas utilizando un homogeneizador de alta presión a 20.000 PSI, son necesarias de tres a cuatro pasadas para alterar adecuadamente las células. Centrifugar las células rotas a 20.000 veces g durante 40 minutos para eliminar el material insoluble. Caliente el extracto de células bacterianas durante 15 minutos a 75 grados centígrados usando un baño de agua.

Se observará un precipitado blanco después de unos minutos. A continuación, centrifugar el extracto calentado a 15.000 veces g durante 20 minutos y mantener el sobrenadante que contiene la proteína tau estable al calor. A continuación, realice la cromatografía de intercambio catiónico en una resina CEX fuerte empaquetada como una columna de lecho de 5 mililitros utilizando un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas.

Ajuste el caudal a 2,5 mililitros por minuto y equilibre la columna en tampón CEX A. A continuación, cargue el extracto de tau calentado de 60 a 70 mililitros con una bomba de muestra, recoja el flujo para analizarlo y verificar que la proteína tau se une de manera eficiente a la resina. Lave la resina con tampón CEX A hasta que la absorbancia a 280 nanómetros vuelva al valor de referencia.

Programe el FPLC con un gradiente de hasta 25% de tampón CEX B en volúmenes de 10 columnas para alcanzar 250 milimolares de cloruro de sodio. Siga esto con un tampón CEX B al 50% en volúmenes de cinco columnas para alcanzar 500 milimolares de cloruro de sodio. Finalmente, aumente el gradiente al 100% de tampón CEX B en dos volúmenes de columna para alcanzar un molar de cloruro de sodio.

Recoja fracciones de 1,5 mililitros durante las etapas de elución. A continuación, realice un intercambio de tampón en la tau que contiene fracciones agrupadas. Equilibre una columna de desalinización con un lecho empacado de resina G25 de 53 mililitros en tampón de bicarbonato de amonio de 15 milimolares utilizando un sistema FPLC.

Ajuste el caudal a cinco mililitros por minuto e inyecte la muestra de tau en la columna a través de un circuito de inyección de cinco mililitros. Recoge las fracciones correspondientes al pico de absorción a 280 nanómetros. Agrupe todas las fracciones de tau antes de colocar la muestra en los tubos.

Elija estos tubos de modo que el volumen de la solución sea pequeño en comparación con el volumen del tubo. A continuación, perfore los agujeros en los tapones de los tubos con una aguja antes de congelar las muestras de tau a menos 80 grados centígrados para su posterior liofilización. Solubilice cuatro miligramos de nitrógeno 15 liofilizado y carbono 13 erk tau fosforilado en 400 microlitros de tampón de RMN.

Agregue un cinco por ciento de óxido de deuterio para el bloqueo de campo del espectrómetro de RMN y un TMSP milimolar como referencia de señal de RMN interna. Además, agregue 10 microlitros de una solución madre de 40 EK de un cóctel completo de inhibidores de proteasa. Transfiera la muestra en un tubo de RMN de cinco mililitros utilizando una jeringa electrónica con una aguja larga o utilizando una pipeta pasteur.

Cierre el tubo de RMN con el émbolo. Elimine las burbujas de aire atrapadas entre el émbolo y el líquido moviendo el émbolo. Coloque el tubo de RMN en una ruleta.

Utilice el calibre adecuado para ajustar su posición vertical en el spinner, de modo que la mayor parte de la solución de muestra esté dentro de la bobina de RMN. A continuación, inicie el flujo de aire en el instrumento de RMN haciendo clic en levantar en la ventana del sistema de control de imanes. Coloque con cuidado el spinner con el tubo en el flujo de aire en la parte superior del orificio del imán.

Luego detenga el flujo de aire y deje que el tubo descienda a su lugar dentro de la cabeza de la sonda dentro del imán. Después de permitir que la muestra se equilibre a 25 grados centígrados, escriba ATMM en la línea de comandos para realizar el ajuste semiautomático y la coincidencia del cabezal de la sonda para optimizar la transmisión de potencia. A continuación, haga clic en bloquear en la ventana del sistema de control de imanes para activar el bloqueo de frecuencia de campo del espectrómetro.

Inicie el procedimiento de calce para optimizar la homogeneidad del campo magnético en la posición de la muestra escribiendo primero TopShim GUI en la línea de comandos para abrir la ventana de calza. A continuación, haga clic en iniciar en la ventana de corrección. Compruebe la desviación estándar B0 residual para verificar que las cuñas son óptimas.

A continuación, calibra el parámetro P1, que es la longitud de un pulso de radiofrecuencia de protones en microsegundos. Este parámetro es necesario para obtener una rotación de 90 grados de la magnetización del espín del protón. Apunta al pulso de 360 grados usando un espectro unidimensional de protones de agua.

Ajuste el desplazamiento de frecuencia ajustando el parámetro O1 a la frecuencia del agua de protones en el espectro unidimensional. Finalmente, inicie la adquisición del espectro de protones unidimensional escribiendo ZG en la línea de comandos. Un resultado representativo de la purificación de tau recombinante muestra un pico de absorción importante a 280 nanómetros observado durante el gradiente de elución.

Este pico corresponde a la proteína tau purificada como se ve en el gel de acrilamida sobre el cromatograma. El cromatograma para desalinizar la tau purificada recombinante muestra que el pico de absorción a 280 nanómetros y el pico de conductividad están bien separados, lo que garantiza que la desalinización de la proteína sea eficiente para el paso de liofilización. El espectro de RMN unidimensional de nitrógeno recombinante 15 tau a 900 megahercios confirma que se puede detectar una señal de RMN de la muestra de proteína.

Una buena relación señal/ruido indica que los parámetros básicos de adquisición se han ajustado correctamente. El espectro bidimensional de la proteína fosforilada muestra buena resolución, las resonancias son estrechas y están bien separadas. Las resonancias en la región del espectro recuadrada en rojo corresponden a los residuos fosforilados.

Después de ver este vídeo, debería ser capaz de producir una proteína recombinante con un etiquetado fácil de seleccionar, para purificar esta proteína y establecer el parámetro básico para la adquisición de datos de espectro. Una vez dominado, este protocolo se puede hacer en dos semanas si se organiza correctamente. No olvide que la espectroscopia de RMN utiliza imanes muy potentes a los que no se debe acercar con objetos metálicos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que estas otras proteínas son sensibles a la lisis de proteasas y se deben tomar una serie de precauciones para evitar la degradación de la muestra. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos como la RMN de estado sólido para investigar los agregados similares a los amiloides que a menudo se forman por proteínas desordenadas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología química exploraran compuestos activos con potencial serapático en sistemas modelo in vitro.