Prueba de la capacidad vascular invasiva de células cancerosas en el pez cebra (

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el comportamiento maligno e invasivo de las células cancerosas en un modelo de embrión de pez cebra. Este método ayuda a los investigadores a determinar si las células cancerosas pueden invadir desde un sistema circulatorio funcional, modelando así un paso clave en la cascada metastásica. La principal ventaja de esta técnica es que el modelo de embrión de pez cebra proporciona esta evaluación y un tiempo de respuesta más corto que los experimentos similares que a menudo se realizan en ratones.

El Dr. Eric Glasgow, que dirige las instalaciones centrales de pez cebra en la Universidad de Georgetown, demostrará el procedimiento. Después de preparar las células cancerosas, los reactivos y los embriones de pez cebra de acuerdo con el protocolo de texto, conecte el sistema dispensador de microinyección a una fuente de aire presurizado y encienda la fuente de alimentación. Pruebe la presión pisando el pedal.

Un breve pulso de aire debe salir del portaagujas. Agregue 20 mililitros de solución de tricaína 2X a una placa de inyección y coloque la placa en un agitador para equilibrarla. A continuación, repita el equilibrio con una segunda alícuota de 2X Tricaína.

A continuación, utilice una pipeta de plástico para transferir un grupo de embriones a un plato pequeño que contenga 2X solución de tricaína. Con una punta de carga de gel, rellene la aguja de microinyección con células cancerosas. Coloque la aguja en un frasco de almacenamiento de electrodos con el extremo puntiagudo hacia abajo para que las células se asienten cerca de la punta.

Transfiera de 20 a 30 embriones anestesiados a una placa de inyección recolectando embriones con abundante 2X Tricaine en una pipeta de plástico. Deje que los embriones se fijen en la punta de la pipeta y, a continuación, expulse suavemente los embriones en el canal de la placa de inyección, esparciendo los embriones a lo largo del canal. Alinee los embriones con la cabeza hacia arriba y el vientre hacia la pared empinada del comedero.

Coloque la aguja en el portaagujas del micromanipulador. A continuación, coloque la placa de inyección debajo del estereoscopio con la pared de 60 grados a la izquierda y enfoque el embrión superior con un aumento de 25X. Coloque el micro manipulador de modo que cuando se extienda la aguja perfore el embrión.

A continuación, extienda la aguja a ojo hasta que esté casi tocando el embrión. Ahora, mientras mira bajo el microscopio, alinee la aguja contra el embrión. Para inyectar las células, perfore el embrión a través del saco vitelino.

Pise el pedal, colocando la punta justo en el seno precardíaco, pero no dentro. La fuerza de la inyección expulsará las células hacia el seno cardíaco. Alternativamente, la inyección de células en el saco vitelino permite el estudio de diferentes facetas de la invasión vascular como se describe en el manuscrito.

Con la mano derecha, extienda y retraiga la aguja de inyección. Con la mano izquierda, haga ajustes finos para colocar el siguiente embrión. Cuando se inyecte toda la placa, regrese la aguja al frasco de almacenamiento de electrodos.

Para transferir los embriones a la placa de recuperación, incline la placa de inyección para tirar de los embriones en la parte inferior, lave los embriones fuera del comedero y use la pipeta de plástico para recogerlos. Deje que los embriones se asienten en el fondo de la pipeta, luego transfiera los embriones a la placa de recuperación en una cantidad mínima de tricaína. Incubar la placa de recuperación a 28 grados centígrados durante una hora, antes de separar los embriones viables de los embriones muertos y los desechos.

Incubar el plato a 33 grados centígrados hasta que esté listo para marcar. Después de anestesiar un lote de embriones para ser puntuados, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque una larva anestesiada en un portaobjetos de microscopio de depresión en una gota de Tricaína. Oriente las larvas lateralmente para obtener una imagen óptima de la región caudal.

Coloque el portaobjetos en un microscopio de fluorescencia compuesta con una lente de objetivo 10X. Puntúe las larvas contando el número de células cancerosas que han invadido con éxito fuera de la vasculatura enfocándose hacia arriba y hacia abajo a través de la región de la cola para discernir claramente las células intactas. Derrita la solución de garosa tricaína al 1,5% y llévela a 37 grados centígrados.

Después de anestesiar los embriones, como antes, transfiera un embrión en una gota de solución de tricaína a la superficie de la imagen. Utilice una pipeta de vidrio para eliminar el exceso de solución de tricaína que retiene el embrión en la superficie de la imagen. A continuación, superponga una gota de solución de agarosa derretida sobre el embrión.

Trabajando rápidamente, antes de que la agarosa se polimerice, use una herramienta delicada como un cepillo de pestañas para orientar el embrión lateralmente para la obtención de imágenes, teniendo especial cuidado para asegurarse de que el embrión esté aplanado a lo largo de la superficie de la imagen. Cuando la gota de agarosa se haya polimerizado, sumérjala en una solución de tricaína. Finalmente, someta el embrión vivo de pez cebra a imágenes microscópicas.

De las siete líneas celulares de cáncer de mama probadas por su capacidad vascular invasiva en embriones de pez cebra, la línea celular MDA-MB-231 exhibió el mayor número de células cancerosas extravasadas por embrión cuando se evaluó, 96 horas después de la inyección. También se observó que las células BT-474 invadían fácilmente la región caudal de los embriones, mientras que otras líneas celulares como las células MCF-7, SK-BR-3 y T-47D eran mínimamente invasivas. En un ensayo modificado que utiliza un sitio de inyección diferente, se llevó a cabo un experimento de competencia en el que dos poblaciones de células MDA-MB-231, que difieren en su capacidad vascular invasiva, se inyectaron simultáneamente en el saco vitelino de embriones en desarrollo.

Al realizar la evaluación, se determinó que las células MDA-MB-231 propagadas en condiciones de cultivo confluente antes de la inyección, mostraron una reducción en la intravasación en la circulación y, por lo tanto, tuvieron una presencia reducida en la región caudal de los embriones. Una vez dominadas, las inyecciones de embriones de pez cebra se pueden realizar en cuatro horas si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe emplear criterios rigurosos y consistentes al calificar la extravasación de células cancerosas.

Siguiendo este procedimiento, los resultados se pueden validar aún más en un modelo murino. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar las inyecciones y marcar la extravasación, lo que permite probar la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas en embriones de pez cebra.