Name: Inoculador Anopheles gambiae Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a inocular mosquitos Anopheles gambiae con microesferas para inducir y cuantificar la respuesta inmune de melanización. Esta técnica permite evaluar la inmunidad en invertebrados.

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Esta investigación fue posible gracias a la financiación de la Universidad de Neuchâtel. Nos gustaría agradecer a todos los estudiantes que ayudaron a mejorar esta técnica, especialmente a nuestro colega Kevin Thievent. También nos gustaría agradecer a los miembros del Laboratorio Thomas por poner a disposición su laboratorio. Nos gustaría agradecer a Janet Teeple por su ayuda con la cría de mosquitos. También nos gustaría agradecer a Loyal Hall en el laboratorio del Pr. Tom Baker por su ayuda en la preparación de los tubos de vidrio microcapilar.

1. Solución salina para inyección y disección <ol><li> Preparar la solución salina mediante la adición de NaCl, KCl, CaCl 2 y a agua destilada para obtener NaCl 1,3 mM, KCl 0,5 mM, y CaCl 0,2 mM 2 a pH = 6,8. </li><li> Añadir 1 ml de solución de verde 0,1% de metilo a 99 mililitros de la solución salina para colorear las perlas transparentes. Esta es la &quot;solución de inyección&quot; de 0,001% verde de metilo. </li><li> A continuación, añadir 5 ml de solución de verde 0,1% de metilo a 45 ml de la solución salina. Esta &quot;solución disección&quot; 0,01% verde de metilo es de 10 veces más concentrado en verde de metilo para facilitar la coloración de las perlas y su observación durante la disección. NOTA: Filtro de esterilizar el tampón si es necesario. </li></ol> 2. Preparación Capilar <ol><li> Tubos de vidrio capilar se Heat-pull para obtener una punta muy fina ligeramente más grandes que los granos más pequeños (φ = 40 micras) 42. </li><li> Abierta y unaJUSTE cada capilar rompiendo la punta con unas pinzas o por aserrado la punta fuera. </li></ol> 3. Mosquito Crianza <ol><li> Trasera A. gambiae a 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% de humedad relativa, y una luz 12:12 h: oscuridad ciclo. Mantenga las hembras adultas y darles acceso a una solución de azúcar al 10%. </li></ol> 4. Selección del grano con el capilar <ol><li> Verter 0.009 g de perlas cargadas negativamente (40 a 120 micras de diámetro) en un plato de Petri de 5 cm y añadir 5 ml de solución de inyección 30 min con antelación. NOTA: El objetivo es permitir que el tinte de color Las cuentas para hacer la selección del grano para la inyección más fácil. Autoclave las cuentas si no vienen en un frasco estéril. </li><li> El uso de un capilar montado en un bulbo de pipeta capilar, seleccionar visualmente el grano más pequeño en 0,1 l de la solución salina con un microscopio binocular. NOTA: Cuando la inoculación de varias cuentas al mismo tiempo, seleccione tres cuentas de un volumen total de 0,1 l.</li></ol> 5. Manejo del mosquito y la inoculación <ol><li> El uso de un aspirador de insectos, coloque cada mosquito en un tubo de 50 ml. </li><li> Chill cada mosquito brevemente colocando el tubo en hielo triturado (2-5 min). </li><li> Coloque un mosquito en su lado derecho bajo el microscopio binocular. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, inocular el mosquito con el capilar por firmemente perforación a través de la parte izquierda de la cutícula cavidad torácica y luego inyectar el líquido y el talón. NOTA: Tenga cuidado de no dañar los músculos de vuelo mediante la celebración de los capilares como perpendicularmente al mosquito como sea posible. </li><li> Retire el capilar. </li><li> El uso de pinzas entomología de peso pluma, colocar cada mujer individualmente en un vaso de plástico de 180 ml cubierto con un mosquitero; darles acceso a una solución de azúcar al 10%. NOTA: Se debe tener precaución con la solución de azúcar, como el mosquito puede quedar atrapado en gotas de la solución azucarada. </li></ol> 6. MosquitoLa disección y Fotografía del grano <ol><li> Compruebe si los mosquitos están vivos 24 horas después de la inoculación. Si es así, comprobar su estado y mantener sólo los mosquitos que son capaces de volar. </li><li> Congelación de estos mosquitos a -20 ° C. NOTA: Se pueden conservar varios días a meses antes de la disección, si es necesario. </li><li> Retire las alas de los mosquitos utilizando pinzas bajo un microscopio binocular en la ampliación de 32X. Fijar las alas en portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva transparente. Anote el código utilizado para cada individuo de mosquitos. </li><li> Ponga los portaobjetos de vidrio en un escáner y escanearlas a 1.200 dpi. NOTA: Compruebe que el código es legible para cada individuo de mosquitos. </li><li> En un portaobjetos de microscopio de vidrio y en la solución de la disección, el uso de fórceps para separar el tórax de la cabeza y el abdomen. </li><li> Abrir el tórax con una pinza para recuperar las perlas. NOTA: los granos que no se mueven en el abdomen, no están en contacto entre sí y la mayoría de ellos flotan libremente en tque hemolinfa. Tenga cuidado de no romper el cordón con las pinzas, como una perla no melanized puede ser difícil de encontrar. Espere 1 a 5 min para los granos para obtener color. </li><li> La transferencia de los granos en una gota de la solución de la disección en un portaobjetos de vidrio, antes de tomar la fotografía. NOTA: No es necesario lavar las perlas. </li><li> El uso de un microscopio equipado con una cámara, tomar una imagen digital de cada perla con un ajuste de la iluminación estándar y una ampliación de 400X. NOTA: No cambie la iluminación entre las diferentes imágenes para permitir su comparación. </li></ol> 7. Análisis de la foto: Bead melanización <ol><li> Abra el software de análisis de imágenes. Haga clic en &quot;archivo&quot; y luego en &quot;abrir&quot; para encontrar una imagen de perlas. </li><li> Haga clic en &quot;Analizar&quot;. Haga clic en &quot;mediciones establecidas.&quot; Marque la casilla &quot;valor medio gris&quot; en la ventana de &quot;medidas de ajuste&quot;. </li><li> Haga clic en el icono de la herramienta de selección círculo. Seleccione el perímetro del talón; permanecer enlado del talón y evitar el halo luminoso alrededor de ella. </li><li> Haga clic en el menú &quot;Analizar&quot;. Haga clic en &quot;medida&quot;. Obtener el valor de gris medio y el tamaño del área de sección transversal de la perla. <ol><li> Para obtener el valor melanización de cada cuenta, realice la siguiente operación usando una calculadora o calculadora de software: &quot;256 - valor medio gris.&quot; La medida melanización es un valor entre 0 y 256, donde 0 representa una imagen totalmente blanco. </li></ol></li></ol>

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<li>Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+maternal+effects+after+stimulation+of+the+melanization+response+in+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).</li>
<li>Paskewitz, S., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Plasmodium+refractory+and+susceptible+strains+of+Anopheles+gambiae+to+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+comp+immunol%22%5BJournal%5D)">Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads.</a> Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Esta técnica de inyección es útil para estimular y estudiar la melanization respuesta en los mosquitos. Por ejemplo, aquí se estudió el efecto de la carga de estímulos inmune. El paso crítico en este procedimiento es para inocular apropiadamente el mosquito. Cualquier daño excesivo a los músculos de vuelo o al propio mosquito puede prevenir el mosquito de la alimentación o puede acabar con él antes de la disección. Un segundo paso clave es mantener a los mosquitos en el hielo el tiempo sufic...

Los insectos se basan en las respuestas inmunitarias para protegerse contra los parásitos y patógenos 1 - 3 que violan a través de su cutícula o el epitelio del intestino medio 4. En los mosquitos, estas respuestas son eficaces contra las bacterias, virus 5 6 7 filaria, nematodos, parásitos de la malaria y 1,8,9. En los mosquitos, una respuesta inmune clave es la encapsulación de partículas extrañas con melanina 10 - 12. Esta encapsulación puede ocurrir en el intestino medio o en la hemolinfa sistema de circulación de 10 a 12. Este melanization respuesta es el resultado de la pro-fenoloxidasa cascada 10 - 12, y puede conducir a la muerte de los parásitos o para su fagocitosis. En los mosquitos adultos, donde el número de células de hemocitos es limitado, melanización es una respuesta humoral, al igual que contra los parásitos Plasmodium o nematodos filarias 7.En algunos otros insectos, que está directamente las células de hemocitos que se reúnen alrededor del parásito a melanize ellas 7. Además, la melanina es también esencial para varios otros procesos fisiológicos como la producción de huevos y heridas de cicatrización de la cutícula 7. La estimulación de la respuesta inmune se utiliza como una herramienta para estudiar la inmunidad de insectos en varios sistemas modelo de salud pública agrícola y 13 - 18. Se utiliza en los mosquitos Anopheles gambiae, el principal vector de la malaria en África, para estudiar las interacciones huésped-parásito 14 - 16,19. Estas técnicas se basan en la capacidad de los insectos para detectar parásitos con sus receptores de reconocimiento de patrones (PRR) 2. Los mosquitos también pueden detectar otras moléculas que interfieren con su biología, tales como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), o detectar sus propias células dañadas debido a la liberación de colágeno y ácidos nucleicos. La célula inmune mosquitos tales como los hemocitos se utilizan para la detección de 20 - 23. Las principales vías de señalización son inmunes IMD, peaje, JAK / STAT 24, y la interferencia de ácido ribonucleico (RNAi) 25,26. Tanto peaje y vías IMD influyen en la melanization respuesta e interactúan con el pro-fenoloxidasa en cascada 10 - 12. La herramienta estándar que se utiliza para estimular la respuesta melanización es la inoculación de un mosquito con una pequeña gota en la hemolinfa de la cavidad torácica. El grado de encapsulación de melanina a continuación, se puede medir 19 después de recuperar el cordón a través de la disección del mosquito. En la mayoría de estudios, sólo un talón se inyectó por mosquito 15,16,27, pero la inyección de más cuentas es posible con el fin de estudiar los límites de la respuesta melanización 19. Estas perlas se inyectan usando una solución de inyección (suero fisiológico) para limitar la perturbación de la fisiología y mosquitola desecación del mosquito 15,16,27. Un colorante se añade a esta solución para facilitar la selección de perlas. Es lo mismo para la solución de disección se utiliza para recuperar el 15,16,27 talón. La ventaja de la inoculación de los insectos con los estímulos no patógena es la capacidad de concentrarse en el efecto directo sobre la respuesta inmune. No hay efectos que complican debido a la patogenicidad del parásito 28, inmunosupresión 29 - 31, o el 31 de evasión inmune - de 34. Además, las consecuencias de las estimulaciones en otros rasgos de historia de vida, tales como la longevidad o la fecundidad, pueden también ser estudiados. Por lo tanto, los investigadores que estudian la ecología evolutiva pueden requerir este tipo de herramientas 2,35,36. Por ejemplo, los abejorros inmuno-desafió tienen una vida más corta en virtud de la inanición. efectos negativos similares de estímulos inmunes y las implementaciones se han observado en diferentes modelos de invertebrados, a menudo resulta en un cortoer vida útil o el éxito reproductivo menos 13,27,37. Tales estudios pueden llevarse a cabo en diversos entornos 2,4,38. Estimular la inmunidad es también de interés para los que se centran directamente en la inmunopatología 39,40. Este protocolo se basa en la inoculación de los granos con los mosquitos para estimular la respuesta melanización y directamente medir la cantidad de melanina. Esto permite el estudio cuantitativo y cualitativo de la melanization respuesta en diferentes parámetros experimentales. Tal herramienta se puede extender a la estimulación de otras respuestas inmunes, tales como la respuesta a las bacterias antibacteriano 41 muertos por calor. También puede llevarse a cabo en muchos entornos ecológicos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de vidrio microcapilar GB120TF-10</td><td>science-products.com</td><td>GB120TF-10</td><td>http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html</td></tr><tr><td>Microcaps Bulbo de pipeta capilar</td><td>Drumond</td><td>1-000-9000</td><td></td></tr><tr><td>cargado negativamente Sephadex CM C-25 perlas</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania</td><td>C25120 SIGMA</td><td>necesita pocos para comenzar</td></tr><tr><td>Verde</td> <td>de metiloSigma-Aldrich</td><td>323829 ALDRICH</td><td>necesitan pocos para iniciar</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>opensource</td><td></td><td>versión 1.47f7 o posterior</td></tr></tbody></table>

inoculador<em&gt; anopheles gambiae</em&gt; los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

La estimulación de la respuesta inmune es una herramienta común en estudios de invertebrados para examinar la eficacia y los mecanismos de la inmunidad. Esta estimulación se basa en la inyección de partículas no patógenos en los insectos, como las partículas serán detectados por el sistema inmune y inducirán la producción de efectores inmunes. Nos centramos aquí en la estimulación de la respuesta melanización en el mosquito Anopheles gambiae. Los resultados melanization respuesta en la encapsulación de partículas extrañas y parásitos con una capa oscura de melanina. Para estimular esta respuesta, los mosquitos se inoculan con los granos en la cavidad torácica utilizando tubos de vidrio microcapilar. Entonces, después de 24 horas, los mosquitos se disecan para recuperar las perlas. El grado de melanización de la perla se mide usando software de análisis de imágenes. Perlas no tienen los efectos patógenos de los parásitos, o su capacidad para evadir o suprimen la respuesta inmune. Estas inyecciones son una manera de Measure eficacia inmunológica y el impacto de los estímulos inmunes en otros rasgos de historia de vida, tales como la fecundidad o la longevidad. No es exactamente lo mismo que estudiar directamente las interacciones huésped-parásito, pero es una interesante herramienta para estudiar la inmunidad y su ecología evolutiva.

<html> Los mosquitos no todos hicieron melanize las perlas de la misma manera, ya que algunas cuentas fueron cubiertas con menos melanina que otros (Figura 1). De hecho, algunas perlas permanecieron azul debido a la falta de melanización, mientras que otros eran completamente oscuro (Figura 1). El valor melanización fue estandarizado por interpolación lineal a un valor entre 0 (lo que correspondía a una perla azul y unmelanized) y 100 (que corresponde a u...

A través de la inoculación con perlas, la técnica descrita permite la estimulación de la respuesta de melanización del mosquito en el sistema circulante de la hemolinfa. La cantidad de melanina que cubre las perlas se puede medir después de la disección como una medida de la respuesta inmunitaria.

Inoculador<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

El objetivo general de esta técnica de inoculación es estimular la respuesta inmunitaria del mosquito y medir la reacción de melanización. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la inmunología ecológica, incluida la base genética del costo de la respuesta humana y la influencia de los factores ambientales. Aunque este método puede proporcionar información sobre la respuesta a la inmunización, también se puede aplicar a otros sistemas, como la respuesta antiviral o antibacteriana en otros sistemas de invertebrados.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al daño de los insectos que puede causar la inyección. Agregue un mililitro de solución de verde de metilo al 0,1% a 99 mililitros de la solución salina para colorear las perlas transparentes. Esta es la solución de inyección de verde de metilo al 0,001%.A continuación, añada cinco mililitros de solución de verde de metilo al 0,1% a 45 mililitros de solución salina. Esta solución de disección al 0,01% de verde de metilo está 10 veces más concentrada en verde de metilo para facilitar la coloración de las perlas y su observación durante la disección. Autoclave las soluciones

inoculating-anopheles-gambiae-mosquitoes-with-beads-to-induce-measure

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los mosquitos Anopheles stephensi son vectores de la malaria que habitan en la India y en toda Asia. Este video muestra la técnica para la realización de micro-inyecciones de esta especie con transgenes que confieren resistencia a la malaria a los mosquitos. Gran parte de la metodología se demuestra en este vídeo es aplicable a las técnicas de microinyección de otras especies de mosquitos.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

Este video muestra un ensayo para inmunizar un modelo de ratón con esporozoítos vivos atenuados. Los esporozoítos de Plasmodium atenuados por radiación se inyectan en la cara dorsal de la oreja del ratón. Después de las inyecciones en múltiples ubicaciones en ambos oídos, se permite que el ratón se recupere.

Inmunización intradérmica con esporozoítos vivos atenuados en un modelo de ratón

La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Describimos aquí un protocolo para aislar células mieloides de la piel del ratón y drenar el ganglio linfático después de la inyección intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. La citometría de flujo de las células recolectadas proporciona un ensayo confiable para caracterizar la respuesta inflamatoria de la piel y los ganglios linfáticos de drenaje al parásito.

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em&gt; Plasmodium</emLos esporozoitos&gt;

Describimos un modelo de ratón de malaria cerebral experimental y mostramos cómo se puede rastrear la patología inflamatoria y microvascular in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Aprende a inocular mosquitos Anopheles gambiae con microesferas para inducir y cuantificar la respuesta inmune de melanización. Esta técnica permite evaluar la inmunidad en invertebrados.

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