Name: Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a generar células T reguladoras FOXP3+ inducidas a partir de células T CD4+ naïve humanas mediante un protocolo con TGF-β. Este método permite estudiar la diferenciación y fenotipado de iTregs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nina Nagel es agradecida por su asistencia técnica durante el rodaje del vídeo y la preparación experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss por su ayuda con el protocolo de tinción intracelular FOXP3 y a Elisabeth Suri-Payer y Nina Oberle por establecer el protocolo de aislamiento nTreg. Matilda Eriksson y Peri Noori son reconocidas por la gestión del laboratorio. 
Financiación: A.S. fue apoyado por una beca intraeuropea Marie Curie dentro del 7º Programa Marco de la Comunidad Europea, la Fundación Dr. Åke Olsson y las fundaciones de investigación KI; A.S. y J.T. fueron apoyados por una beca CERIC (Centro de Excelencia para la Investigación en Inflamación y Enfermedades Cardiovasculares), J.T. fue apoyado por Vetenskapsrådet Medicina y Salud (Dnr 2011-3264), Fundación Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance y Consejo del Condado de Estocolmo.

<ol><li>Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+history+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: history and perspective.</a> Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).</li>
<li>DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FoxP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+cancer%3A+A+critical+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Can+Res%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature.</a> Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).</li>
<li>Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Regulatory+T+Cells+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Regulatory T Cells in Tumors.</a> FEBS J. , (2016).</li>
<li>Trzonkowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-man+clinical+results+of+the+treatment+of+patients+with+graft+versus+host+disease+with+human+ex+vivo+expanded+CD4%2BCD25%2BC%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C.</a> Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117, 1061-1070 (2011).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117, 3921-3928 (2011).</li>
<li>Edinger, M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+in+stem+cell+transplantation%3A+strategies+and+first+clinical+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences.</a> Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+induction+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis.</a> J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requisite+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+based+on+expanding+antigen+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity.</a> Immunity. 35, 109-122 (2011).</li>
<li>Abbas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+recommendations+to+simplify+the+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature.</a> Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).</li>
<li>Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+adaptive+foxp3%2B+regulatory+T+cells%3A+more+of+the+same+or+a+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor.</a> Immunity. 30, 626-635 (2009).</li>
<li>Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+FOXP3+expression%3A+the+key+to+a+stable+regulatory+T-cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).</li>
<li>Schmitt, E. G., Williams, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+function+of+induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and function of induced regulatory T cells.</a> Front Immunol. 4, 152(2013).</li>
<li>Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regulatory+T-cells%3A+a+state+attained+by+all+activated+human+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells.</a> Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).</li>
<li>Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+FOXP3+in+human+activated+nonregulatory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+lineage+commitment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance.</a> Immunity. 30, 616-625 (2009).</li>
<li>Sun, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.Exp.Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Coombes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+specialized+population+of+mucosal+CD103%2B+DCs+induces+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+via+a+TGF-beta+and+retinoic+acid-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism.</a> J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).</li>
<li>Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+metabolites+induce+gut-homing+FoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells.</a> J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).</li>
<li>Mucida, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+can+directly+promote+TGF-beta-mediated+Foxp3%28%2B%29+Treg+cell+conversion+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells.</a> Immunity. 30, 471-472 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Protocols+to+Induce+Human+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells+by+Combinations+of+IL-2%2C+TGF-beta%2C+Retinoic+Acid%2C+Rapamycin+and+Butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate.</a> PloS one. 11 (2), 0148474(2016).</li>
<li>Furusawa, Y., Obata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">regulatory T cells.</a> Nature. 504, 446-450 (2013).</li>
<li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T-cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation.</a> Nature. 504, 451-455 (2013).</li>
<li>Battaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+promotes+expansion+of+functional+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+of+both+healthy+subjects+and+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients.</a> J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).</li>
<li>Hippen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+ex+vivo+expansion+of+human+natural+regulatory+T+cells+%28T%28regs%29%29+with+minimal+loss+of+in+vivo+functional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity.</a> Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophages+induce+CD4%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+via+binding+and+re-release+of+TGF-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+cell+biol%22%5BJournal%5D)">Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β.</a> Immunol cell biol. , (2016).</li>
<li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+in+the+human+FOXP3+locus+discriminates+regulatory+T+cells+from+activated+FOXP3%28%2B%29+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+rapidly+suppress+T+cell+receptor-induced+Ca%282%2B%29%2C+NF-kappaB%2C+and+NFAT+signaling+in+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells.</a> Sci. Signal. 4, 90(2011).</li>
<li>Ohkura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+stimulation-induced+epigenetic+changes+and+Foxp3+expression+are+independent+and+complementary+events+required+for+Treg+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development.</a> Immunity. 37, 785-799 (2012).</li>
<li>Hill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+Foxp3+induction+indirectly+by+relieving+inhibition+from+CD4%2BCD44hi+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells.</a> Immunity. 29, 758-770 (2008).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Sulfide+Promotes+Tet1-+and+Tet2-Mediated+Foxp3+Demethylation+to+Drive+Regulatory+T+Cell+Differentiation+and+Maintain+Immune+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis.</a> Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).</li>
<li>Yue, X., Trifari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Foxp3+stability+through+modulation+of+TET+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity.</a> The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).</li>
<li>Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Facilitates+Demethylation+of+the+Foxp3+Enhancer+in+a+Tet-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner.</a> J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).</li>
<li>Geiger, T. L., Tauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+nurture+in+Foxp3+%2B+regulatory+T+cell+development%2C+stability%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function.</a> Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-induced+CD4%2BFoxp3%2B+T+cells+attenuate+acute+graft-versus-host+disease+by+suppressing+expansion+and+killing+of+effector+CD8%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells.</a> J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells.</a> Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).</li>
<li>McMurchy, A. N., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+assays+with+human+T+regulatory+cells%3A+a+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide.</a> Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).</li>
<li>Mutis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+control+xenogeneic+graft-versus-host+disease+induced+by+autologous+T+cells+in+RAG2-%2F-gammac-%2F-+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+cancer+res%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice.</a> Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).</li>
<li>Tran, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+assay+for+functional+assessment+of+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells.</a> Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).</li>
<li>Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Suppression+of+Cytokine+Transcription+in+Human+CD4%2BCD25+T+Cells+by+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells%3A+Independence+of+IL-2+Consumption%2C+TGF-beta%2C+and+Various+Inhibitors+of+TCR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling.</a> J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).</li>
<li>Shevach, E. M., Thornton, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tTregs%2C+pTregs%2C+and+iTregs%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences.</a> Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito permite la inducción robusto de CD4 humano + FOXP3 + iTregs de células T CD4 + vírgenes humanos. Incluye un nuevo protocolo que describimos hace poco, el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina, para la inducción de iTregs con superiores función supresora in vitro 22. En comparación con otros protocolos publicados, otra ventaja es la inducción de diferentes poblaciones iTreg en paralelo por diferentes protocolos, lo que permite la comparación directa de los...

Células T reguladoras CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) suprimen otras células inmunes y son mediadores críticos de la tolerancia periférica, la autoinmunidad y la prevención de la inflamación excesiva 1. La importancia de las células T reguladoras se ejemplifica por la enfermedad humana y el síndrome ligada al cromosoma X immunodysregulation poliendocrinopatía enteropatía (IPEX), en el que la pérdida de células T reguladoras debido a mutaciones en el `master&#39; factor de transcripción caja forkhead P3 Treg (FOXP3) conduce a la enfermedad autoinmune sistémica grave, letal a una edad temprana. Sin embargo, las células T reguladoras actuar como una espada de doble filo en el sistema inmunológico, ya que también pueden obstaculizar la inmunidad antitumoral en ciertas configuraciones 2. La manipulación terapéutica del número y función de Treg es, por tanto, objeto de numerosas investigaciones clínicas. En el cáncer, agotamiento de las células T reguladoras puede ser deseable y algo de éxito de los enfoques clínicos alienta además a la investigación 3. En las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, además de los efectos terapéuticos de células T reguladoras en sevemodelos de enfermedad del ratón ral, los últimos primeros ensayos en el hombre de la transferencia adoptiva de Treg para prevenir la enfermedad injerto contra -host (EICH) 4 - 7 y para evaluar la seguridad en el tratamiento de la diabetes tipo 1 8 mostró resultados muy prometedores. De origen natural Treg (nTregs) comprenden tTregs del timo derivados y pTregs periférica inducida, con funciones esenciales no redundantes en el mantenimiento de salud 9 - 11. Sin embargo, los números nTreg son limitados, fomentando el enfoque complementario de inducir Tregs (iTregs) in vitro a partir precursores de células T ingenuas 12. Aún así la estabilidad de iTregs, presumiblemente debido a la falta de la desmetilación en la llamada región desmetilado Treg-específico (TSDR) en el locus del gen FOXP3 13, sigue siendo una preocupación y varios estudios indican que in vivo inducida por células T reguladoras son más estables 14. Hasta la fecha, FOXP3 sigue siendo la mejor proteína MArker para Tregs pero no es absolutamente específico porque las células CD4 + CD25- T convencionales humanos transitoriamente expresan niveles intermedios de FOXP3 tras la activación 15,16. Aunque se han hecho progresos significativos en el esclarecimiento de la regulación de la expresión de FOXP3, aún queda mucho por descubrir en cuanto a la inducción, la estabilidad y la función de FOXP3 en particular en las células humanas. A pesar de las diferencias a nTregs, in vitro inducida FOXP3 + células T CD4 + se pueden utilizar como un sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de inducción FOXP3 y como punto de partida para desarrollar protocolos en el futuro que permiten la generación de iTregs que son más similares en el vivo generada células T reguladoras, que podría ser aplicable para las estrategias de transferencia adoptiva en el futuro. No existe un protocolo `standard&#39; oro para inducir iTregs humanos y los protocolos actuales se han desarrollado sobre la base de condiciones que imitan Treg que inducen in vivo: la interleucina 2 (IL-2) Y la señalización de factor de crecimiento transformante β (TGF-β) son cruciales para la inducción FOXP3 in vivo 17, y el ácido trans-retinoico (ATRA) - que se produce in vivo por las células dendríticas asociados al intestino - se utiliza con frecuencia para mejorar la inducción FOXP3 in vitro 18-21. Hemos desarrollado protocolos de Treg inductores humanos adicionales utilizando butirato 22, un ácido graso de cadena corta derivado de la microbiota intestinal que recientemente ha presentado un incremento murino Treg inducción 23,24. También establecimos recientemente un nuevo protocolo para la generación de iTregs con función supresora superior en vitro mediante el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina 22, siendo este último un objetivo de mamíferos clínicamente aprobado de la rapamicina (mTOR) inhibidor que es conocido por promover FOXP3 de mantenimiento durante la expansión de Treg humanos 25,26. Este método describe la reproducible enla generación in vitro de las células CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando un conjunto de condiciones diferentes, y su posterior fenotipificación mediante citometría de flujo y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) para revelar patrones específicos del protocolo de expresión de FOXP3 y otras firmas de moléculas Treg tales como CD25, CTLA-4, EOS, así como la represión de IFN-γ y expresión SATB1 22. Las poblaciones celulares generadas se pueden utilizar para ensayos funcionales respecto a la actividad de supresión o para estudios moleculares, ya sea en relación con los reguladores generales FOXP3 o para estudiar los efectos específicos a ciertos compuestos, tales como butirato o rapamicina. Una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación de Treg es altamente relevante para futuras estrategias terapéuticas en autoinmunidad o cáncer para apuntar específicamente a las moléculas que participan en la generación y la función de Treg.

<table><tbody><tr><td>Ácido retinoico totalmente trans</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-humano clon de Foxp3-APC 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>microperlas CD25 antihumanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD28 antihumano, LEAF Purificado&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD3 antihumano, purificado por LEAF&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD45RO clon de PE UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>clon antihumano CD4-PerCP SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD8-eFluor 450 (clon OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CTLA-4 (CD152), clon BNI3, mIgG2ak, violeta brillante 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>clon 4S de IFN-g FITC antihumano. B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución que contiene Brefeldina A: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit de síntesis de ADNc: SuperScript VILO (transcriptasa inversa) Kit de síntesis de ADNc</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Medio de centrifugación de densidad: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, </td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de viabilidad fijable inactivado por calor, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 o 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Juego de tampones de tinción</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Atención: contiene paraformaldehído. También se puede comprar en kit combinado con anticuerpo; 77-5774-40 Set de tinción anti-humano Foxp3 Clon APC: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>humano ingenuo kit de aislamiento de células T CD4</td> II <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG1 K Isotype Control FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG2a control de isotipo, violeta brillante 421, clon MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeta de plástico, empaquetado individualmente</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta 1 humano recombinante, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN: RNAqueous-Micro Kit Ambion</td><td></td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo de células T: medio X-Vivo 15, con gentamicina + fenol</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de expresión génica TaqMan, FOXP3 (mejor cobertura)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; ID del ensayo: Hs01085834_m1</td><td>Precaución: contiene paraformaldehído</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Mejor Cobertura)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; ID del ensayo: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Atención: contiene paraformaldehído</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de expresión génica TaqMan</td><td>4369514</td><td></td> <td>Biosystems aplicados</td></tr></tbody></table>

diferenciación in vitro de las células cd4 + humano foxp3 + células t reguladoras (induced itregs) de t naive cd4 + células utilizando un protocolo de tgf-β que contienen

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Las células T reguladoras (Tregs) son una parte integral de la tolerancia periférica, suprimiendo las reacciones inmunitarias contra las autoestructuras y, por lo tanto, previniendo enfermedades autoinmunes. Se están llevando a cabo enfoques clínicos para transferir Tregs de forma adoptiva, o para agotar las Tregs en el cáncer, con primeros resultados prometedores. 
Debido a que el número de Tregs naturales (nTregs) es muy limitado, puede ser ventajoso estudiar ciertas características de las Treg utilizando Tregs inducidas in vitro (iTregs). Hasta la fecha, el mejor marcador proteico para delinear Tregs es el factor de transcripción FOXP3. A pesar de la importancia de las Tregs, incluidas las funciones no redundantes de las Tregs inducidas periféricamente, los protocolos para generar iTregs son actualmente controvertidos, particularmente para las células humanas. Por lo tanto, este protocolo describe la diferenciación in vitro de iTregs CD4 + FOXP3+ humanos a partir de células T humanas vírgenes utilizando una variedad de factores inductores de Treg (TGF-β más IL-2 solamente, o su combinación con ácido retinoico, rapamicina o butirato) en paralelo. También se describe el fenotipado de estas células mediante citometría de flujo y qRT-PCR. 
Estos protocolos dan como resultado la expresión reproducible de FOXP3 y otros genes característicos de Treg y permiten el estudio de los mecanismos generales de regulación de FOXP3, así como los efectos específicos del protocolo para delinear el impacto de ciertos factores. iTregs se puede utilizar para estudiar varios aspectos fenotípicos, así como los mecanismos moleculares de la inducción de Treg. Los estudios moleculares detallados se ven facilitados por el número relativamente grande de células que se pueden obtener. 
Una limitación para la aplicación de iTregs es la relativa inestabilidad de la expresión de FOXP3 en estas células en comparación con nTregs. Las iTregs generadas por estos protocolos también se pueden utilizar para ensayos funcionales, como el estudio de su función supresora, en la que las iTregs inducidas por TGF-β más ácido retinoico y rapamicina muestran una actividad supresora superior. Sin embargo, la capacidad de supresión de iTregs puede diferir de la de nTregs y el uso de controles adecuados es crucial.

La Figura 1 muestra un esquema de la configuración experimental. La Figura 2 muestra una tinción de control de pureza representativo de las células T CD4 + vírgenes magnéticamente aisladas y nTregs. FIGURA 3A muestra la citometría de flujo gating estrategia y la Figura 3B muestra representativa FOXP3 y CD25 citometría de flujo coloraciones en el día...

Este protocolo describe la generación reproducible y el fenotipo de las células T reguladoras inducidas por el hombre (iTregs) a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro. Diferentes protocolos de inducción FOXP3 permiten el estudio de los fenotipos iTreg específicos obtenidos con los protocolos respectivos.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Los objetivos generales de este experimento son inducir linfocitos T reguladores positivos para FOXP3 humano a partir de linfocitos T CD4 vírgenes naïve in vitro, y analizar su fenotipo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología de células T, como ¿cómo se produce la diferenciación reguladora de las células T a nivel molecular? La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación y el fenotipado reproducibles de linfocitos T reguladores positivos para FOXP3 humanos.Aunque este método puede proporcionar información sobre la diferenciación de los linfocitos T reguladores, también puede modificarse para estudiar otros subconjuntos de linfocitos T CD4 y otras células inmunitarias de interés. La demostración visual de este método es crucial porque los pasos de PBMC y aislamiento de bits magnéticos son fáciles de entender cuando se muestran en lugar de describirse. Para aislar las células T de sangre periférica, comience agregando 15 mililitros de medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente en cinco tubos de 50 mililitros por capa leucocitaria, y aumente el volumen final de la capa leucitaria a 180 mililitros con PBS a tempe

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un...

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

Las células T reguladoras CD4+ son potentes inmunomoduladores y cumplen funciones importantes en la homeostasis inmunitaria. La escasez de estas células en la sangre periférica dificulta los estudios funcionales, especialmente en el contexto de la infección por VIH-1. Aquí describimos un método para aislar y expandir las Tregs CD4+ funcionales de sangre periférica de individuos infectados por VIH-1.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T...

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Las células madre embrionarias de ratón pueden diferenciarse a células T in vitro utilizando el sistema de cocultivo OP9-DL1. El éxito en este procedimiento requiere una atención cuidadosa al mantenimiento del reactivo/célula y a los pasos sensibles de la técnica clave. Aquí discutimos estos parámetros críticos y proporcionamos un protocolo detallado para fomentar la adopción de esta tecnología.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo proporciona una estrategia de cocultivo in vitro para investigar los efectos de las células T reguladoras sobre la proliferación y diferenciación de las células T efectoras.

In Vitro Análisis funcional de células T reguladoras: enfoque en la proliferación y diferenciación

Se presenta un protocolo para producir antígenos específicos de células T de ratón usando la transducción...

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

Aprende a generar células T reguladoras FOXP3+ inducidas a partir de células T CD4+ naïve humanas mediante un protocolo con TGF-β. Este método permite estudiar la diferenciación y fenotipado de iTregs.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen (Video) | JoVE Journal

Diferenciación in vitro de las células CD4 ⁺ humano FOXP3 ⁺ células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 ⁺ células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Explorar más videos