Name: Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a generar células T reguladoras FOXP3+ inducidas a partir de células T CD4+ naïve humanas mediante un protocolo con TGF-β. Este método permite estudiar la diferenciación y fenotipado de iTregs.

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Nina Nagel es agradecida por su asistencia técnica durante el rodaje del vídeo y la preparación experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss por su ayuda con el protocolo de tinción intracelular FOXP3 y a Elisabeth Suri-Payer y Nina Oberle por establecer el protocolo de aislamiento nTreg. Matilda Eriksson y Peri Noori son reconocidas por la gestión del laboratorio. 
Financiación: A.S. fue apoyado por una beca intraeuropea Marie Curie dentro del 7º Programa Marco de la Comunidad Europea, la Fundación Dr. Åke Olsson y las fundaciones de investigación KI; A.S. y J.T. fueron apoyados por una beca CERIC (Centro de Excelencia para la Investigación en Inflamación y Enfermedades Cardiovasculares), J.T. fue apoyado por Vetenskapsrådet Medicina y Salud (Dnr 2011-3264), Fundación Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance y Consejo del Condado de Estocolmo.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito permite la inducción robusto de CD4 humano + FOXP3 + iTregs de células T CD4 + vírgenes humanos. Incluye un nuevo protocolo que describimos hace poco, el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina, para la inducción de iTregs con superiores función supresora in vitro 22. En comparación con otros protocolos publicados, otra ventaja es la inducción de diferentes poblaciones iTreg en paralelo por diferentes protocolos, lo que permite la comparación directa de los...

Células T reguladoras CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) suprimen otras células inmunes y son mediadores críticos de la tolerancia periférica, la autoinmunidad y la prevención de la inflamación excesiva 1. La importancia de las células T reguladoras se ejemplifica por la enfermedad humana y el síndrome ligada al cromosoma X immunodysregulation poliendocrinopatía enteropatía (IPEX), en el que la pérdida de células T reguladoras debido a mutaciones en el `master&#39; factor de transcripción caja forkhead P3 Treg (FOXP3) conduce a la enfermedad autoinmune sistémica grave, letal a una edad temprana. Sin embargo, las células T reguladoras actuar como una espada de doble filo en el sistema inmunológico, ya que también pueden obstaculizar la inmunidad antitumoral en ciertas configuraciones 2. La manipulación terapéutica del número y función de Treg es, por tanto, objeto de numerosas investigaciones clínicas. En el cáncer, agotamiento de las células T reguladoras puede ser deseable y algo de éxito de los enfoques clínicos alienta además a la investigación 3. En las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, además de los efectos terapéuticos de células T reguladoras en sevemodelos de enfermedad del ratón ral, los últimos primeros ensayos en el hombre de la transferencia adoptiva de Treg para prevenir la enfermedad injerto contra -host (EICH) 4 - 7 y para evaluar la seguridad en el tratamiento de la diabetes tipo 1 8 mostró resultados muy prometedores. De origen natural Treg (nTregs) comprenden tTregs del timo derivados y pTregs periférica inducida, con funciones esenciales no redundantes en el mantenimiento de salud 9 - 11. Sin embargo, los números nTreg son limitados, fomentando el enfoque complementario de inducir Tregs (iTregs) in vitro a partir precursores de células T ingenuas 12. Aún así la estabilidad de iTregs, presumiblemente debido a la falta de la desmetilación en la llamada región desmetilado Treg-específico (TSDR) en el locus del gen FOXP3 13, sigue siendo una preocupación y varios estudios indican que in vivo inducida por células T reguladoras son más estables 14. Hasta la fecha, FOXP3 sigue siendo la mejor proteína MArker para Tregs pero no es absolutamente específico porque las células CD4 + CD25- T convencionales humanos transitoriamente expresan niveles intermedios de FOXP3 tras la activación 15,16. Aunque se han hecho progresos significativos en el esclarecimiento de la regulación de la expresión de FOXP3, aún queda mucho por descubrir en cuanto a la inducción, la estabilidad y la función de FOXP3 en particular en las células humanas. A pesar de las diferencias a nTregs, in vitro inducida FOXP3 + células T CD4 + se pueden utilizar como un sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de inducción FOXP3 y como punto de partida para desarrollar protocolos en el futuro que permiten la generación de iTregs que son más similares en el vivo generada células T reguladoras, que podría ser aplicable para las estrategias de transferencia adoptiva en el futuro. No existe un protocolo `standard&#39; oro para inducir iTregs humanos y los protocolos actuales se han desarrollado sobre la base de condiciones que imitan Treg que inducen in vivo: la interleucina 2 (IL-2) Y la señalización de factor de crecimiento transformante β (TGF-β) son cruciales para la inducción FOXP3 in vivo 17, y el ácido trans-retinoico (ATRA) - que se produce in vivo por las células dendríticas asociados al intestino - se utiliza con frecuencia para mejorar la inducción FOXP3 in vitro 18-21. Hemos desarrollado protocolos de Treg inductores humanos adicionales utilizando butirato 22, un ácido graso de cadena corta derivado de la microbiota intestinal que recientemente ha presentado un incremento murino Treg inducción 23,24. También establecimos recientemente un nuevo protocolo para la generación de iTregs con función supresora superior en vitro mediante el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina 22, siendo este último un objetivo de mamíferos clínicamente aprobado de la rapamicina (mTOR) inhibidor que es conocido por promover FOXP3 de mantenimiento durante la expansión de Treg humanos 25,26. Este método describe la reproducible enla generación in vitro de las células CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando un conjunto de condiciones diferentes, y su posterior fenotipificación mediante citometría de flujo y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) para revelar patrones específicos del protocolo de expresión de FOXP3 y otras firmas de moléculas Treg tales como CD25, CTLA-4, EOS, así como la represión de IFN-γ y expresión SATB1 22. Las poblaciones celulares generadas se pueden utilizar para ensayos funcionales respecto a la actividad de supresión o para estudios moleculares, ya sea en relación con los reguladores generales FOXP3 o para estudiar los efectos específicos a ciertos compuestos, tales como butirato o rapamicina. Una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación de Treg es altamente relevante para futuras estrategias terapéuticas en autoinmunidad o cáncer para apuntar específicamente a las moléculas que participan en la generación y la función de Treg.

<table><tbody><tr><td>Ácido retinoico totalmente trans</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-humano clon de Foxp3-APC 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>microperlas CD25 antihumanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD28 antihumano, LEAF Purificado&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD3 antihumano, purificado por LEAF&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD45RO clon de PE UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>clon antihumano CD4-PerCP SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>antihumano CD8-eFluor 450 (clon OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CTLA-4 (CD152), clon BNI3, mIgG2ak, violeta brillante 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>clon 4S de IFN-g FITC antihumano. B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución que contiene Brefeldina A: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit de síntesis de ADNc: SuperScript VILO (transcriptasa inversa) Kit de síntesis de ADNc</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Medio de centrifugación de densidad: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, </td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de viabilidad fijable inactivado por calor, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 o 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Juego de tampones de tinción</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Atención: contiene paraformaldehído. También se puede comprar en kit combinado con anticuerpo; 77-5774-40 Set de tinción anti-humano Foxp3 Clon APC: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>humano ingenuo kit de aislamiento de células T CD4</td> II <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG1 K Isotype Control FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG2a control de isotipo, violeta brillante 421, clon MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeta de plástico, empaquetado individualmente</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta 1 humano recombinante, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN: RNAqueous-Micro Kit Ambion</td><td></td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo de células T: medio X-Vivo 15, con gentamicina + fenol</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de expresión génica TaqMan, FOXP3 (mejor cobertura)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; ID del ensayo: Hs01085834_m1</td><td>Precaución: contiene paraformaldehído</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Mejor Cobertura)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; ID del ensayo: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Atención: contiene paraformaldehído</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de expresión génica TaqMan</td><td>4369514</td><td></td> <td>Biosystems aplicados</td></tr></tbody></table>

diferenciación in vitro de las células cd4 + humano foxp3 + células t reguladoras (induced itregs) de t naive cd4 + células utilizando un protocolo de tgf-β que contienen

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Las células T reguladoras (Tregs) son una parte integral de la tolerancia periférica, suprimiendo las reacciones inmunitarias contra las autoestructuras y, por lo tanto, previniendo enfermedades autoinmunes. Se están llevando a cabo enfoques clínicos para transferir Tregs de forma adoptiva, o para agotar las Tregs en el cáncer, con primeros resultados prometedores. 
Debido a que el número de Tregs naturales (nTregs) es muy limitado, puede ser ventajoso estudiar ciertas características de las Treg utilizando Tregs inducidas in vitro (iTregs). Hasta la fecha, el mejor marcador proteico para delinear Tregs es el factor de transcripción FOXP3. A pesar de la importancia de las Tregs, incluidas las funciones no redundantes de las Tregs inducidas periféricamente, los protocolos para generar iTregs son actualmente controvertidos, particularmente para las células humanas. Por lo tanto, este protocolo describe la diferenciación in vitro de iTregs CD4 + FOXP3+ humanos a partir de células T humanas vírgenes utilizando una variedad de factores inductores de Treg (TGF-β más IL-2 solamente, o su combinación con ácido retinoico, rapamicina o butirato) en paralelo. También se describe el fenotipado de estas células mediante citometría de flujo y qRT-PCR. 
Estos protocolos dan como resultado la expresión reproducible de FOXP3 y otros genes característicos de Treg y permiten el estudio de los mecanismos generales de regulación de FOXP3, así como los efectos específicos del protocolo para delinear el impacto de ciertos factores. iTregs se puede utilizar para estudiar varios aspectos fenotípicos, así como los mecanismos moleculares de la inducción de Treg. Los estudios moleculares detallados se ven facilitados por el número relativamente grande de células que se pueden obtener. 
Una limitación para la aplicación de iTregs es la relativa inestabilidad de la expresión de FOXP3 en estas células en comparación con nTregs. Las iTregs generadas por estos protocolos también se pueden utilizar para ensayos funcionales, como el estudio de su función supresora, en la que las iTregs inducidas por TGF-β más ácido retinoico y rapamicina muestran una actividad supresora superior. Sin embargo, la capacidad de supresión de iTregs puede diferir de la de nTregs y el uso de controles adecuados es crucial.

La Figura 1 muestra un esquema de la configuración experimental. La Figura 2 muestra una tinción de control de pureza representativo de las células T CD4 + vírgenes magnéticamente aisladas y nTregs. FIGURA 3A muestra la citometría de flujo gating estrategia y la Figura 3B muestra representativa FOXP3 y CD25 citometría de flujo coloraciones en el día...

Este protocolo describe la generación reproducible y el fenotipo de las células T reguladoras inducidas por el hombre (iTregs) a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro. Diferentes protocolos de inducción FOXP3 permiten el estudio de los fenotipos iTreg específicos obtenidos con los protocolos respectivos.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Los objetivos generales de este experimento son inducir linfocitos T reguladores positivos para FOXP3 humano a partir de linfocitos T CD4 vírgenes naïve in vitro, y analizar su fenotipo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología de células T, como ¿cómo se produce la diferenciación reguladora de las células T a nivel molecular? La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación y el fenotipado reproducibles de linfocitos T reguladores positivos para FOXP3 humanos.Aunque este método puede proporcionar información sobre la diferenciación de los linfocitos T reguladores, también puede modificarse para estudiar otros subconjuntos de linfocitos T CD4 y otras células inmunitarias de interés. La demostración visual de este método es crucial porque los pasos de PBMC y aislamiento de bits magnéticos son fáciles de entender cuando se muestran en lugar de describirse. Para aislar las células T de sangre periférica, comience agregando 15 mililitros de medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente en cinco tubos de 50 mililitros por capa leucocitaria, y aumente el volumen final de la capa leucitaria a 180 mililitros con PBS a temperatura ambiente.A continuación, incline un tubo de medio de gradiente de densidad hacia un lado y coloque lentamente aproximadamente 35 mililitros de sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad sin mezclar las soluciones. Separar las células por centrifugación. A continuación, transfiera las capas blancas de PBMC entre el gradiente de densidad y las fases de plasma de cada tubo a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros.Lave el PBMC con 200 mililitros de PBS fresco y vuelva a suspender los gránulos en medio completo para el agotamiento de los monocitos de sangre periférica por adherencia plástica. Después de recolectar las células flotantes, lave el PBMC tres veces en hasta 50 mililitros de PBS fresco, volviendo a suspender el pellet final en 40 microlitros de tampón de aislamiento de cuatro grados Celsius y 10 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina de células T CD4 positivas ingenuas por una vez 10 a la séptima célula con una mezcla completa. Incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, luego lavar las células con 40 mililitros de cuatro grados centígrados PBS y volver a suspender el pellet en 80 microlitros de tampón de aislamiento y 20 microlitros de microesferas anti-biotina por una vez 10 a la séptima celda para una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados.Mientras las células se incuban, coloque una columna de LS en un imán y equilibre con tres mililitros de tampón de aislamiento, luego lave las células en 50 mililitros de PBS y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de tampón de aislamiento fresco. Ahora agregue las células a la columna, recogiendo el flujo previo que contiene células T CD4 positivas en un tubo de 15 mililitros. Cuando la columna deje de gotear, enjuague el tubo con dos mililitros de tampón de aislamiento y transfiera el lavado a la columna.Después del último lavado, granule las células T clasificadas magnéticamente por centrifugación, seguido de dos lavados en 15 mililitros de medio, lo que da como resultado una población de células T CD4 positivas ingenuas con una pureza superior al 94%. Para inducir células T reguladoras, agregue 50 microlitros de los estímulos apropiados a los pocillos correspondientes de una placa de 96 pocillos recubierta de anti-CD3. A continuación, llene los pocillos vacíos, incluidos los pocillos de margen, con 200 microlitros de PBS, y precaliente las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Ajuste la concentración de las células T vírgenes en reposo a una densidad de 2,2 a 2,6 veces 10 a la sexta célula por mililitro en un medio de 37 grados Celsius, y agregue 50 microlitros de células a cada pocillo. Cuando se hayan sembrado todas las células, envuelva la placa en papel de aluminio para protegerla de la luz y devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares. Después de dos o tres días, pequeños grupos de células en proliferación que emergen en grupos más grandes en puntos de tiempo posteriores deberían hacerse visibles mediante microscopía óptica.Después de cuatro a seis días, el medio cambia de ligeramente naranja a amarillento, y los gránulos de células agrupadas son visibles a simple vista. Para evaluar la expresión del marcador de superficie celular, use una pipeta para volver a suspender las celdas en cada pocillo y transfiera las celdas a una nueva placa de fondo en U de 96 pocillos, dejando un pocillo libre alrededor de cada pocillo para evitar la contaminación por derrame durante el proceso de reposo. Cuando se hayan transferido todas las células, centrifugar la placa y desechar el sobrenadante.Dejando la placa boca abajo sobre un papel absorbente, golpee la placa una vez e inmediatamente gírela hacia arriba. Vórtice para volver a suspender las células en el líquido restante. A continuación, añada 25 microlitros de premezcla superficial a cada pocillo e incube la placa durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Al final de la incubación, lavar los pocillos dos veces en 200 microlitros de PBS, eliminando el sobrenadante, y volviendo a suspender las células después de cada lavado, como se acaba de demostrar. A continuación, realice la viabilidad y la tinción intracelular para FOXP3 y otros marcadores de interés. En estos gráficos, se muestra la estrategia de activación por citometría de flujo para linfocitos T reguladores CD25 positivos para CD25 CD4 positivos para FOXP3 positivos.Tras la estimulación in vitro, la mayoría de las células regulan CD25, cuya expresión se reduce en presencia de rapamicina. Solo bajo la adición de factores Treg inducibles se hace evidente una población clara de células FOXP3 positivas con niveles de expresión de proteínas intracelulares tan altos como los de una Treg natural. De hecho, cada condición de Treg inducida demuestra un patrón específico y reproducible de proliferación celular.El TGF beta induce un ligero aumento de la proliferación, y el ácido retinoico trans aumenta drásticamente la proliferación de células T, mientras que la adición de rapamicina a los cultivos reduce en gran medida el tamaño del grupo de células. El análisis QRT-PCR de las Tregs inducidas indica que la expresión del ARNm de FOXP3 es mayor en todos los cultivos de Treg inducidos en comparación con las células estimuladas por el control, y las Tregs inducidas tratadas con rapamicina exhiben los niveles más bajos de ARNm de FOXP3 de los cultivos de Treg inducidos. Además, se observa que la expresión de ARNm de FOXP3 en las Tregs naturales es mayor que la exhibida por cualquiera de las poblaciones de células T reguladoras inducibles.Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología de células T exploren los mecanismos moleculares de la generación y función de Treg en donantes sanos o en pacientes con enfermedades autoinmunes o cáncer. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células T CD4 positivas previas humanas y cómo diferenciar y fenotipar las NU resultantes en células T reguladoras. No olvide que trabajar con sangre humana o paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso.Por lo tanto, se deben tener en cuenta precauciones como el preproceso, la realización de todas las vacunas, el uso de ropa protectora y el uso adecuado de la eliminación de desechos al realizar estos procedimientos.

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