El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión

El objetivo general de esta tecnología genómica funcional es identificar las ubicaciones genómicas precisas que ocupa una proteína determinada en las células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la regulación génica y la epigenética, como la forma en que la maquinaria de transcripción se ensambla y opera en el contexto de la cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que revela la ubicación genómica exacta de las interacciones entre proteínas y ADN con una resolución previa cercana a la base con un fondo excepcionalmente bajo.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el protocolo es complejo y requiere atención a los detalles en todo momento. Para sonicar lisados nucleares, comience colocando adaptadores de resina en tubos de poliestireno de 15 mililitros que contengan extractos nucleares. Sonicar los lisados en un baño de agua helada a potencia media durante 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado para un total de dos sesiones de 15 minutos.

Para comprobar los resultados de la sonicación, transfiera dos muestras de 10 microlitros de cada tubo a tubos de 1,5 mililitros. A continuación, invierta los enlaces cruzados combinando la primera muestra de 10 microlitros con 10 microlitros de TE-RNasa A y 0,2 microlitros de proteinasa K. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, añade cuatro microlitros de tinte de ADN de xileno 6X.

A la segunda muestra de 10 microlitros, conserve los enlaces cruzados agregando dos microlitros de tinte de ADN de xileno 6X. Coloque ambas muestras en un gel de agarosa al 1,5% a 140 voltios durante aproximadamente 30 a 45 minutos hasta que el tinte de bromofenol en este último esté a tres cuartas partes del camino por el gel. Si la sonicación ha tenido éxito, transfiera los lisados sonicados a dos tubos de mililitros que contengan 150 microlitros de Triton X-100 al 10% y vórtice para mezclar.

Granular la cromatina insoluble y los residuos haciendo girar los lisados sonicados a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Luego transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de dos mililitros. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados indefinidamente.

Para cada inmunoprecipitación de cromatina o reacción ChIP, combine 1,5 mililitros de extractos sonicados con conjugados de perlas de anticuerpos en tubos de 1,5 mililitros. Incube los tubos en un mini rotador de tubos a una velocidad de nueve a cuatro grados centígrados durante la noche. Verifique después de unos minutos para asegurarse de que las muestras no tengan fugas y se mezclen correctamente.

Al día siguiente, gire muy brevemente los tubos para recoger el líquido en las tapas y coloque los tubos en una rejilla magnética durante un minuto. A continuación, aspire el extracto. Agregue 0,75 mililitros de tampón RIPA a cada tubo.

A continuación, retire los tubos de la rejilla magnética e inviértalos varias veces para mezclar. Después de un breve giro, vuelva a colocar los tubos en el imán y aspire el sobrenadante. Después del último lavado, agregue 0,75 mililitros de Tris HCL de 10 milimolares a cada tubo.

Retire los tubos de la rejilla magnética e invierta las muestras varias veces para mezclar. Después de un breve giro, vuelva a colocar los tubos en la rejilla y aspire el sobrenadante. Después de realizar las reacciones de pulido y detallado de acuerdo con el protocolo de texto, complete los cálculos de la mezcla maestra de ligadura.

A continuación, hacer la mezcla de ligadura en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo y pipetear para mezclar la solución. Con los tubos de muestra en la gradilla magnética, agregue 48 microlitros de mezcla maestra de ligadura P7 y dos microlitros de un índice de adaptador diferente a cada una de las resinas de muestra. Incubar las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 25 grados centígrados durante dos horas.

Después de lavar las muestras y realizar la reparación de muescas Phy 29 y las reacciones de quinasa de acuerdo con el protocolo de texto, complete los cálculos de la mezcla maestra de exonucleasa lambda y haga la mezcla de exonucleasa lambda en un tubo de 1,5 mililitros en hielo. Agregue 50 microlitros de mezcla de exonucleasa lambda a cada resina de muestra mientras aún está en el estante magnético. A continuación, incubar las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de aspirar el último lavado como se describe en el protocolo de texto, lleve a cabo la reacción de nucleasa RecJf completando los cálculos de la mezcla maestra RecJf y haciendo la mezcla RecJf en hielo. Añade 50 microlitros de la mezcla RecJf a cada muestra de resina en la gradilla magnética. A continuación, incubar las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de aspirar el último lavado, prepare el tampón de elución ChIP y la mezcla maestra de proteinasa K y agregue 200 microlitros de la solución a cada resina de muestra. Incube las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 65 grados centígrados durante la noche con una tapa caliente para evitar la condensación. Al día siguiente, gire brevemente las muestras y coloque los tubos en la rejilla magnética durante un minuto.

A continuación, transfiera 200 microlitros de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de tampón TE. Después de la extracción de ADN, la extensión primaria P7 y las reacciones ATL, complete los cálculos de la mezcla maestra de la tabla de ligadura del adaptador P5 y haga la mezcla maestra de ligadura en hielo. Agregue 20 microlitros de la mezcla de ligadura a cada muestra y pipetee para mezclar.

A continuación, incubar las muestras en un termociclador a 25 grados centígrados durante dos horas. Llevar a cabo la purificación y cuantificación del ADN de acuerdo con el protocolo de texto. Como se muestra aquí, vale la pena dedicar tiempo a optimizar las condiciones de sonicación para obtener extractos de cromatina de alta calidad que produzcan fragmentos de ADN de entre 100 y 500 pares de bases.

Y el ensayo de cambio de movilidad electroforética se utiliza para verificar que los extractos sonicados contienen enlaces cruzados de ADN de proteínas intactas, evidentes como un supercambio de fragmentos de ADN. Para evaluar la señal de fondo, se realiza un ChIP simulado de forma rutinaria sin anticuerpos en la reacción. Una exobiblioteca ChIP de alta calidad producirá muy poco fondo en la muestra simulada en comparación con la preparación de una biblioteca ChIP-seq.

Aquí se muestra una evaluación del bioanalizador de una biblioteca ChIP-exo. El análisis garantiza con precisión la distribución del tamaño de la biblioteca y detecta los dímeros adaptadores contaminantes que funcionan con 125 pares de bases. Este panel ilustra la distribución fluida de las cinco Ns primos de la etiqueta ChIP-exo separadas por hebras para la polimerasa II, TFIIB y TBP en el gen RPS12 humano en células K562 en proliferación.

En esta figura se muestran los patrones ChIP-exo promedio en relación con los sitios de inicio transcripcional de los genes que codifican proteínas. Las principales ubicaciones de los picos para TBP, TFIIB y polimerasa II en el gráfico compuesto reflejan la organización genómica de los complejos de iniciación de la transcripción humana. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regulación génica exploraran los detalles moleculares de la estructura subnuclear en asimetría en levadura. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfil de expresión de búsqueda de RNasa, para abordar cuestiones como si un factor determinado influye en la expresión de un gen cercano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar completar cuidadosamente las tablas de mezcla maestra para todos los pasos enzimáticos.

No olvide que trabajar con carcinógenos y otros agentes cáusticos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una biblioteca ChIP-exo de alta calidad.