Name: El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende el método ChIP-exo para identificar interacciones proteína-ADN con precisión de par de bases en células vivas. Esta técnica avanza el estudio de la regulación génica y la epigenética.

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Agradecemos al Laboratorio Venters y a los miembros del Departamento de Fisiología Molecular y Biofísica por sus útiles discusiones. Un agradecimiento especial a Frank Pugh por su orientación, tutoría y muchas discusiones perspicaces sobre los matices de ChIP-exo mientras era becario postdoctoral en su laboratorio.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Se presenta un protocolo de genómica funcional para determinar la ubicación exacta de unión de la cromatina proteínas que interactúan de una manera imparcial, en todo el genoma a una resolución de pares de bases próximo. El paso más crítico para lograr la base cerca de una resolución de mapeo par es el tratamiento con exonucleasa de la ADN-chip enriquecido mientras que el inmunoprecipitado permanece en la resina magnética. Aparentemente, los complejos de proteínas potencialmente podrían bloquear la huella in v...

inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es un método potente para estudiar los mecanismos de la regulación de genes por enriquecer selectivamente para fragmentos de ADN que interactúan con una proteína dada en las células vivas. Los métodos de detección de fragmentos de ADN chip enriquecida han evolucionado a medida que la tecnología mejora, desde la detección de un solo locus (estándar chip-qPCR) para la hibridación de microarrays de ADN (chip-chip) a secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) 1. Aunque el chip-ss ha visto amplia aplicación, la heterogeneidad de la cromatina y las interacciones no específicas de ADN han obstaculizado calidad de los datos que conduce a falsos positivos y la cartografía imprecisa. Para sortear estas limitaciones, el Dr. Frank Pugh desarrolló el método de chip-exo 2. La característica sobresaliente de chip-exo es que incorpora un 5 &#39;a 3&#39; exonucleasa, footprinting efectivamente factor de transcripción sitios de unión. Como resultado, la metodología chip-exo logra una resolución más alta, mayor rango dinámico de detection, y un menor ruido de fondo. Aunque el chip-exo es técnicamente más difícil de dominar que el chip-ss, que está siendo ampliamente adoptado como estudios apuntan a obtener una visión única de ultra alta resolución utilizando diversos sistemas biológicos 3-8. De hecho, el chip-exo se ha aplicado con éxito a bacterias, levaduras, ratón, rata, y los sistemas de células humanas. Como prueba de principio, chip-exo fue originalmente utilizado para identificar el motivo de unión precisa para un puñado de la transcripción de levadura Factores 2. La técnica también se utilizó en la levadura para estudiar la organización del complejo de pre-iniciación de la transcripción, y para descifrar estructura subnucleosomal de diversas histonas 9,10. Más recientemente, hemos aprovechado chip-exo para resolver TFIIB adyacente y Pol II promotores de eventos en humanos vinculante, y demostramos que surge de la transcripción divergente generalizada de los distintos complejos de iniciación 11. El flujo de trabajo que aquí se presenta se optimiza y streamlined de mamíferos chip-exo (Figura 1). En primer lugar, las células vivas de cultivo primario o de tejidos se tratan con formaldehído para preservar en las interacciones proteína-ADN in vivo a través de una reticulación covalente. Las células se lisan y la cromatina esquiladas a ~ 100 - 500 pares de bases de tamaño de los fragmentos. ChIP entonces enriquece selectivamente fragmentos de ADN para reticular para la proteína de interés. En este punto, las bibliotecas ChIP-seq son típicamente preparados, lo que limita inherentemente la resolución de detección para el tamaño medio de fragmento de unos pocos cientos de pares de bases. Sin embargo, el chip-exo supera esta limitación por el recorte de la derecha 5 fronteras &#39;de ADN del sitio de entrecruzamiento de proteínas de ADN con exonucleasa lambda e izquierdo. bibliotecas de secuenciación entonces se construyen a partir de ADN digerido exonucleasa como se detalla a continuación. Los anidados 5 &#39;fronteras resultantes representan una huella in vivo de la interacción proteína-ADN (Figura 1, paso 14), y se detectan mediante secuenciación de alto rendimiento. altHough la metodología chip-exo es más complicado que el chip-ss, las transiciones entre la mayoría de los pasos requiere el lavado del grano simple, lo que minimiza la pérdida de muestra y la variabilidad experimental. Es importante destacar que, desde el chip-exo es una versión refinada de chip-ss, cualquier muestra que tiene éxito con chip-ss también debe tener éxito con chip-exo. La huella in vivo de las interacciones proteína-ADN con resultados chip-exo en una estructura de datos fundamentalmente distinto del chip-ss. A pesar de que las personas que llaman comunes chip-ss pueden aplicarse a los datos de chip-exo, para obtener las llamadas pico más precisas se recomienda la bioinformática herramientas diseñadas específicamente con la estructura única de datos chip-exo en mente. Estos incluyen Genex, GEM, MACE, Peakzilla, y ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% formaldehído, sin metanol, 10 ampollas de 10 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sección 3</td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasa (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Secciones 4, 8</td></tr><tr><td>Sónico Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Sección 5</td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>352095 Sección 5</td></tr><tr><td>MagSepharose Proteína G Xtra perlas</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Sección 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Rack magnético lateral</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Secciones 6-17, 22</td></tr><tr><td>Rotador de minitubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Secciones 7, 22</td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Sección 9</td></tr><tr><td>ADN polimerasa I, Klenow</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>M0210</td><td>Sección 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Tampón de reacción 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Secciones 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Secciones 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Secciones 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Secciones 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Secciones 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Secciones 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Secciones 10, 20</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Secciones 11, 21</td></tr><tr><td>&Phi;-29 ADN polimerasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Secciones 12, 19</td></tr><tr><td>10x &Phi;-29 Tampón</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Secciones 12, 19</td></tr><tr><td>Exonucleasa lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Sección 14</td></tr><tr><td>10x Tampón Lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Sección 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonucleasa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Sección 15</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>03115828001 de Ciencias de la Vida de Roche</td><td></td><td>Sección 16</td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>010901393001</td><td>de Ciencias de la Vida de Roche</td><td>Sección 18</td></tr><tr><td>10x T4 T4 Tamp T4 Tamp</td><td>B0202</td><td>Sección 21</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de AMPure XP (limpieza);</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Sección 22</td></tr><tr><td>Q5 ADN polimerasa de arranque en caliente&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Sección 23</td></tr><tr><td>5x Tampón Q5 (5x Tampón PCR)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Sección 23</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Sección 25</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Fluorímetro Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Sección 26</td></tr><tr><td>Tubos ópticos transparentes Qubit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Sección 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de ensayo de alta sensibilidad</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Sección 26</td></tr></tbody></table>

el método chip-exo: la identificación de las interacciones proteína-adn con zona de base par de precisión

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) es una herramienta indispensable en el campo de la epigenética y la regulación de genes específicos que aísla las interacciones proteína-ADN. ChIP acoplado a la secuenciación de alto rendimiento de (ChIP-seq) se usa comúnmente para determinar la localización genómica de las proteínas que interactúan con la cromatina. Sin embargo, el chip-ss se ve obstaculizada por una resolución relativamente baja mapeo de varios cientos de pares de bases y alta señal de fondo. El método de chip-exo es una versión refinada de chip-ss que mejora sustancialmente cuando se produzca tanto la resolución y el ruido. La distinción clave de la metodología chip-exo es la incorporación de la digestión de exonucleasa lambda en el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca a la huella efectiva la izquierda y derecha 5 fronteras &#39;de ADN del sitio de entrecruzamiento de proteínas de ADN. Las bibliotecas de chip-exo se someten a secuenciación de alto rendimiento. Los datos resultantes se puede aprovechar para proporcionar una visión única y ultra-alta resolución en la organización funcional of genoma. A continuación, se describe el método de chip-exo que hemos optimizado y simplificado para los sistemas de mamíferos y de próxima generación de plataformas de secuenciación por síntesis.

Las siguientes figuras ilustran los resultados representativos del chip de protocolo-exo que aquí se presenta. En contraste con las metodologías tradicionales de chip-ss con pocos pasos enzimáticos, chip-exo requiere once reacciones enzimáticas secuencialmente dependientes (Figura 1). Por lo tanto, se debe tener cuidado en cada paso para asegurarse de que cada componente de reacción se agrega a su respectiva mezcla maestra de reacción. Recomendamos la generación de una h...

Aquí, presentamos un protocolo para lograr la resolución de pares de bases cercanos a las interacciones proteína-ADN. Esto se obtiene mediante el tratamiento con exonucleasas de fragmentos de ADN enriquecidos selectivamente por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento.

El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

El objetivo general de esta tecnología genómica funcional es identificar las ubicaciones genómicas precisas que ocupa una proteína determinada en las células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la regulación génica y la epigenética, como la forma en que la maquinaria de transcripción se ensambla y opera en el contexto de la cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que revela la ubicación genómica exacta de las interacciones entre proteínas y ADN con una resolución previa cercana a la base con un fondo excepcionalmente bajo.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el protocolo es complejo y requiere atención a los detalles en todo momento. Para sonicar lisados nucleares, comience colocando adaptadores de resina en tubos de poliestireno de 15 mililitros que contengan extractos nucleares. Sonicar los lisados en un baño de agua helada a potencia media durante 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado para un total de dos sesiones de 15 minutos.Para comprobar los resultados de la sonicación, transfiera dos muestras de 10 microlitros de cada tubo a tubos de 1,5 mililitros. A continuación, invierta los enlaces cruzados combinando la primera muestra de 10 microlitros con 10 microlitros de TE-RNasa A y 0,2 microlitros de proteinasa K. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, añade cuatro microlitros de tinte de ADN de xileno 6X.A la segunda muestra de 10 microlitros, conserve los enlaces cruzados agregando dos microlitros de tinte de ADN de xileno 6X. Coloque ambas muestras en un gel de agarosa al 1,5% a 140 voltios durante aproximadamente 30 a 45 minutos hasta que el tinte de bromofenol en este último esté a tres cuartas partes del camino por el gel. Si la sonicación ha tenido éxito, transfiera los lisados sonicados a dos tubos de mililitros que contengan 150 microlitros de Triton X-100 al 10% y vórtice para mezclar.Granular la cromatina insoluble y los residuos haciendo girar los lisados sonicados a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Luego transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de dos mililitros. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados indefinidamente.Para cada inmunoprecipitación de cromatina o reacción ChIP, combine 1,5 mililitros de extractos sonicados con conjugados de perlas de anticuerpos en tubos de 1,5 mililitros. Incube los tubos en un mini rotador de tubos a una velocidad de nueve a cuatro grados centígrados durante la noche. Verifique después de unos minutos para asegurarse de que las muestras no tengan fugas y se mezclen correctamente.Al día siguiente, gire muy brevemente los tubos para recoger el líquido en las tapas y coloque los tubos en una rejilla magnética durante un minuto. A continuación, aspire el extracto. Agregue 0,75 mililitros de tampón RIPA a cada tubo.A continuación, retire los tubos de la rejilla magnética e inviértalos varias veces para mezclar. Después de un breve giro, vuelva a colocar los tubos en el imán y aspire el sobrenadante. Después del último lavado, agregue 0,75 mililitros de Tris HCL de 10 milimolares a cada tubo.Retire los tubos de la rejilla magnética e invierta las muestras varias veces para mezclar. Después de un breve giro, vuelva a colocar los tubos en la rejilla y aspire el sobrenadante. Después de realizar las reacciones de pulido y detallado de acuerdo con el protocolo de texto, complete los cálculos de la mezcla maestra de ligadura.A continuación, hacer la mezcla de ligadura en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo y pipetear para mezclar la solución. Con los tubos de muestra en la gradilla magnética, agregue 48 microlitros de mezcla maestra de ligadura P7 y dos microlitros de un índice de adaptador diferente a cada una de las resinas de muestra. Incubar las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 25 grados centígrados durante dos horas.Después de lavar las muestras y realizar la reparación de muescas Phy 29 y las reacciones de quinasa de acuerdo con el protocolo de texto, complete los cálculos de la mezcla maestra de exonucleasa lambda y haga la mezcla de exonucleasa lambda en un tubo de 1,5 mililitros en hielo. Agregue 50 microlitros de mezcla de exonucleasa lambda a cada resina de muestra mientras aún está en el estante magnético. A continuación, incubar las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de aspirar el último lavado como se describe en el protocolo de texto, lleve a cabo la reacción de nucleasa RecJf completando los cálculos de la mezcla maestra RecJf y haciendo la mezcla RecJf en hielo. Añade 50 microlitros de la mezcla RecJf a cada muestra de resina en la gradilla magnética. A continuación, incubar las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de aspirar el último lavado, prepare el tampón de elución ChIP y la mezcla maestra de proteinasa K y agregue 200 microlitros de la solución a cada resina de muestra. Incube las muestras en un ThermoMixer a tres veces g a 65 grados centígrados durante la noche con una tapa caliente para evitar la condensación. Al día siguiente, gire brevemente las muestras y coloque los tubos en la rejilla magnética durante un minuto.A continuación, transfiera 200 microlitros de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de tampón TE. Después de la extracción de ADN, la extensión primaria P7 y las reacciones ATL, complete los cálculos de la mezcla maestra de la tabla de ligadura del adaptador P5 y haga la mezcla maestra de ligadura en hielo. Agregue 20 microlitros de la mezcla de ligadura a cada muestra y pipetee para mezclar.A continuación, incubar las muestras en un termociclador a 25 grados centígrados durante dos horas. Llevar a cabo la purificación y cuantificación del ADN de acuerdo con el protocolo de texto. Como se muestra aquí, vale la pena dedicar tiempo a optimizar las condiciones de sonicación para obtener extractos de cromatina de alta calidad que produzcan fragmentos de ADN de entre 100 y 500 pares de bases.Y el ensayo de cambio de movilidad electroforética se utiliza para verificar que los extractos sonicados contienen enlaces cruzados de ADN de proteínas intactas, evidentes como un supercambio de fragmentos de ADN. Para evaluar la señal de fondo, se realiza un ChIP simulado de forma rutinaria sin anticuerpos en la reacción. Una exobiblioteca ChIP de alta calidad producirá muy poco fondo en la muestra simulada en comparación con la preparación de una biblioteca ChIP-seq.Aquí se muestra una evaluación del bioanalizador de una biblioteca ChIP-exo. El análisis garantiza con precisión la distribución del tamaño de la biblioteca y detecta los dímeros adaptadores contaminantes que funcionan con 125 pares de bases. Este panel ilustra la distribución fluida de las cinco Ns primos de la etiqueta ChIP-exo separadas por hebras para la polimerasa II, TFIIB y TBP en el gen RPS12 humano en células K562 en proliferación.En esta figura se muestran los patrones ChIP-exo promedio en relación con los sitios de inicio transcripcional de los genes que codifican proteínas. Las principales ubicaciones de los picos para TBP, TFIIB y polimerasa II en el gráfico compuesto reflejan la organización genómica de los complejos de iniciación de la transcripción humana. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regulación génica exploraran los detalles moleculares de la estructura subnuclear en asimetría en levadura. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfil de expresión de búsqueda de RNasa, para abordar cuestiones como si un factor determinado influye en la expresión de un gen cercano. Al intentar este procedimiento, es importante recordar completar cuidadosamente las tablas de mezcla maestra para todos los pasos enzimáticos.No olvide que trabajar con carcinógenos y otros agentes cáusticos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una biblioteca ChIP-exo de alta calidad.

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La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

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Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

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Este artículo de vídeo describe un método de microarrays basado en vitro para determinar los objetivos de genes y sitios de unión para dos reguladores de respuesta del sistema de componentes.

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Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.

Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

CUT&amp;RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

Un método ChIRP basado en UV para identificar interacciones directas entre ARNN y proteína.

Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Aprende el método ChIP-exo para identificar interacciones proteína-ADN con precisión de par de bases en células vivas. Esta técnica avanza el estudio de la regulación génica y la epigenética.

El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión

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