Imágenes en vivo para el Estudio de la inestabilidad dinámica de microtúbulos en los cánceres de mama resistentes a taxano

El objetivo general de este experimento es medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en células de cáncer de mama resistentes a docetaxel. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular sobre la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en condiciones fisiológicas y después de diversos tratamientos farmacológicos. Las principales ventajas de esta técnica son que proporciona un protocolo sencillo, fiable y fisiológicamente aplicable para estudiar la dinámica de los microtúbulos en células vivas.

Antes de comenzar el procedimiento, cultive las células de cáncer de mama en un medio de cultivo completo en placas de cultivo de 10 centímetros a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el grado adecuado de confluencia. El día antes del experimento, enjuague las barbitas de vidrio recubiertas de poli L-lisina de 24 milímetros con 70% de alcohol y exponga las barbotina a la luz ultravioleta durante la noche. A la mañana siguiente, coloque un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de seis pocillos.

A continuación, lavar los cultivos con PBS, y separar las células de cada plato con 0,5 mililitros de tripsina EDTA. Cuando las células hayan comenzado a levantarse del fondo de la placa, neutralice la tripsina con cinco mililitros de medio de cultivo fresco y cuente las células. A continuación, añada aproximadamente una vez 10 las quintas celdas a cada cubreobjetos, agite la placa suavemente y devuelva las celdas a la incubadora durante al menos 36 horas.

Para analizar la dinámica de los microtúbulos de las células, mezcle varias veces la solución madre de alfa tubulina marcada con GFP por inversión para garantizar una solución homogénea sin vórtices. A continuación, sustituya el medio de cultivo de cada pocillo por dos mililitros de medio fresco que contenga 40 microlitros de la tubulina marca. Agite la placa suavemente para permitir la mezcla completa del marcador con el medio de cultivo y devuelva la placa a la incubadora durante otras 24 horas.

Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo con medio fresco que contenga docetaxel y devuelva la placa a la incubadora durante 30 minutos. Mientras se inhiben las células, encienda el microscopio de fluorescencia invertida y precaliente el portamuestras a 37 grados Celsius. A continuación, seleccione la lente del objetivo de aceite 60X 1.42 NA y monte el primer cubreobjetos en el portamuestras.

Cubra la muestra con un mililitro de medio fresco que contenga docetaxel a 37 grados Celsius y localice un grupo de células planas que exhiban una alta intensidad de fluorescencia de alfa tubulina marcada con GFP con estructuras de microtúbulos claramente visibles. Enfoque el área periférica de una de las celdas del clúster y establezca el tiempo de exposición adecuado en la frecuencia de adquisición de la imagen. Exactamente 50 minutos después de añadir la primera alícuota de docetaxel se comienza a registrar la dinámica de los microtúbulos durante dos minutos, obteniendo una foto cada dos segundos.

Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, visualice la siguiente celda como se acaba de demostrar, hasta que se hayan capturado imágenes de cinco células en total de los tres pocillos de cada concentración de docetaxel. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes para cada concentración de inhibidor, abra el programa de deconvolución, dentro del sistema de microscopio y haga clic en el proceso. A continuación, seleccione desconvolucionar y arrastre el archivo de imagen a la ventana de entrada.

Haga clic en Hacer para desconvolucionar la imagen y abrir el archivo de imagen desconvolucionado dentro del software del microscopio. Haga clic en archivo y guárdelo como película. Establezca el formato de película como AV y el estilo de animación como hacia adelante.

Establezca la calidad de compresión al 100% y la velocidad de fotogramas a cinco por segundo. A continuación, marque la casilla Animar a través del tiempo y haga clic en hacerlo para generar el vídeo. En este experimento representativo, las células de cáncer de mama normales y resistentes a docetaxel fueron tratadas con docetaxel y se obtuvieron imágenes como se acaba de demostrar, pero los efectos del tratamiento sobre el crecimiento y el acortamiento de los microtúbulos fueron más evidentes en las células no resistentes a docetaxel.

De hecho, la medición de la tasa de crecimiento y acortamiento de los microtúbulos en condiciones de tratamiento con docetaxel de 0,5 micromolares revela una fuerte inhibición de la dinámica de la tubulina de las células parentales pero no resistentes al docetaxel. Una vez dominado, todo el proceso puede completarse en 60 horas si las técnicas se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar células planas, con una alta intensidad de fluorescencia de tubulina GFP, y reducir tanto la intensidad de la fluorescencia de excitación como la duración de la exposición para evitar el desvanecimiento de la fluorescencia GFP.

Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en los campos de la biología celular y del cáncer evalúen los efectos de varios agentes dirigidos a los microtúbulos en células normales y cancerosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en células vivas en una variedad de condiciones.