Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

El objetivo general de este procedimiento es establecer células tetraploides proliferativas, libres de una población diploide, a partir de fibroblastos humanos normales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la carcinogénesis, como cómo se desarrollan las células aneuploides, en las primeras etapas de la carcinogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que las células tetraploides proliferativas, libres de una población diploide, pueden establecerse mediante procedimientos relativamente sencillos.

Si bien algunas cepas se vuelven completamente tetraploides por un simple tratamiento con veneno de huso, demecolcina, la mayoría necesita ser manejada con el método de sacudida durante ese tratamiento para emular una población diploide. Para comenzar la inducción de la tetraploidía sin el método de agitación, pase aproximadamente cinco veces 10 a 1/5 de las células cultivadas en un plato de 100 milímetros. Incubar la placa en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Después de esto, trate las células que crecen exponencialmente con un medio que contenga 0,1 microgramos por mililitro DC. Incube en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante cuatro días. A continuación, sustituya el medio que contiene CC por un medio libre de fármacos. Incubar en dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados hasta que se reanude la proliferación.

Para inducir la tetraploidía utilizando el método de agitación, pase las células cultivadas a matraces T-75, asegurándose de que cada matraz contenga al menos una vez 10 por 1/6 de celdas. Incubar los matraces en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, trate las células con un medio que contenga DC durante 16 a 18 horas para detenerlas en mitosis como se describe en el protocolo de texto.

Después de la incubación, revise las células en un matraz bajo el microscopio de contraste de fase invertida. Y luego agite suavemente cada matraz para comenzar la recolección de células mitóticas poco adheridas. Debe evitarse la manipulación descuidada, como sacudidas violentas o tocar la superficie del matraz con la punta de la pipeta.

No contamine las células mitóticas con células de interfaz adheridas. Lave suavemente los matraces con medio tibio y transfiera las células a los tubos de centrífuga. Utilice un contador de celdas atómicas para contar el número de celdas.

Después del recuento de células, centrifugar a 300 veces g durante cinco minutos. Resiembra las células mitóticas recolectadas en placas de cultivo de 16 milímetros. A continuación, trate las células plateadas con un medio que contenga 0,1 microgramos por mililitro DC.Incubar en dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante tres días.

Después de esto, reemplace el medio que contiene DC por un medio libre de medicamentos. Incubar en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados hasta que se reanude la proliferación. Para el análisis de la ploidía del ADN, lave las células con PBS.

A continuación, añada una solución que contenga 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA a las células. Incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de esto, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga.

Y neutralizar la tripsina añadiendo un medio que contenga un 10% de suero bovino fetal. Centrifugar las células en medio a 300 veces g durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células en cinco mililitros de PBS.

A continuación, vuelva a centrifugar a 300 veces g durante cinco minutos. A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS. Agregue cuatro mililitros de etanol al 100% gota a gota con la mezcla.

Deje reposar la suspensión a temperatura ambiente durante 30 minutos para fijar las celdas. Después de esto, centrifugue las células en solución fijadora a 300 veces g durante cinco minutos. Y resuspender las células en cinco mililitros de PBS.

Centrifugar la suspensión a 300 veces g durante cinco minutos. A continuación, trate las células con 475 microlitros de solución de ARN de 0,5 miligramos por mililitro. Agregue 25 microlitros de una solución de miligramo por mililitro de propidio y yodo para teñir las células.

Y luego mezclar. Deje reposar la suspensión a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, utilice un citómetro de flujo con un láser de 488 nanómetros y un filtro de emisión de canal rojo para analizar el contenido de ADN de las células.

Analice también una muestra de referencia preparada a partir de células diploides genuinas para evaluar la ploidía de las células diana. Para empezar, trate las células en crecimiento exponencial con un medio que contenga 0,1 microgramos por mililitro DC durante cuatro horas para detener las células en metafase. Después de esto, coseche al menos cinco veces 10 a 1/5 de células por tripsinización.

Suspenda las células recolectadas en un medio que contenga FBS. Centrifugar la suspensión a 300 veces g durante cinco minutos. A continuación, añada cinco mililitros de una solución de cloruro de potasio 0,075 molar.

Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez completada la incubación, centrifugar la suspensión a 300 veces g durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células en cinco mililitros de fijador de Carnoy.

Y luego centrifugar la suspensión a 300 veces g durante cinco minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de fijador de Carnoy. Deje caer 30 microlitros de la suspensión de celdas en un portaobjetos de vidrio.

Por último, tiñe y analiza las células mediante recuentos de cromosomas o análisis de cariotipos. En este estudio, las células tetraploides proliferativas, libres de una población diploide, se cultivan a partir de fibroblastos humanos normales. Aunque algunas cepas celulares pueden llegar a ser completamente tetraploides por el tratamiento continuo con DC, la mayoría de las células necesitan ser tratadas con el método de sacudida durante el curso del tratamiento con DC para eliminar una población diploide.

Aquí se muestran los resultados representativos de la inducción de tetraploidía en tres cepas de fibroblastos. La cepa TIG-1 se vuelve casi completamente tetraploide a través de un tratamiento continuo simple con DC. Sin embargo, este tratamiento hace que las cepas BJ y TIG-hT se conviertan en una mezcla de poblaciones diploides y tetrápodas. Por lo tanto, es necesario el aislamiento de las células mitóticas mediante el método de sacudida durante el proceso de tratamiento.

Se realiza un recuento de cromosomas en las células tetraploides establecidas. Como se puede observar, el número de cromosomas modales es 92 para las células TIG-1 y BJ, y 91 para las células TIG-hT. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar agitar suavemente los matraces en el paso de agitación, para no causar la contaminación de las células mitóticas por las células de interfaz adherentes.