Ingeniería Molecular Recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono

El objetivo general de este procedimiento es preparar nanotubos de carbono fluorescentes de pared simple en el infrarrojo cercano para la detección molecular que se han funcionalizado utilizando polímeros biomiméticos. Estos nanosensores pueden permitir la obtención de imágenes resueltas en el tiempo en tejido vivo. Por ejemplo, se pueden usar para detectar dopamina en el cerebro.

La principal ventaja de estos sensores es su fluorescencia inherente al infrarrojo cercano, que permite obtener imágenes más profundas en el tejido. Los sensores sintéticos permiten la detección de moléculas sin elementos naturales de reconocimiento molecular, lo que hace que este método genérico de desarrollo de sensores sea especialmente útil para la detección de moléculas pequeñas. Para preparar una suspensión de ácido nucleico de SWNT, primero disuelva los ácidos nucleicos en cloruro de sodio 0,1 molar a una concentración de 100 miligramos por mililitro.

En una campana extractora, elimine la electricidad estática de la espátula desechable, los tubos de microcentrífuga y la culata SWMT con una pistola antiestática. A continuación, agregue 20 microlitros de la solución de ácido nucleico a 980 microlitros de cloruro de sodio 0,1 molar. A continuación, añada 1 miligramo de SWNT lavados a la solución de ácido nucleico resultante antes de sonicar la mezcla.

La posición de la punta de la sonda durante la sonicación es fundamental. Si se produce espuma, vuelva a colocar la punta de la sonda e intente reducir la amplitud. Alternativamente, puede probar los pulsos de sonicación o la sonicación en baño si la suspensión sigue siendo pobre.

Utilizando un ultrasonido con una punta de 3 milímetros de diámetro, sonicar la solución durante 10 minutos al 40% de amplitud en un baño de hielo. Centrifugar la solución de ADN SWNT dos veces durante 90 minutos a 16, 100 xg. Recoja y conserve el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la pelletiza que contiene haces de nanotubos de carbono y agregados.

Deseche el pellet de acuerdo con los procedimientos institucionales de residuos peligrosos apropiados para nanomateriales. Mida la absorbancia de la solución a 632 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV-vis para determinar la concentración aproximada de SWNT en suspensión, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, y el factor de dilución apropiado. En el caso de las suspensiones de polímeros anfifílicos, primero elimine la electricidad estática de la espátula desechable, los tubos de microcentrífuga y el material SWNT.

En una campana extractora, agregue cinco miligramos de SWNT a cinco mililitros de solución de colato de sodio al 2%. Utilizando un ultrasonido con una punta de seis milímetros de diámetro, sonicar la solución durante una hora al 40% de amplitud en un baño de hielo. Centrifugar la muestra a 150.000 xg durante cuatro horas utilizando una ultracentrífuga, antes de recoger cuidadosamente el sobrenadante.

A continuación, disuelva el 1% en peso del polímero anfifílico en la solución scSWNT. A continuación, dialice la solución de polímero scSWNT utilizando una membrana de diálisis de 3,5 kilodalton frente a un litro de agua desionizada o tampón durante cinco días. Cambie el agua o el amortiguador a la hora dos y a la hora cuatro.

Mida la absorbancia de la solución a 632 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV-Vis para determinar la concentración aproximada de SWNT suspendidos. Para preparar los portaobjetos recubiertos de biotina BSA, limpie un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos de 0,17 milímetros con agua desionizada, seguido de metanol, acetona y un enjuague final con agua desionizada. Cree canales colocando varios trozos de cinta adhesiva de doble cara a una distancia aproximada de cinco milímetros en el portaobjetos de microscopio limpio.

Selle los canales tomando un cubreobjetos de vidrio largo y presionándolo sobre la parte superior de la cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de centrarlo en el portaobjetos del microscopio para que los bordes de la cubierta y el portaobjetos no queden al ras. A continuación, agregue 100 microlitros de solución madre de biotina BSA a 900 microlitros de tampón Tris 1x hasta una concentración final de un miligramo por mililitro.

Fluya 50 microlitros de la solución de biotina BSA en el canal pipeteando la solución en un extremo y absorbiendo la solución en el otro extremo con un pañuelo de papel. Después de incubar la solución durante cinco minutos, realice de tres a cinco lavados con 50 microlitros de cloruro de sodio 0,1 molar. A continuación, diluya 40 microlitros de cinco miligramos por mililitros de solución madre NAV en 960 microlitros de tampón Tris 1x, hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro.

Fluya 50 microlitros de la solución NAV en el canal pipeteando la solución en un extremo y absorbiendo la solución en el otro extremo con un pañuelo de papel. Después de incubar el portaobjetos durante dos a cinco minutos, realice de tres a cinco lavados con 50 microlitros de cloruro de sodio 0,1 molar. A continuación, diluya las soluciones madre de SWNT en suspensión y el tampón de imagen hasta una concentración de 1 a 10 miligramos por litro.

Fluya 50 microlitros de esta solución en el canal e incube durante cinco minutos. Enjuague suavemente el exceso de SWNT con 50 microlitros de tampón de imagen. Para medir la respuesta reversible de los ADN-SWNT GT15 a la dopamina, primero monte los canales recubiertos por el sensor en la platina del microscopio de fluorescencia.

Enfoca los canales con un objetivo de aceite 100X y una cámara de arseniuro de indio y galio. Luego, agregue 50 microlitros de solución de dopamina de 100 micromolares en solución salina tamponada con fosfato al canal de flujo y registre el cambio en la intensidad de la fluorescencia. Lave la solución de dopamina con solución salina tamponada con fosfato y observe el cambio en la fluorescencia de los sensores SWNT individuales.

Para realizar el cribado de la placa de pocillo para la respuesta del analito de los SWNT de polímeros biomiméticos, pipetee volúmenes iguales del sensor SWNT suspendido en cada pocillo. Use suficiente volumen para cubrir el fondo del pozo de manera uniforme. A continuación, pipetee los analitos de la biblioteca de cribado en las placas de pocillos.

Prepare cada analito por triplicado para tener en cuenta las posibles variaciones de pocillo a pocillo y las fluctuaciones de la intensidad de excitación o la temperatura. Aumente el objetivo mientras monitorea los espectros de emisiones utilizando el espectrómetro y la matriz de arseniuro de indio y galio. La posición óptima del objetivo colocará el plano focal aproximadamente en el centro del volumen de muestra en el pocillo, que debe corresponder a un máximo en la intensidad medida.

Para cada pocillo de muestra, registre una exposición de uno a 10 segundos para recopilar un espectro. Compare los espectros de emisiones de cada pozo con un control que contenga solo SWNT sin analito adicional, para cuantificar la respuesta de fluorescencia. El espectro de absorbancia de los sensores de nanotubos de ADN GT15 muestra múltiples picos correspondientes a nanotubos de carbono bien dispersos de diferente quiralidad.

Se muestra la fluorescencia del infrarrojo cercano de los sensores de nanotubos de ADN GT15. Curiosamente, la intensidad de la fluorescencia se duplica aproximadamente en respuesta a la dopamina. En esta figura, la microscopía de fluorescencia de infrarrojo cercano revela sensores de nanotubos de ADN GT15 individuales inmovilizados en la superficie de un cubreobjetos de vidrio.

De cara al futuro, es importante probar el sensor para su uso in vivo, por ejemplo, ampliando la biblioteca de analitos para incluir competidores moleculares, probando la linealidad de la respuesta en el régimen de concentración biológicamente relevante y también probando la reversibilidad. Una vez dominado, este enfoque se puede utilizar para crear una biblioteca de diferentes sensores sintéticos a partir de moléculas sin elementos de reconocimiento molecular conocidos.