Name: Ingeniería Molecular Recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende a preparar nanotubos de carbono de pared única funcionalizados con polímeros anfifílicos y ADN para detección molecular. Este método permite el sensado de dopamina en tejido vivo mediante fluorescencia en infrarrojo cercano.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio Burroughs Wellcome Fund a la Carrera en la Interfaz Científica (CASI), una beca de la Fundación Simons y una beca para jóvenes investigadores de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento.

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (SDS) antes de su uso. Los nanomateriales pueden tener riesgos adicionales en comparación con su contraparte material a granel. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas, incluyendo controles de ingeniería (campana de humos, recinto de ruido) y el equipo de protección personal (gafas de seguridad, gafas, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos). 1. Preparación del tampón, tensioactivo y Polymer Solutions <ol><li> Preparación de solución de NaCl 100 mM <ol><li> Disolver 584 mg de NaCl en 80 ml de agua desionizada. Añadir agua desionizada para llevar el volumen total a 100 ml. </li></ol></li><li> Preparación de 3% de dodecilsulfato de sodio solución (SDS) <ol><li> Disolver 3 g de SDS en 80 ml de agua desionizada. Añadir agua desionizada para llevar el volumen total a 100 ml. </li></ol></li><li> Preparación de colato de sodio 2% de solución (SC) <ol><li> Disolver 2 g de SODium colato hidrato en 80 ml de agua desionizada. Añadir agua desionizada para llevar el volumen total a 100 ml. </li></ol></li><li> Preparación del tampón de imagen (1x Tris: Tris 20 mM, NaCl 100 mM) <ol><li> Disolver 22,23 g de base Tris y 58,44 g de NaCl en 500 ml de agua desionizada usando una barra de agitación magnética y la placa. </li><li> Añadir cuidadosamente HCl concentrado hasta que se alcanza un pH de 8,1. </li><li> Añadir agua desionizada para alcanzar un volumen final de 1 L. </li></ol></li><li> Síntesis del polímero RITC-PEG-RITC <ol><li> Disolver amina polietilenglicol difuncionalizado (PEG) (5 kDa o 20 kDa, 0.1 mol / L) e isotiocianato de rodamina (RITC, 0.2 mol / L) en 1 ml de una mezcla 1: 1 de diclorometano y dimetilformamida (DMF). </li><li> Añadir 0,2 mol / L de N, N-diisopropiletilamina (DIEA). </li><li> Después de 3 h, precipitar con 10 volúmenes de éter dietílico, seguido de filtración a vacío. </li><li> Se vuelve a disolver en DMF y repetir Follo precipitación éterconducido por filtración al vacío. NOTA: Otras moléculas modificadas isotiocianato (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, FITC) se puede unir a PEG u otros polímeros modificados con amina usando un método similar. </li></ol></li><li> Preparación de ADN-pegilado (PEG-DNA) <ol><li> Combinar 100 l de Tris (2-carboxietil) fosfina solución de clorhidrato de (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) con 44,9 l de 5 &#39;modificado con tiol de ADN (1 mg / 10 l de 0,1 M NaCl) y se añade a 4,855 ml de agua desionizada. </li><li> Se agita durante 1 h. </li><li> Disolver 500 mg de metoxipolietilenglicol maleimida glicol en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato. </li><li> Combinar las soluciones de ADN y PEG (10 ml total) y se agita durante 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de una sola pared nanotubos de carbono Suspensiones (SWNT) <ol><li> Lavado de SWNT para eliminar el catalizador y las impurezas. <ol><li> Añadir 200-300 mg de SWNT sin lavar en un tubo de centrífuga de plástico contacaniza 45 ml de agua desionizada. </li><li> Vortex la solución durante 2 min y se somete a ultrasonidos utilizando un sonicador de baño durante 5 min. Tenga en cuenta que sonicador configuración varían de un instrumento a otro, a fin de comprobar que la densidad óptica de la solución aumenta SWNT (es decir, se vuelve negro) para asegurar que los SWNT se dispersan. </li><li> Centrifugar la solución durante 20 min a 16.100 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir aproximadamente 45 ml de agua desionizada fresca. </li><li> Repita los pasos 2.1.2-2.1.4 hasta 8 veces. </li><li> Eliminar el agua tanto como sea posible teniendo cuidado de no molestar a los nanotubos sedimentadas y permitir pellets SWNT se seque al aire. </li></ol></li><li> Suspensiones de ácido nucleico de SWNT <ol><li> Disolver ácidos nucleicos (NA) en 0,1 M NaCl a una concentración de 100 mg / mL. </li><li> Retire la electricidad estática de espátula desechable, tubos de microcentrífuga y SWNT stock mediante una pistola antiestática. En una campana de humos, se añaden 20 l de la solución de AN a 980 l de 00,1 M NaCl seguido por la adición de 1 mg SWNT. </li><li> El uso de un ultrasonicador con punta de 3 mm de diámetro, sonicar la solución durante 10 minutos a 40% de la amplitud en un baño de hielo. </li><li> Centrifugar la solución de ADN-SWNT dos veces durante 90 minutos a 16.100 x g. Si el uso de PEG-ADN, purificar y eliminar el exceso de ADN que no ha reaccionado y PEG usando un spin-filtro de 100 kDa. Agregar suficiente PBS para llenar el spin-filtro y centrifugado a 9.300 xg durante 1,5 minutos, Repita este paso de lavado 3 veces. </li><li> Recoger y guardar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento que contiene los paquetes y los agregados de la CNT. Se desecha el precipitado de conformidad con los procedimientos de desechos peligrosos institucionales apropiadas para los nanomateriales. </li><li> Medir la absorbancia solución a 632 nm utilizando un espectrofotómetro UV / Vis espectrofotómetro para determinar la concentración aproximada de los nanotubos en suspensión utilizando ε = 0,036 L / cm · mg de acuerdo con la ley de Lambert-Beer y el factor de dilución apropiado. </li></ol></li><li> Suspensiones de polímeros anfifílicosde SWNT <ol><li> Retire la electricidad estática de espátula desechable, microtubos de centrífuga, y SWNT de valores. En una campana de extracción, añadir 5 mg SWNT a 5 ml de solución de SC 2% (alternativamente, solución de SDS se puede utilizar). </li><li> El uso de un ultrasonicador con punta 6 mm de diámetro, sonicar la solución durante 1 h en 40% de la amplitud en un baño de hielo. </li><li> la muestra se centrifuga a 150.000 xg durante 4 h utilizando una ultracentrífuga y recoger cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Disolver 1% en peso de polímero anfifílico (por ejemplo, RITC-PEG-RITC) en solución SC-SWNT. </li><li> Se dializa la solución de polímero-SC-SWNT utilizando una membrana de diálisis 3,5 kDa contra 1 L de agua desionizada o tampón durante 5 días. Cambiar el agua o tampón después de horas y 2 horas 4. Una membrana de diálisis más grande puede ser usada, con tal de que permite la eliminación del agente tensioactivo de elección, pero la retención tanto de la SWNT y el polímero anfifílico. </li><li> Medir la absorbancia solución a 632 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS para determinarconcentración aproximada de los nanotubos en suspensión utilizando ε = 0,036 L / cm * mg de acuerdo con la ley de Lambert-Beer y el factor de dilución apropiado. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de superficie inmovilizada Sensores SWNT <ol><li> Preparación de soluciones madre neutravidina BSA-biotina y <ol><li> Disolver 10 mg de liofilizado BSA-biotina en 1 ml de agua desionizada para preparar una solución de 10 mg ml / acción y se almacena a 4 ° C. </li><li> Disolver 10 mg de proteína NeutrAvidin (NAV, desglicosilada proteína avidina) en 2 ml de agua desionizada para preparar una solución madre 5 mg / ml. almacenar alícuotas a -20 ° C. alícuotas descongeladas se pueden mantener durante varios días a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar BSA-biotina portaobjetos de microscopio recubiertos <ol><li> Limpiar un portaobjetos de microscopio y vidrio de 0,17 mm de la cubierta (o según sea apropiado para el objetivo del microscopio) con agua desionizada, seguido de metanol, acetona y un enjuague final de agua desionizada. </li><li&gt; Crear canales mediante la colocación de varias piezas de cinta adhesiva de doble cara aproximadamente 5 mm de separación en el portaobjetos limpio. Sellar los canales mediante la adopción de un cubreobjetos de vidrio de longitud y presionando sobre la parte superior de la cinta de doble cara. Asegúrese de que se centra en el portaobjetos de un microscopio de modo que los bordes de la hoja de la cubierta y el tobogán no están al ras. </li><li> Añadir 100 ml de BSA-biotina solución madre de 900 l de tampón de 1x Tris a una concentración final de 1 mg / mL. </li><li> De flujo 50 l de la solución de BSA-biotina en el canal pipeteando la solución en un extremo y con efecto de mecha de distancia solución en el otro usando un pañuelo de papel. Incubar durante 5 minutos, seguido de 3-5 rubores con 50 l de 0,1 M NaCl. </li><li> Diluir 40 l de 5 mg / mL de stock NAV en 960 l de tampón 1x Tris a una concentración final de 0,2 mg / mL. </li><li> De flujo 50 l de la solución de NAV en el canal pipeteando la solución en un extremo y con efecto de mecha de distancia solución en el otro usando un pañuelo de papel. Incubar durante 2-5 minutosseguido de 3-5 descargas con 50 l de 0,1 M NaCl. </li><li> Diluir las soluciones madre de los SWNT en suspensión en tampón de formación de imágenes a una concentración de 1 a 10 mg / L y el flujo de 50 l de la solución en el canal y se incuba durante 5 min. </li><li> Enjuague suavemente el exceso de distancia SWNT con 50 l de buffer de imágenes. </li></ol></li><li> Preparación de APTES silanizado portaobjetos de microscopio NOTA: APTES silanizan portaobjetos permiten una manera de inmovilizar SWNT ADN envuelto con carga negativa a la superficie de un sustrato de vidrio. <ol><li> Preparar una solución de 10% de (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) en etanol. </li><li> El uso de canales realizados siguiendo los pasos descritos en el apartado 3.2.2, el flujo en 100 l de tampón de Tris 1x. </li><li> Enjuague el canal con solución de APTES y se incuba durante 5 min. Lavar con 1 x tampón Tris. </li><li> Diluir las soluciones madre de ADN-SWNT en suspensión en tampón de formación de imágenes a una concentración de 1 a 10 mg de flujo / Tierra 50 l de la solución en el canal y incubcomió durante 5 min. </li><li> Enjuague suavemente el exceso de distancia SWNT con 50 l de buffer de imágenes. </li></ol></li></ol> 4. espectroscopia de fluorescencia y microscopía de SWNT Sensores <ol><li> Nir microscopía de fluorescencia <ol><li> Realizar las imágenes de la superficie de los nanotubos inmovilizados por excitación láser y un microscopio invertido equipado con una serie de sensores de InGaAs para la imagen. </li><li> Dirigir el rayo láser para entrar en el puerto de iluminación posterior de un microscopio invertido usando espejos en los montajes cinemáticos ajustables y un par de diafragmas con puestos montados fijados a la altura del puerto. Compruebe que el haz esté nivelada y recta mediante la confirmación de su paso por ambos iris cuando se coloca entre los espejos posteriores y antes de que entre en el puerto de iluminación. Si es necesario, ajuste la altura del haz usando un conjunto de periscopio. Quitar los filtros de calor de paso corto en el puerto de iluminación que atenuaría la viga. </li><li> Inserte un cubo de filtro adecuado en el microscopiopara reflejar la luz de excitación en el objetivo y recoger la luz de emisión. Este consiste típicamente en un filtro de paso largo dicroico con un punto de corte por encima de la longitud de onda de excitación, (por ejemplo, 750 LP) y un filtro de paso largo de emisión (por ejemplo, 850 LP) para minimizar aún más la luz de excitación dispersa de golpear el sensor. Además, el filtro de emisión puede elegirse para que sea selectivo para la emisión de SWNT de una quiralidad particular. </li><li> Realizar ajustes precisos en la alineación del haz mediante la inserción de un cubo de alineación apropiada reemplazando el objetivo con dos discos de compensación, esmerilado que contienen agujeros de 1 mm. Alinear el haz del centro de ambos los discos de alineación inferior y superior. </li><li> Adjuntar un array sensor 2D InGaAs al puerto de imágenes lado del microscopio utilizando un adaptador apropiado y una lente 0.5X si es necesario para acomodar el tamaño del sensor. </li><li> El uso de un 100X objetivo de inmersión en aceite (1,4 NA), aplique aceite de inmersión libre de la fluorescencia y colocar el immobilized muestra de SWNT en la platina del microscopio. </li><li> Elevar el objetivo hasta que los contactos de aceite de la parte inferior de la cubierta de vidrio (# 1.5, 170 espesor m). Realizar ajustes en el cuello objetivo si es necesario para las condiciones de formación de imágenes, por ejemplo, temperatura, espesor del vidrio, etc. </li><li> Lentamente levante el objetivo con la fuente de excitación y controlar en la señal de fluorescencia de la cámara InGaAs. La intensidad de fluorescencia debe aumentar gradualmente a medida que el plano focal se aproxima a la superficie y los sensores inmovilizados entrar en foco. </li></ol></li><li> Nir espectroscopia de fluorescencia NOTA: La espectroscopia de fluorescencia se puede realizar utilizando la misma configuración de microscopio, pero por la dirección de la luz recogida fuera del cuerpo del microscopio y en un espectrómetro y InGaAs detector de matriz lineal. <ol><li> El uso de montajes cinemáticos y espejos clasificados para Nir, dirigir la trayectoria de la luz hacia la rendija de entrada del espectrómetro. Enfocar la luz hacia abajo a un POInt en la entrada de hendidura utilizando una lente de enfoque (por ejemplo, plano-convexa, f = 150 mm). Esta alineación se logra mediante la atenuación de la potencia del láser a &lt;1 mW y la sustitución del objetivo del microscopio con un espejo 1 &quot;y el uso de un filtro de cubo divisor de haz 50/50. La luz de excitación y luego dejará el cuerpo del microscopio a través del orificio de salida y puede ser utilizado para ajustar los espejos y lente para enfocar el haz sobre la rendija de entrada. </li><li> Después de reemplazar el objetivo del microscopio y el filtro de paso largo, colocar una placa en el escenario y registrar los espectros de una muestra de enfoque utilizando el espectrómetro y la matriz de InGaAs. </li></ol></li><li> Medición de la respuesta reversible de (GT) 15 ADN-SWNT a dopamina <ol><li> Montar el sensor recubierto canales más en la platina del microscopio y se analizan detalladamente utilizando un objetivo de aceite de 100X y la cámara InGaAs. Añadir 50 l de 100 mM solución dopamina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para el canal de flujo y el registroel cambio en la intensidad de fluorescencia. </li><li> Lavar la solución de dopamina utilizando solución salina tamponada con fosfato y observar el cambio en la fluorescencia de los sensores individuales SWNT. </li></ol></li><li> Detección de placa de pocillos para la respuesta de los sensores de analito SWNT NOTA: Proyección de diferentes analitos se puede realizar utilizando una placa transparente controlada utilizando una platina motorizada. Una placa de ideal es transparente a la visible y de infrarrojos y tiene paredes laterales negras para minimizar la interferencia entre los pozos. <ol><li> De pipeta volúmenes iguales de sensor SWNT suspendido (por ejemplo, 5 mg / L de concentración) en cada pocillo, lo suficiente para cubrir el fondo del pozo de manera uniforme, normalmente&gt; 100 l para una placa de 96 pocillos y&gt; 30 l para una placa de 384 pocillos . </li><li> Analitos de pipeta (por ejemplo, 2 l, 100 mM volumen final) a partir del cribado de biblioteca en las placas. Preparar cada analito por triplicado para tener en cuenta el potencial acomodada así variación, fluctuationes de intensidad de excitación, o la temperatura. </li><li> Elevar el objetivo (por ejemplo, 20X Achroplan, 0,45 NA) durante el seguimiento de los espectros de emisión utilizando el espectrómetro y matriz de InGaAs. posición óptima del objetivo pondrá el plano focal aproximadamente en la mitad del volumen de muestra en el pozo, que debe corresponder a un máximo en la intensidad medida. </li><li> Para cada pocillo de muestra, la exposición grabar un 1-10 s para recoger un espectro. </li><li> Comparación de los espectros de emisión para cada pocillo a un control que contiene sólo SWNT sin analito adicional para cuantificar la respuesta de fluorescencia. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

SWNT se suspenden fácilmente en solución acuosa a través de sonicación directa con SDS o ssDNA, como se indica por un aumento en la densidad óptica proporcionada por la dispersión coloidal del híbrido SWNT-polímero resultante. SDS y ssDNA dispersa y solubiliza haces de SWNT por adsorción sobre la superficie de SWNT a través de interacciones hidrofóbicas o pi-pi. Adicionalmente, otros polímeros, tales como ADN genómico, polímeros anfifílicos, polímeros conjugados y los lípidos, pueden ser adsorbidos sobre la superficie d...

Los nanotubos de carbono de pared simple (SWNT) son atómicamente delgadas capas de átomos de carbono laminados en cilindros largos y delgados que exhiben propiedades electrónicas y ópticas únicas. 1 Tales propiedades incluyen una producción cercano (NIR) la emisión infrarroja de fluorescencia a través de recombinación de excitones que es altamente sensible a su entorno local de intervalo de banda. La emisión NIR de SWNT cae dentro de la ventana de infrarrojo cercano en el que la profundidad de penetración de la luz es máxima para el tejido biológico. 2,3 Además, los nanotubos exhiben varias características únicas atípicos en contraste con fluoróforos orgánicos: SWNT exhiben un gran desplazamiento de Stokes, no photobleach, y no parpadean. 4 Recientemente, la explotación de estas características se ha llevado al desarrollo de una variedad de sensores moleculares novedosas con aplicaciones a la biología. 5,6 sin modificar, sin embargo, SWNT son insolubles en agua, y la obtención de suspensiones de SWNT individuales puede ser un desafío. 7,8 Bundling y la agregación de los nanotubos en solución pueden ocultar su fluorescencia banda prohibida, 2 haciéndolos inadecuados para aplicaciones de detección. La dispersión de los nanotubos de carbono individuales en solución acuosa requiere la modificación de su superficie para evitar la agregación hidrofobicidad impulsada. 9 Si bien la modificación covalente puede hacer que los nanotubos soluble en agua, 10, así como impartir la química de unión específica, los sitios con defectos en la red cristalina de SWNT reducen o reducir su emisión de fluorescencia. En su lugar, SWNT funcionalización se puede lograr mediante el uso de tensioactivos, lípidos, polímeros y ADN 9,11 - 13 que se adsorben a la superficie de nanotubos a través de interacciones de apilamiento hidrófobos y pi-pi. El ambiente químico resultante que rodea SWNT funcionalizados en la superficie se conoce como la fase de corona. Las perturbaciones a la fase de corona pueden tener un gran impacto en los excitones que viajan sobre la superficie de nanotubos, causando modulaciones a SWNT fluorEscence emisión. Es esta relación sensible entre la fase de corona y la fluorescencia SWNT que puede ser explotado para desarrollar nuevos sensores moleculares mediante la incorporación de modalidades de unión específicos a la gran área de superficie de SWNT. Las perturbaciones a la fase de corona SWNT sobre analito de unión pueden dar lugar a cambios en el entorno dieléctrico local, transferencia de carga, o introducir defectos en la red, todos los cuales pueden modular la emisión de fluorescencia de los SWNT para servir como un mecanismo de transducción de señales. 14 Este enfoque se utiliza en el desarrollo de sensores fluorescentes novedosos para la detección de muchas clases diferentes de moléculas de ADN incluyendo, 15,16 glucosa 17 y moléculas pequeñas tales como ATP, 18 especies reactivas de oxígeno 19 y el óxido nítrico. 20,21 Sin embargo, estos enfoques están limitados en que se basan en la existencia de una modalidad de unión conocida para el analito objetivo. Recientemente, una aplicación más genéricaRoach para el diseño de sensores fluorescentes se desarrolló utilizando SWNT funcionalizados de forma no covalente con heteropolímeros anfifílicos, fosfolípidos y ácidos polinucleicos. Estas moléculas se adsorben a las superficies de nanotubos de carbono para producir suspensiones altamente estables de SWNT individuales 22 - 25 con fases de corona únicas que pueden unirse específicamente a las proteínas 26,27 o pequeñas moléculas que incluyen el neurotransmisor dopamina. 28 - 30 Ingeniería de la fase de corona para dispersar los nanotubos y específicamente analitos diana se unen se conoce como fase de reconocimiento molecular de corona (CoPhMoRe). 28 El pequeño tamaño, baja toxicidad, alta estabilidad y unbleaching fluorescencia de sensores NIR CoPhMoRe SWNT los hacen excelentes candidatos para la detección in vivo para las mediciones de tiempo de resolverse prolongados. 6 Trabajos recientes han demostrado sus aplicaciones en tejidos de la planta para la detección óptica de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno. 31Una aplicación particularmente interesante para los sensores CoPhMoRe SWNT es el potencial para la detección sin etiqueta de neurotransmisores tales como la dopamina in vivo, donde otras técnicas, tales como un sensor electroquímico o inmunohistoquímica, sufren de una falta de resolución espacial, la resolución temporal, y especificidad. El diseño y el descubrimiento de sensores CoPhMoRe SWNT ha sido hasta ahora restringido por el tamaño y la diversidad química de la biblioteca dispersante, lo que limita las posibilidades de encontrar un sensor para un objetivo particular. Hasta la fecha, los investigadores sólo han arañado la superficie de conjugado disponibles, co-bloque, biológica y polímeros biomiméticos que podrían servir como dispersantes funcionalmente activas para sensores de SWNT. A continuación, presentamos diferentes métodos tanto para la dispersión de los nanotubos y la caracterización de su fluorescencia de cribado de alto rendimiento para el análisis y el único sensor de SWNT. Específicamente, se describe el procedimiento para los nanotubos de pintura, haciendo oligom ácido polinucleicoERS mediante sonicación directa, así como la forma de funcionalizar SWNT con polímeros anfifílicos a través del intercambio de surfactante mediante diálisis. Utilizamos (GT) 15-DNA y polietilenglicol funcionalizado con isotiocianato de rodamina (RITC-PEG-RITC) como ejemplos. Se demuestra el uso de (GT) 15 -ADN SWNT como un sensor CoPhMoRe para la detección de la dopamina. Por último, se describe procedimientos para realizar mediciones de sensor molécula individuales, que se pueden utilizar para la caracterización o la detección de moléculas individuales.

<table><tbody><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>hidrato de colato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>tris base (Trizma base)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Amina-PEG-amina, NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato de rodamina B</td><td>Sigma Aldrich 283924</td><td></td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>dimetilformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ADN modificado con tiol 5'&nbsp;</td><td>Tecnologías integradas de ADN</td> metoxipolietilenglicol <td></td><td></td></tr><tr><td>maleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de centrifugación de 100 kDa</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Nanotubos de carbono de pared simple superpurificados</td><td>Integris</td><td>HiPco Solución</td> salina tamponada con fosfato superpurificado <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>pistola antiestática</td><td>Milty</td><td>Milty centrífuga Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>ultra sonicador</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>casetes de diálisis</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotina</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de neutravidina</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano (APTES)</td><td>Microscopio invertido Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Espejos cinemáticos Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Periscopio</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td>Aceite de</tr> inmersión <tr><td></td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X</td><td>Zeiss</td><td>Plan-apocromático 100X aceite, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>20X objetivo</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de dopamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cámara de matriz 2D infrarroja</td><td>Princeton Instruments</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>matriz de sensores 1D infrarrojos</td><td>Princeton Instruments</td><td>PyLoN Espectrógrafo</td> IR <td></td></tr><tr><td>nIR</td> Princeton <td>Instruments</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>lente planoconvexa</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>placas de pocillos (fondo de vidrio)</td><td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería molecular recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Los nanotubos de carbono semiconductores de pared simple (SWNTs) son una clase de nanomaterial ópticamente activo que emite fluorescencia en el infrarrojo cercano, coincidiendo con la ventana óptica donde las muestras biológicas son más transparentes. Aquí, describimos técnicas para adsorber polímeros anfifílicos y ácidos polinucleicos en la superficie de SWNTs para diseñar sus fases de corona y crear nuevos sensores moleculares para moléculas pequeñas y proteínas. Estos sensores SWNT funcionalizados son biocompatibles y estables. Los polímeros se adsorben en la superficie de los nanotubos, ya sea mediante sonicación directa de SWNT y polímero o mediante la suspensión de SWNT mediante un surfactante seguido de diálisis con polímero. La emisión de fluorescencia, la estabilidad y la respuesta de estos sensores a los analitos objetivo se confirman mediante espectroscopia de absorbancia y fluorescencia de infrarrojo cercano. Además, demostramos la inmovilización de la superficie de los sensores en portaobjetos de vidrio para permitir que la microscopía de fluorescencia de una sola molécula caracterice la adsorción de polímeros y la cinética de unión de analitos.

SWNT se suspendieron en solución acuosa utilizando ambos tensioactivos y polímeros anfifílicos por sonicación directa y por intercambio de diálisis. La Figura 1 muestra los nanotubos, que se cultiva utilizando el método catalizado carbonilo de hierro (HiPCO), suspendido usando SC, RITC-PEF20-RITC, y (GT) 15-DNA. La densidad óptica de un SWNT con SDS (o polímero) aumenta drásticamente después de la sonicación y disminuye después de la retirada de los agregados ...

Presentamos un protocolo para diseñar la fase corona de nanotubos de carbono fluorescentes de pared simple (SWNT) de infrarrojo cercano utilizando polímeros anfifílicos y ADN para desarrollar sensores para objetivos moleculares sin elementos de reconocimiento conocidos.

Ingeniería Molecular Recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar nanotubos de carbono fluorescentes de pared simple en el infrarrojo cercano para la detección molecular que se han funcionalizado utilizando polímeros biomiméticos. Estos nanosensores pueden permitir la obtención de imágenes resueltas en el tiempo en tejido vivo. Por ejemplo, se pueden usar para detectar dopamina en el cerebro.La principal ventaja de estos sensores es su fluorescencia inherente al infrarrojo cercano, que permite obtener imágenes más profundas en el tejido. Los sensores sintéticos permiten la detección de moléculas sin elementos naturales de reconocimiento molecular, lo que hace que este método genérico de desarrollo de sensores sea especialmente útil para la detección de moléculas pequeñas. Para preparar una suspensión de ácido nucleico de SWNT, primero disuelva los ácidos nucleicos en cloruro de sodio 0,1 molar a una concentración de 100 miligramos por mililitro.En una campana extractora, elimine la electricidad estática de la espátula desechable, los tubos de microcentrífuga y la culata SWMT con una pistola antiestática. A continuación, agregue 20 microlitros de la solución de ácido nucleico a 980 microlitros de cloruro de sodio 0,1 molar. A continuación, añada 1 miligramo de SWNT lavados a la solución de ácido nucleico resultante antes de sonicar la mezcla.La posición de la punta de la sonda durante la sonicación es fundamental. Si se produce espuma, vuelva a colocar la punta de la sonda e intente reducir la amplitud. Alternativamente, puede probar los pulsos de sonicación o la sonicación en baño si la suspensión sigue siendo pobre.Utilizando un ultrasonido con una punta de 3 milímetros de diámetro, sonicar la solución durante 10 minutos al 40% de amplitud en un baño de hielo. Centrifugar la solución de ADN SWNT dos veces durante 90 minutos a 16, 100 xg. Recoja y conserve el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la pelletiza que contiene haces de nanotubos de carbono y agregados.Deseche el pellet de acuerdo con los procedimientos institucionales de residuos peligrosos apropiados para nanomateriales. Mida la absorbancia de la solución a 632 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV-vis para determinar la concentración aproximada de SWNT en suspensión, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer, y el factor de dilución apropiado. En el caso de las suspensiones de polímeros anfifílicos, primero elimine la electricidad estática de la espátula desechable, los tubos de microcentrífuga y el material SWNT.En una campana extractora, agregue cinco miligramos de SWNT a cinco mililitros de solución de colato de sodio al 2%. Utilizando un ultrasonido con una punta de seis milímetros de diámetro, sonicar la solución durante una hora al 40% de amplitud en un baño de hielo. Centrifugar la muestra a 150.000 xg durante cuatro horas utilizando una ultracentrífuga, antes de recoger cuidadosamente el sobrenadante.A continuación, disuelva el 1% en peso del polímero anfifílico en la solución scSWNT. A continuación, dialice la solución de polímero scSWNT utilizando una membrana de diálisis de 3,5 kilodalton frente a un litro de agua desionizada o tampón durante cinco días. Cambie el agua o el amortiguador a la hora dos y a la hora cuatro.Mida la absorbancia de la solución a 632 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV-Vis para determinar la concentración aproximada de SWNT suspendidos. Para preparar los portaobjetos recubiertos de biotina BSA, limpie un portaobjetos de microscopio y un cubreobjetos de 0,17 milímetros con agua desionizada, seguido de metanol, acetona y un enjuague final con agua desionizada. Cree canales colocando varios trozos de cinta adhesiva de doble cara a una distancia aproximada de cinco milímetros en el portaobjetos de microscopio limpio.Selle los canales tomando un cubreobjetos de vidrio largo y presionándolo sobre la parte superior de la cinta adhesiva de doble cara. Asegúrese de centrarlo en el portaobjetos del microscopio para que los bordes de la cubierta y el portaobjetos no queden al ras. A continuación, agregue 100 microlitros de solución madre de biotina BSA a 900 microlitros de tampón Tris 1x hasta una concentración final de un miligramo por mililitro.Fluya 50 microlitros de la solución de biotina BSA en el canal pipeteando la solución en un extremo y absorbiendo la solución en el otro extremo con un pañuelo de papel. Después de incubar la solución durante cinco minutos, realice de tres a cinco lavados con 50 microlitros de cloruro de sodio 0,1 molar. A continuación, diluya 40 microlitros de cinco miligramos por mililitros de solución madre NAV en 960 microlitros de tampón Tris 1x, hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro.Fluya 50 microlitros de la solución NAV en el canal pipeteando la solución en un extremo y absorbiendo la solución en el otro extremo con un pañuelo de papel. Después de incubar el portaobjetos durante dos a cinco minutos, realice de tres a cinco lavados con 50 microlitros de cloruro de sodio 0,1 molar. A continuación, diluya las soluciones madre de SWNT en suspensión y el tampón de imagen hasta una concentración de 1 a 10 miligramos por litro.Fluya 50 microlitros de esta solución en el canal e incube durante cinco minutos. Enjuague suavemente el exceso de SWNT con 50 microlitros de tampón de imagen. Para medir la respuesta reversible de los ADN-SWNT GT15 a la dopamina, primero monte los canales recubiertos por el sensor en la platina del microscopio de fluorescencia.Enfoca los canales con un objetivo de aceite 100X y una cámara de arseniuro de indio y galio. Luego, agregue 50 microlitros de solución de dopamina de 100 micromolares en solución salina tamponada con fosfato al canal de flujo y registre el cambio en la intensidad de la fluorescencia. Lave la solución de dopamina con solución salina tamponada con fosfato y observe el cambio en la fluorescencia de los sensores SWNT individuales.Para realizar el cribado de la placa de pocillo para la respuesta del analito de los SWNT de polímeros biomiméticos, pipetee volúmenes iguales del sensor SWNT suspendido en cada pocillo. Use suficiente volumen para cubrir el fondo del pozo de manera uniforme. A continuación, pipetee los analitos de la biblioteca de cribado en las placas de pocillos.Prepare cada analito por triplicado para tener en cuenta las posibles variaciones de pocillo a pocillo y las fluctuaciones de la intensidad de excitación o la temperatura. Aumente el objetivo mientras monitorea los espectros de emisiones utilizando el espectrómetro y la matriz de arseniuro de indio y galio. La posición óptima del objetivo colocará el plano focal aproximadamente en el centro del volumen de muestra en el pocillo, que debe corresponder a un máximo en la intensidad medida.Para cada pocillo de muestra, registre una exposición de uno a 10 segundos para recopilar un espectro. Compare los espectros de emisiones de cada pozo con un control que contenga solo SWNT sin analito adicional, para cuantificar la respuesta de fluorescencia. El espectro de absorbancia de los sensores de nanotubos de ADN GT15 muestra múltiples picos correspondientes a nanotubos de carbono bien dispersos de diferente quiralidad.Se muestra la fluorescencia del infrarrojo cercano de los sensores de nanotubos de ADN GT15. Curiosamente, la intensidad de la fluorescencia se duplica aproximadamente en respuesta a la dopamina. En esta figura, la microscopía de fluorescencia de infrarrojo cercano revela sensores de nanotubos de ADN GT15 individuales inmovilizados en la superficie de un cubreobjetos de vidrio.De cara al futuro, es importante probar el sensor para su uso in vivo, por ejemplo, ampliando la biblioteca de analitos para incluir competidores moleculares, probando la linealidad de la respuesta en el régimen de concentración biológicamente relevante y también probando la reversibilidad. Una vez dominado, este enfoque se puede utilizar para crear una biblioteca de diferentes sensores sintéticos a partir de moléculas sin elementos de reconocimiento molecular conocidos.

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Investigación

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