Recogida de suero y libre de alimentador madre embrionarias de ratón medio celular acondicionado para un enfoque libre de células

Los objetivos generales de este protocolo son recolectar medio condicionado de células madre embrionarias de ratón en condiciones de cultivo libre de suero y alimentador y caracterizar las funciones biológicas de este medio. Este procedimiento proporciona información sobre la actividad antisenescente de los factores solubles secretados por las células madre embrionarias de ratón para el desarrollo de un enfoque terapéutico seguro y libre de células para las enfermedades relacionadas con la edad. El Dr. Yun-Ui Bae, profesor investigador de mi laboratorio, demostrará este procedimiento.

En una campana de seguridad biológica, trate un fibroblasto embrionario de ratón o un cultivo de células MEF con 20 mililitros de medio MEF suplementado con mitomicina C en una placa de cultivo celular de 15 centímetros durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación, lavar las células tres veces con PBS y separarlas con tres mililitros de tripsina EDTA durante tres minutos a 37 grados centígrados. Neutralizar la tripsina con seis mililitros de medio MEF fresco cuando las células se han levantado del fondo de la placa.

Después de recolectar las células por centrifugación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio MEF y coloque dos veces 10 a la sexta placa de cultivo inactivada por plato de cultivo de 10 centímetros en medio MEF fresco. Cultive las células alimentadoras durante 24 horas. A continuación, sustituya el medio MEF por un medio de células madre embrionarias de ratón y siembre dos veces 10 hasta la sexta células madre embrionarias de ratón en los alimentadores durante al menos 48 horas de cocultivo.

En una campana de seguridad biológica, enjuague una placa de células madre embrionarias de ratón con cinco mililitros de PBS y separe las células con tripsina más EDTA como se acaba de demostrar. Después de recolectar las células por centrifugación, vuelva a suspender la pastilla de células madre en cinco mililitros de medio de células madre frescas y coloque un mililitro de células por placa en medio de células madre embrionarias frescas en cinco placas de cultivo celular recubiertas de gelatina. Regrese las células a la incubadora hasta que los cultivos alcancen un 80-85% de confluencia.

A continuación, enjuague las células con al menos ocho mililitros de PBS por placa durante tres lavados de 10 minutos, seguidos de una incubación de 24 horas en medio sérico reducido. Después de no más de 24 horas, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación. Seguido de la filtración a través de un colador de tapa de botella de 0,2 micrómetros.

Para probar los efectos del medio condicionado con células madre embrionarias mediante un ensayo de beta galactosidasa asociada a la senescencia, siembre fibroblastos dérmicos humanos en una placa de seis pocillos en un medio de fibroblastos dérmicos humanos. Después de una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, reemplace la mitad del medio con medio acondicionado con células madre embrionarias de ratón frescas para otro cultivo de 72 horas. Al tercer día de cultivo, enjuague las células en dos mililitros de PBS por pocillo durante dos lavados de 30 segundos.

A continuación, fije las células en paraformaldehído al 3,7% durante cinco minutos a temperatura ambiente en una campana extractora. Después de la fijación, lave las células dos veces con dos mililitros de PBS, como se acaba de demostrar, y etiquete las células con uno o dos mililitros de solución de GA beta gal durante 17 horas y media a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono. Al final del período de tinción, lave las células dos veces con PBS como se acaba de demostrar.

A continuación, contramanche con Eosen durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de otra serie de lavados de PBS, obtenga imágenes de las células con un aumento de 100 veces mediante microscopía óptica. Para el análisis del ciclo celular, siembre ocho veces 10 al cuarto fibroblasto dérmico humano por pocillo en una placa de cultivo celular de seis centímetros en medio de fibroblasto dérmico humano fresco para una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

A la mañana siguiente, reemplace la mitad del medio con medio acondicionado con células madre embrionarias de ratón y devuelva las células a la incubadora. Después de 24 horas, recoja las células por disociación de tripsina EDTA seguida de dos lavados en un mililitro de solución de PBS. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de solución fría de PBS después del segundo lavado.

Luego, fije las celdas con la aplicación gota a gota a 200 microlitros de etanol frío mientras se agita el vórtice. Guarde las celdas a cuatro grados centígrados durante al menos una hora. Luego, lávelos en una solución fresca de PBS.

Después de la segunda centrifugación, trate el pellet con 250 microlitros de tampón de citrato de sodio suplementado con RNasa durante 30 minutos a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono. Al final de la incubación, etiquete las células con 250 microlitros de tampón de citrato de sodio que contenga yoduro de propidio durante 20 minutos. A continuación, evalúe las etapas del ciclo celular de cada muestra mediante citometría de flujo.

Para el análisis cuantitativo de PCR con transcriptasa inversa, utilice un kit de extracción de ARN para aislar el ARN total de fibroblastos dérmicos humanos tratados en medio con células madre embrionarias de ratón tratadas en medio de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ARN total extraído. A continuación, formule la mezcla de reacción que contenga los cebadores de oligo desoxitimidina y la transcriptasa inversa M-MLV de acuerdo con el protocolo del fabricante.

A continuación, añada un microgramo del ARN total al tubo de PCR que contiene la mezcla de reacción. Por último, mida la amplificación del CDNA con una máquina de PCR en tiempo real utilizando la mezcla maestra de PCR verde y los cebadores genéticos adecuados. Las células madre embrionarias de ratón cultivadas en condiciones normales de cultivo de células madre embrionarias de ratón en una capa de células alimentadoras de MEF muestran una forma ovalada y un aspecto brillante.

Mientras que las células madre embrionarias de ratón cultivadas en condiciones de cultivo sin suero y alimentador muestran una morfología aplanada e irregular. El tratamiento del fibroblasto dérmico humano senescente con medio condicionado con células madre embrionarias de ratón disminuye el número de células senescentes asociadas a la betagalactosidasa positiva. Además, el análisis del ciclo celular de estas células revela que el tratamiento con medio condicionado con células madre embrionarias de ratón aumenta drásticamente el número de células en las fases S y G2/M, mientras que reduce el número de células en la fase G0/G1.

Además, el tratamiento con células madre embrionarias de ratón disminuye la expresión de genes asociados a la senescencia y de citocinas secretarias asociadas con el fenotipo senescente. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar recolectar el suero y el medio libre de alimento después de 24 horas, ya que una incubación prolongada aumenta la posibilidad de autolisis celular o apoptosis por inanición. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar suero y medio condicionado de células madre embrionarias de ratón libres de alimento para un enfoque libre de células.

No olvide que trabajar con reactivos como el paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como manipular este reactivo en una campana extractora, al realizar este procedimiento.