Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar y caracterizar una población de células intraepiteliales no convencionales, linfocitos T gamma delta, a partir de una muestra de cepillado endocervical humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la comprensión de los eventos inmunitarios dentro del compartimento intraepitelial endocervical, lo que contribuirá al diseño de estrategias eficaces para prevenir infecciones. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta potente y eficiente para estudiar los linfocitos T gamma delta intraepiteliales endocervicales in vitro.

La procedimiento será demostrado por Laura Romero, una investigadora asociada sénior de mi laboratorio. Inmediatamente después de la recolección, coloque el tubo que contiene el citobrush sobre hielo. Dentro de una hora a partir de la recolección, vortexee el tubo que contiene el citobrush durante cuatro pulsos de 10 segundos.

Luego, centrifugue el tubo y retire cuidadosamente el cepillo sin perturbar la paleta. A continuación, agregue un mililitro de medio IMDM a las células y coloque el tubo en hielo. Coloque el citobrush encima de un colador celular de 100 milímetros en un tubo cónico de 50 mililitros y lave el cepillo con 20 mililitros de IMDM fresco.

Centrifugar el lavado. Suspender nuevamente la muestra en un mililitro de IMDM fresco y combinar el lavado con las células en el tubo original de recolección con citobrush. Para analizar las células endocervicales mediante citometría de flujo, distribuir de una a tres veces 10 a la quinta células en 100 microlitros de tampón fax por tubo de cinco mililitros, y etiquetar las células con los anticuerpos y el colorante de viabilidad de interés durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.

Al final de la incubación, lave las células con un mililitro del tampón del kit. Después de centrifugar las células, deseche completamente el sobrenadante. Utilice perlas y los anticuerpos de control IgG apropiados para establecer los controles de compensación.

Luego, cargue el primer tubo y establezca la compuerta sobre la población total de células endocervicales en un diagrama de dispersión hacia adelante frente al dispersión lateral, seguido de la exclusión de los dobletes celulares. Excluya las células muertas según la expresión del colorante de viabilidad, aplicando la compuerta sobre las células vivas positivas para CD45 y positivas para CD3. Las células positivas para gamma delta uno y gamma delta dos se definen como las subpoblaciones de células positivas para CD3 que expresan el TCR gamma delta.

Para aislar las células T gamma delta mediante aislamiento con microperlas magnéticas, re suspenda hasta un multiplicado por 10 a la séptima de células endocervicales recién obtenidas en 40 microlitros de tampón del kit de microperlas TCR gamma delta. Siguiendo las instrucciones del fabricante para el protocolo de tinción en dos pasos, marque las células con el anticuerpo hapten anti-TCR gamma delta, seguido de microperlas conjugadas con FITC anti-hapten durante 15 minutos a cuatro a ocho grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células en un mililitro de tampón del kit y deseche completamente el sobrenadante.

Resuspenda las células en 500 microlitros de tampón del kit y aplique directamente la suspensión celular sobre una columna de perlas magnéticas colocada en el imán separador adecuado, recolectando el flujo atravesado en un nuevo tubo. Una vez que todas las células hayan pasado a través de la columna, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón fresco y reúna los lavados con las células recolectadas. Para recolectar las células T gamma delta, transfiera la columna a un tubo cónico y use el émbolo de la columna para lavar las células T desde la columna con un mililitro de tampón fresco.

Para aislar las células T gamma delta mediante clasificación celular activada por fluorescencia, marque las células con un colorante de viabilidad, en el panel de anticuerpos tal como se acaba de demostrar. Luego, ordene las células según su positividad al colorante de viabilidad y a CD45, CD3 y gamma delta. Una población única de células T que expresan gamma delta V1 puede detectarse fácilmente en muestras de células endocervicales humanas.

El análisis fenotípico detallado de las células positivas para CD3 y gamma delta uno positivas revela que la mayoría de estas células son negativas para CD4 y CD8. La separación mediante perlas magnéticas de las células endocervicales, como se acaba de demostrar, da como resultado la purificación de una población casi 98% pura de estas células TCR gamma delta. Este nivel de pureza también puede lograrse mediante clasificación celular activada por fluorescencia, lo que valida el uso de cualquiera de estas técnicas para el aislamiento de células T gamma delta endocervicales.

Curiosamente, el análisis de células intraepiteliales endocervicales y células T gamma delta, aisladas de pacientes femeninas infectadas con VIH y controles donantes sanos, demuestra una ligera reducción en el número y viabilidad de estas células importantes en individuos infectados con VIH. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos o tres horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar procesar rápidamente la muestra y mantener las células sobre hielo durante todo el procedimiento, para conservar una buena viabilidad celular.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación individual de células combinada con una PCR multiplex de alto rendimiento y alta sensibilidad, para responder preguntas adicionales sobre las vías inflamatorias y de señalización dentro del compartimento intraepitelial endocervical. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH y las enfermedades infecciosas exploraran nuevos marcadores celulares de vulnerabilidad mucosal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar linfocitos intraepiteliales a partir de una muestra de cepillado endocervical humano.