Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar y caracterizar una población de células T gamma delta de células intraepiteliales no convencionales a partir de una muestra de cepillo endocervical humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la comprensión de los eventos inmunológicos dentro del compartimento intraepitelial endocervical, para ayudar en el diseño de estrategias efectivas para prevenir infecciones. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta potente y eficiente para el estudio de los linfocitos T gamma delta intraepiteliales endocervicales, in vitro.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Laura Romero, investigadora asociada sénior de mi laboratorio. Inmediatamente después de la recolección, coloque el tubo que contiene el citocepillo sobre hielo. Dentro de una hora después de la recolección, agite el tubo que contiene el citocepillo durante cuatro pulsos de 10 segundos.

Luego, centrifuga el tubo y retira con cuidado el pincel sin alterar la paleta. A continuación, agregue un mililitro de medio IMDM a las celdas y coloque el tubo sobre hielo. Coloque el citocepillo encima de un colador de celdas de 100 milímetros en un tubo cónico de 50 mililitros y lave el cepillo con 20 mililitros de IMDM fresco.

Centrifuga el lavado. Resuspender la paleta en un mililitro de IMDM fresco, y pool con lavado con las células en el tubo de recogida del citocepillo original. Para analizar las células endocervicales por citometría de flujo, alícuota de una a tres veces 10 a la quinta célula en 100 microlitros de tampón de fax por tubo de cinco mililitros, y etiquetar las células con los anticuerpos y el colorante de viabilidad de interés durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.

Al final de la incubación, lave las células en un mililitro del tampón del kit. Después de girar las celdas, decanta completamente el sobrenadante. Utilice perlas y los anticuerpos de control IgG adecuados para establecer los controles de compensación.

A continuación, cargue el primer tubo y establezca la compuerta en la población total de células endocervicales en un diagrama de dispersión hacia adelante a lado, seguido de la exclusión de los dobletes de células. Excluir las células muertas de acuerdo con su viabilidad de expresión de colorante, activando las células vivas CD45 positivas y CD3 positivas. Las células gamma delta uno y gamma delta dos positivas se definen como las subpoblaciones de células CD3 positivas que expresan gamma delta TCR.

Para aislar las células T gamma delta mediante el aislamiento magnético de perlas, vuelva a suspender hasta una vez 10 a la séptima célula endocervical recién recolectada en 40 microlitros de tampón TCR gamma delta MicroBead. Siguiendo las instrucciones del fabricante para el protocolo de tinción de dos pasos, etiquete las células con el anticuerpo anti-TCR gamma delta hapteno, seguido de MicroBeads conjugadas anti-hapteno FITC durante 15 minutos a cuatro a ocho grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las células en un mililitro del tampón del kit y decantar completamente el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón del kit y aplique la suspensión de células directamente sobre una columna de perlas magnética colocada en el imán separador adecuado, recogiendo el flujo en un nuevo tubo. Cuando todas las células hayan pasado por la columna, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón fresco y junte los lavados con las células recogidas. Para recolectar las células T gamma delta, transfiera la columna a un tubo cónico y use el émbolo de la columna para eliminar las células T de la columna con un mililitro de tampón nuevo.

Para aislar las células T gamma delta mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia, etiquete las células con un colorante de viabilidad, en el panel de anticuerpos como se acaba de demostrar. Luego, clasifique las células de acuerdo con su tinte viable y la positividad de CD45, CD3 y gamma delta. Una población única de células T que expresan gamma delta V1 puede detectarse fácilmente en muestras de células endocervicales humanas.

El análisis fenotípico detallado de las células gamma delta one positivas para CD3 cerradas revela que la mayoría de estas células son CD4 y CD8 negativas. La separación magnética de las células endocervicales, como se acaba de demostrar, da como resultado la purificación de una población de casi el 98% de estas células TCR gamma delta. Este nivel de pureza también se puede lograr mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia, lo que valida el uso de cualquiera de las técnicas para el aislamiento de células T gamma delta endocervicales.

Curiosamente, el análisis de las células intraepiteliales endocervicales, las células T gamma delta, extraídas de pacientes femeninas infectadas por el VIH y de donantes sanos de control, demuestra una ligera reducción en el número y la viabilidad de estas células importantes en las personas infectadas por el VIH. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos o tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar procesar rápidamente la muestra y mantener las células en hielo durante todo el procedimiento, para mantener una buena viabilidad celular.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de células individuales combinada con una PCR múltiple de alto rendimiento de alta sensibilidad, para responder preguntas adicionales sobre las vías inflamatorias y de señalización dentro del compartimento intraepitelial endocervical. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del VIH y las enfermedades infecciosas exploraran nuevos marcadores celulares de vulnerabilidad de la mucosa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar linfocitos intraepiteliales a partir de una muestra de cepillo endocervical humano.