Name: Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a aislar y analizar células gamma delta T intraepiteliales del endocérvix humano mediante citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar respuestas inmunitarias locales in vitro con alta pureza.

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Agradecemos a los participantes en el estudio Miami WIHS por su disposición a participar en este trabajo. Los datos en este manuscrito fueron recogidos por el Estudio Interinstitucional VIH en Mujeres Miami (WIHS). Los contenidos de esta publicación son de la exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas y el Estudio de la Infección Interagencial del VIH de la Mujer (WIHS) [beca número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud [número de concesión P30AI073961], Centro Nacional para el Avance Ciencias de transferencia y el Instituto Nacional de Salud para Minorías y disparidades de Salud, Instituto Nacional de Salud [número de concesión UL1TR000460 y 1KL2TR000461], y el Instituto Nacional de Salud infantil y Desarrollo humano, Instituto Nacional de Salud [número de concesión K23HD074489].

Las actividades de estudio se llevaron a cabo en la Universidad de la Unidad de Investigación del VIH de Miami, en colaboración con Estudio de Mujeres Miami VIH Interagencial (WIHS) y el Centro de Miami para la Investigación del SIDA (CFAR) .Institutional Junta de Revisión (Universidad de Miami Miller School of Medicine) se obtuvo la aprobación previa a la contratación y los procedimientos de evaluación o estudio relacionado. 1. Recogida de muestras endocervicales Cepillo NOTA: Los participantes se sometieron a un examen vaginal realizado por MD entrenado o ginecólogo y colección de los linfocitos intraepiteliales fueron realizadas bajo examen con espéculo mediante la inserción de citocepillo. <ol><li> características de los participantes <ol><li> Reclutar mujeres participantes que tienen edades comprendidas de 18 a 45 años de edad, sexualmente activas, no embarazadas y no en medicamentos anticonceptivos o con un dispositivo intrauterino. </li><li> Antes de la exploración vaginal, pida a los participantes se someten a un retiro de 10 ml de sangre en verdetop tubos al vacío de heparina para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). para servir como control para el análisis intraepitelial endocervical 9. </li></ol></li><li> Recolección de las muestras endocervicales <ol><li> Insertar un espéculo estéril del tamaño adecuado en la vagina sin lubricación. Use un agua caliente para facilitar la inserción del espéculo y gasa estéril para limpiar el moco. La posición del espéculo permite la visualización completa del sistema operativo y el exocérvix. </li><li> Inserte cepillo endocervical en el conducto cervical hasta que sólo las cerdas más cercanos a la mano son visibles. Girar el cepillo de las agujas del reloj para 360 °. Transferir el cepillo en un tubo de 15 ml que contenía 5 ml de medio IMDM. </li><li> Inmediatamente después de la recolección, se coloca el tubo que contiene citocepillo en hielo. Para obtener una alta viabilidad de las células intraepiteliales recogidos, entregar el citocepillo al laboratorio y proceso dentro de 1 h. </li></ol></li></ol><ol><li> tubo de vórtice que contiene citocepillo endocervical la aplicación de 4 tiempos (10 seg) cortos. </li><li> Centrifugar el tubo, que contiene cytobrush, durante 10 minutos a 250 x g. </li><li> Retire cuidadosamente la cytobrush desde el tubo (no molestar el sedimento en el fondo del tubo) y se añade 1 ml de medio IMDM y colocar el tubo en hielo. </li><li> Coloque el cytobrush en el filtro de células 100 mm en la parte superior del tubo 50 ml. </li><li> Lavar el citocepillo con 20 ml de IMDM. </li><li> Tubo de centrífuga durante 10 min a 250 x g. </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 1 ml de IMDM y se combinan con el sedimento se volvió a suspender ya descrito en el punto 2.3. </li><li> Contar las células usando un contador de células automatizado 10 o contar las células usando un hemocitómetro mediante la combinación de 10 l de la suspensión celular con 10 l de colorante azul de tripano. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo diez veces para mezclar las células y el tinte. Carga de 10 lde la mezcla en la abertura de una de las dos cámaras de hemocitómetro. Contar todas las células en las cinco áreas de la cuadrícula. Mantenga un recuento separado de las células viables y no viables. Determinar la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula:% de células viables = células no viables x 100 células totales / número de células. Determinar la concentración posterior de células por ml (y el número total de células) usando los siguientes cálculos. Las células totales por ml x = células totales contadas (factor de dilución / número de cuadrados contados) x 10.000 células / ml. </li><li> Congelar las células endocervicales aislados utilizando medio de congelación que contiene 10% de DMSO y 90% de SFB. </li></ol> 3. citometría de flujo <ol><li> Vuelva a suspender 1-3 x 10 5 células endocervicales en 100 l de tampón FACS (PBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino </li><li> Añadir 1 l / 10 6 LIVE / DEAD kit Muerto Amarillo corregible de la mancha de células y anticuerpos para marcadores de superficie en las concentraciones descritas en la Tabla 1. </li><li> Se incuban las células durante 30 minutos a 4 ° C, protegido de la luz. </li><li> Añadir 1 ml de tampón FACS y las células y los tubos de centrífuga durante 5 minutos a 350 xg </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular en 300 l 1% de paraformaldehído. </li><li> Preparar los controles de compensación usando perlas y los anticuerpos utilizados para la tinción mediante la adición de 100 l de tampón de FACS y una gota de las perlas y la misma concentración de los anticuerpos utilizados para la tinción de la muestra. </li><li> Adquirir perlas de colores y muestras en un citómetro de flujo, equipado con 405 nm, 488 nm y 635 nm láseres. </li></ol> 4. aislamiento de células endocervicales gamma delta T <ol><li> Aislamiento de perlas magnéticas <ol><li> Vuelva a suspender el sedimento celular endocervical (≤10 7 células totales), se describe en 2.6, en 40 l de tampón incluido en el kit de microperlas gamma delta TCR referencia en la tabla de Materiales y Reactivos. </li><li> Siga las instrucciones del juego para protocolo de tinción de dos pasos: en primer lugar, el ingenioh anti-TCR gamma delta hapteno-anticuerpo y el segundo, con anti-hapteno microperlas-FITC </li><li> Después de la incubación de 15 min a 4-8 ° C, se lavan las células mediante la adición de 1 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante invirtiendo el tubo, y toque seco con la ayuda de un trozo de papel. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón proporcionado y preparar la columna magnética, colocándolo en un separador magnético adecuado de acuerdo con el protocolo del proveedor. </li><li> Aplicar la suspensión celular en la columna y recoger las células no marcadas que atraviesan la columna y lavar 3 veces con cantidad apropiada de tampón (500 l). Realizar las etapas de lavado mediante la adición de tampón tres veces, cada vez una vez que el depósito de la columna está vacía. Recoger efluente total. Esta es la fracción de células sin marcar, negativo </li><li> Eliminar la columna forman el separador magnético y una pipeta de 1 ml de tampón en la columna y de inmediato a eliminar fracción con la etiqueta magnéticamentecélulas ed aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna. NOTA: gamma-delta, aislada de células T ya están manchadas con fluorescencia para el análisis por citometría de flujo, ya marcadas magnéticamente microperlas anti-hapteno se conjugan con FITC colorante fluorescente. </li></ol></li><li> la clasificación de células <ol><li> Para la clasificación de células, la etiqueta células endocervicales con troquel viabilidad y panel de anticuerpos tal como se describe en la sección 3. </li><li> Configurar puertas electrónicas en el vivo, CD45 + CD3 + y delta gamma células positivas y llevar a cabo la clasificación de células. </li></ol></li></ol>

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<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials%3A+an+international+multi-site+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, e85675(2014).</li>
<li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen asociación comercial o de otro tipo que puedan suponer un conflicto de intereses (por ejemplo, la propiedad de existencias de productos farmacéuticos, de consultoría, de miembros del Consejo Asesor, las patentes pertinentes, o financiación de la investigación).

Evaluación de la vulnerabilidad de la mucosa del tracto genital inferior femenino es un componente esencial de los estudios clínicos que abordaron riesgo de adquisición y transmisión del VIH. Típicamente FGT vulnerabilidad a la infección del VIH se evalúa midiendo moduladores inmunes solubles en las secreciones genitales (citoquinas, quimioquinas y péptidos antimicrobianos) 12, 13. Sin embargo, estos biomarcadores son sólo indicativos de inflamación vaginal, se ...

Desarrollamos metodología de la utilización de muestras de cepillo endocervical para evaluar las células T intraepiteliales GD. El canal cervical está recubierto por una sola capa de epitelio columnar. Linfocitos intraepiteliales representan linfocitos de primera línea que residen dentro de la capa epitelial que rápidamente pueden iniciar la respuesta inmune al encontrarse con microbios patógenos 7, 8. La comprensión de los eventos inmunológicos del compartimiento intraepitelial endocervical es importante para el diseño de estrategias eficaces para prevenir las infecciones, incluido el VIH. Nuestro método se puede aplicar para muestras endocervicales humanas recién recogidos, así como células endocervicales congelados para explorar aún más el papel de las células T GD intraepiteliales en mujeres con infección por VIH o en riesgo de infección por el VIH. El principal objetivo de este protocolo es descubrir nuevos eventos inmunológicos en el compartimiento intraepitelial endocervical y para evaluatlas respuestas de células T e GD como un marcador de la vulnerabilidad de la mucosa en mujeres con infección por VIH. Las lagunas en el conocimiento en torno a la inmunidad FGT se deben en parte a la dificultad en la recolección y procesamiento de muestras de mucosa con éxito. Por otra parte, el complejo de la heterogeneidad de las células inmunológicas de las mucosas, y su interconexión con otros, son los principales retos para la identificación de medidas clínicamente relevantes que reflejan el estado y la capacidad del sistema inmunológico. Hemos desarrollado un método para obtener células T intraepiteliales GD altamente purificadas que pueden ser analizados utilizando tecnologías altamente multiplexados, unicelulares que pueden ser críticos para la identificación de los mecanismos subyacentes de la inmunidad FRT más.

<table><tbody><tr><td>Cytobrush Plus GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, San Diego, CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific 12440061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>contador de células automatizado Beckman Coulter (el analizador de viabilidad celular de la serie Vi-CELL</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>496178</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, dimetilsulfóxido&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Suero Fetal Bovino</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas amarillas reparables&nbsp;</td><td>Life</td> <td>Technologies,L349S9</td><td></td></tr><tr><td>1% paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo Fortessa&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.)</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit&nbsp;</td><td>Milteny Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>Columna</td><td></td> MS <td>103-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separador</td><td></td> MACS <td>4124</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y análisis de citometría de flujo, de human endocervical gamma delta t cells

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

El tracto reproductivo (FRT) del sistema inmune de la mucosa femenina sirve como la primera línea de defensa. Un mejor conocimiento de la mucosa genital tanto, es esencial para la comprensión de la patogenicidad de diferentes patógenos, incluyendo el VIH. Gamma delta células (GD) T son el prototipo de células T &quot;no convencionales&quot; y representan un grupo relativamente pequeño subconjunto de células T definidas por su expresión de receptores de células T (TCR) heterodiméricas compuestas de cadenas gamma y delta. Esto los diferencia de las células T clásicos y mucho mejor conocidos CD4 + helper y células T citotóxicas CD8 + que están definidas por los TCR alfa-beta. GD células T a menudo muestran la localización específica de tejido y se enriquecen en el epitelio. células T GD orquestan la respuesta inmune en la inflamación, la vigilancia de tumores, enfermedades infecciosas, y la autoinmunidad. A continuación, presentamos un método para aislar y analizar los linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos GD T reproducible. nos hacinco muestras endocervicales cytobrush utilizados de mujeres que participan en el Estudio de la Infección por VIH Interinstitucional de la Mujer (WIHS). El conocimiento acerca de GD células T interacciones durante las condiciones en las que hay un insulto a la mucosa vaginal se podría aplicar a cualquier estudio clínico en el que se dirige la vulnerabilidad de la mucosa, incluyendo el desarrollo de la adición microbicides.In vaginal, el conocimiento de las respuestas de células de la mucosa GD T tiene potencial para la aplicación de la terapia inmune basada en células T GD en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Recientemente, se analizaron las células T intraepiteliales GD endocervicales y que fueron los primeros en reportar sobre la pérdida de células T gamma delta endocervical en mujeres infectadas por el VIH 9, 11. Aquí, se describe el protocolo para aislar y analizar el subconjunto de células T gamma delta endocervical. Como se muestra en la Figura 1, las células T GD pueden ser detectados fácilmente en las muestras...

Describimos aquí un método de aislamiento para obtener linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos para el análisis de células T gamma delta intraepiteliales. Este protocolo puede ampliarse para la purificación de las células T gamma delta endocervicales mediante perlas magnéticas o mediante clasificación de células.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar y caracterizar una población de células intraepiteliales no convencionales, linfocitos T gamma delta, a partir de una muestra de cepillado endocervical humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la comprensión de los eventos inmunitarios dentro del compartimento intraepitelial endocervical, lo que contribuirá al diseño de estrategias eficaces para prevenir infecciones. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta potente y eficiente para estudiar los linfocitos T gamma delta intraepiteliales endocervicales in vitro.La procedimiento será demostrado por Laura Romero, una investigadora asociada sénior de mi laboratorio. Inmediatamente después de la recolección, coloque el tubo que contiene el citobrush sobre hielo. Dentro de una hora a partir de la recolección, vortexee el tubo que contiene el citobrush durante cuatro pulsos de 10 segundos.Luego, centrifugue el tubo y retire cuidadosamente el cepillo sin perturbar la paleta. A continuación, agregue un mililitro de medio IMDM a las células y coloque el tubo en hielo. Coloque el citobrush encima de un colador celular de 100 milíme

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método para expandir las células T γδ a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se describe. PBMC derivados de las células T γδ se estimulan y se expandió con zoledronato y la interleucina 2 (IL-2). La expansión a gran escala de las células T γδ se puede aplicar a la inmunoterapia celular autólogo de cáncer.

Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Este video muestra un protocolo para el aislamiento basado en marcaje magnético de una población de baja concentración de células T CD4 + Vδ1 + γδ de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Utilizando una combinación de anticuerpos anti-Vδ1 conjugados con FITC, microesferas magnéticas anti-FITC y perlas superparamagnéticas recubiertas de anticuerpos anti-CD4, las células T CD4 + Vδ1 + se pueden purificar con éxito a partir de la población de PBMC.

Aislamiento selectivo de células T CD4+ Vδ1+ γδ de células mononucleares de sangre periférica humana

El uso de la toma de muestras por citocepillo para recolectar linfocitos y monocitos del endocérvix es una técnica mínimamente invasiva que proporciona muestras para el análisis de la inmunidad del tracto genital femenino. En este protocolo, describimos la recolección de muestras de citocepillo y el aislamiento de células inmunitarias para ensayos de citometría de flujo.

Colección, Aislamiento, y citometría de flujo análisis de las muestras endocervicales Humano

Aquí, proporcionamos un protocolo optimizado para el aislamiento y clonación de la escasa entidad de células T periféricas Vδ1+CD4+ que es, como demostramos recientemente, un progenitor de células T αβ extratímicas. Esta técnica permite aislar, clonar y expandir eficientemente estas células en cultivo ex vivo.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Este artículo describe espectral citometría, un nuevo enfoque en la citometría de flujo que utiliza las formas de los espectros de emisión para distinguir fluorocromos. Un algoritmo reemplaza compensaciones y puede tratar autofluorescencia como un parámetro independiente. Este nuevo enfoque permite el análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

Aquí, un protocolo para el aislamiento y la caracterización de CD4+ T-cell se describe subconjuntos de sangre periférica humana. Purificada de CD4+ las células T son analizadas por citometría de flujo para determinar proporciones de subconjuntos de células helper T-folicular.

Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Se presenta un protocolo para la expansión del producto farmacológico de células T Gamma-Delta (γδ). Los linfocitos se aíslan por elutriación y se enriquecen con γδ con ácido zoledrónico e interleucina-2. Las células T alfa-beta se agotan utilizando un dispositivo de separación magnética de grado clínico. Las células γδ se cocultivan con células artificiales presentadoras de antígenos derivadas de K562 y se expanden.

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.

Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

El presente protocolo describe un flujo de trabajo experimental que permite el análisis ex vivo de la estimulación de células T humanas en un sistema de cocultivo alogénico con células tumorales pretratadas.

Análisis de la actividad de las células T humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas

Aprende a aislar y analizar células gamma delta T intraepiteliales del endocérvix humano mediante citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar respuestas inmunitarias locales in vitro con alta pureza.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

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