Name: El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende el ensayo de monocapa de monocitos para evaluar la fagocitosis mediada por receptores Fc gamma usando células de sangre humana. Este método permite predecir resultados de transfusiones en pacientes con anticuerpos preformados.

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Los autores agradecen a los Servicios Canadienses de Sangre por un Premio del Programa de Becas de Posgrado a T.N.T. Esta investigación recibió apoyo financiero del Centro Canadiense de Innovación de los Servicios de Sangre, financiado por el gobierno federal (Health Canada) y los ministerios de salud provinciales y territoriales. Las opiniones expuestas en este documento no reflejan las opiniones de los gobiernos federales, provinciales o territoriales de Canadá.

Obtener la aprobación para el uso de muestras humanas por la junta junta de revisión ética de la investigación / institucional, y obtener el consentimiento firmado de todos los donantes humanos. El MMA también se puede realizar utilizando PBMCs de ratón de una manera similar como el ensayo humano, después de la aprobación de uso de animales de la ética. El MMA utiliza técnicas de cultivo de tejidos asépticas. NOTA: Consulte la Figura 1. NOTA: Aunque se recomienda el uso de una cámara de flujo laminar nivel 2 durante el ensayo para mantener una técnica aséptica, ya que el método sólo es un método de cultivo &quot;a corto plazo&quot;, no hay tiempo suficiente para que realmente las bacterias contaminen el ensayo. Por lo tanto, si una cámara de flujo laminar nivel 2 no existe, en lugar de comprar uno sólo para este ensayo, el ensayo se podría realizar fuera de una cámara de flujo laminar, en un banco abierto. El uso de una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2, sin embargo, no es una opción y debe ser utilizado pararesultados óptimos. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica 1. <ol><li> Obtener sangre humana entera de un donante sano o de un paciente a través de la punción venosa utilizando vacutainers que contienen ácido-citrato-dextrosa anticoagulante (ACD) (amarillo-tubos superiores). NOTA: La sangre entera se puede almacenar en ACD a temperatura ambiente (18-22 ° C) durante hasta 36 h antes de proceder al siguiente paso 11. Normalmente, 1-2 10 mL tubos vacutainer de sangre entera son suficientes para el ensayo. </li><li> Diluir la sangre completa 1: 1 v / v en caliente medio RPMI completo (RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, HEPES 20 mM, y 0,01 mg / ml de gentamicina). </li><li> Aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la sangre entera diluida utilizando centrifugación en gradiente de densidad, según lo recomendado por el fabricante (Ver Lista de Materiales). La capa de sangre diluida muy lentamente sobre el gradiente de densidad (calentó a temperatura ambiente, 18-22 ° C). NOTA: Minimizar la cantidad de mixing en la interfaz para la separación óptima de la sangre por capas cuidadosamente la mezcla de la sangre de una forma gota a gota o mediante el uso de una pipeta. <ol><li> Dejar que la mezcla de sangre a la capa lentamente sobre la parte superior de la gradiente de densidad mediante la colocación de la punta de la pipeta cerca del gradiente de densidad y al permitir que la mezcla de sangre que corra por el lado del tubo muy lentamente. </li><li> Dependiendo de la escala del experimento, la capa de 10 ml de mezcla de sangre en la parte superior de 3 ml de gradiente de densidad (en un tubo de 15 ml) o capa de 35 ml de mezcla de sangre en la parte superior de 15 ml de gradiente de densidad (en un 50-ml tubo). Típicamente, 10 ml de sangre completa produce 10 millones de PBMCs, con alguna variación de donante a donante. NOTA: Es muy importante que no hay mezcla de la mezcla de sangre con el gradiente de densidad. La mezcla de sangre debe capa sobre el gradiente de densidad y aumentando lentamente hasta que toda la sangre es en la parte superior del gradiente de densidad. </li><li> Se centrifuga la mezcla en capas a 700 xg durante 30 min sin frenos. el centrifuged mezcla debe separarse en 5 capas (de arriba a abajo): plasma, capa leucocitaria (que contiene PBMC), material de gradiente de densidad, granulocitos y eritrocitos. </li><li> Retirar y desechar la mayoría de la plasma y recuperar cuidadosamente el contenido de la capa leucocitaria (PBMC) en un nuevo tubo de 15 ml usando una pipeta Pasteur y un bulbo de succión. NOTA: La eliminación de la capa de la capa leucocitaria se hace efectiva mediante la aplicación de succión en la pipeta Pasteur mientras se realiza un movimiento circular alrededor del exterior de la capa, con la punta de la pipeta contra el tubo. </li></ol></li><li> Lavar las PBMCs aisladas tres veces en pH 7,3 solución salina tamponada con fosfato (PBS) por centrifugación a 350 xg durante 10 min (con frenos completos) entre lavados. Reconstituir el sedimento de PBMC en medio completo RPMI. Dependiendo del tamaño de la pastilla, 3-7 ml de medio es suficiente. </li><li> Contar el CMSP usando azul tripán y un hemocitómetro. Sólo contar esas células que no están manchados por el azul de tripano. Reconstitute las PBMC a 1.750.000 células / ml en medio RPMI completo. </li><li> Seed 400 l (700.000 células) en cada pocillo de un porta-cámara de 8. Incubar el portaobjetos en un 37 ° C, incubadora de cultivo de tejidos totalmente humidificado (suplementado con 5% de CO 2) durante 1 h para permitir que los monocitos / macrófagos se adhieran. </li></ol> 2. Pre-tratamiento de monocitos Adheridos NOTA: Este paso sólo es necesario si buscando la manera de inhibir o potenciar la fagocitosis. <ol><li> Pre-tratamiento adherido monocitos con cualquier fármaco (s) o compuesto (s) de interés. Reconstituir el fármaco (s) u otro material de ensayo a la concentración deseada con medio completo RPMI. NOTA: Por ejemplo, 200 mg / ml de IVIG se usa típicamente para producir una inhibición del 95 a 100% de la fagocitosis utilizando monocitos humanos. </li><li> Aspirar y descartar el sobrenadante que contiene las células no adherentes de la corredera 8-cámara después de la 1 h de incubación (después del paso 1.6). Reemplazarlo con 400l de un fármaco u otro tratamiento y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. <ol><li> Al aspirar y sustitución de las soluciones en el portaobjetos de 8 cámaras, asegúrese de controlar el flujo de los fluidos de manera que las células débilmente adheridas no se despegan. Además, trabajar con sólo 2-3 pocillos vacíos a la vez y evitar el secado de los pozos. NOTA: Por lo general, cada tratamiento se realiza por triplicado técnicas. </li></ol></li></ol> 3. La opsonización de R 2 R 2 Glóbulos Rojos NOTA: El R2 R2 utiliza aquí se obtienen de la Colección Centro de Sangre (Canadian Blood Services), pero también están disponibles en el mercado. 2 RBCs opsonizado R 2 R se utilizan como un control positivo para la fagocitosis mediada por FcyR. Naïve R 2 R 2 se debe almacenar en solución de Alsever (para prolongar la vida útil) a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. solución de Alsever se hace en la casa y consta de 0,8% W / v de ácido cítrico v de citrato trisódico (dihidrato), 1.9% w / v de dextrosa, 0,42% w / v de cloruro de sodio, y 0,05% w / (monohidrato). Si R 2 R 2 células no están disponibles, otras células phenotyped-Rh, tales como R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, o R 2 r, se puede utilizar. <ol><li> Lavar R2 R2 (CDE / CDE) de glóbulos rojos en PBS con un total de tres veces usando centrifugación a 350 xg durante 5 minutos cada uno. NOTA: La cantidad de glóbulos rojos necesarios depende del tamaño experimental y puede ser calculado de nuevo. Siempre lave una cantidad en exceso de los glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se pierden durante cada lavado debido a la lisis o durante la eliminación del sobrenadante. Por ejemplo, en un experimento con 5 tratamientos y 2 controles, todos llevados a cabo por triplicado técnicos, hay un total de 21 pozos. 21 pozos con 400 mezcla de l / pocillo de 1,25% RBC indica que 105 l de empaquetado, opsonizado se necesitan RBC. 200 l de RBC se debe lavar inicialmente y 150 &amp; #181; L debe opsonizado para asegurar que hay una cantidad adecuada de glóbulos rojos para la etapa de la fagocitosis. </li><li> Opsonizar el lavado R 2 R 2 pellet con 1: 1 de anticuerpos / v policlonales v anti-D a partir de suero humano y se incuba durante 1 h a 37 ° C, con mezclado intermitente. NOTA: Si los anticuerpos policlonales anti-D no están disponibles, es posible usar anticuerpos monoclonales anti-D, que están disponibles comercialmente, o anti-D que se utiliza normalmente para Rh profilaxis inmune, que puede obtenerse de bancos de sangre o transfusión servicios. pruebas de optimización debe llevarse a cabo al principio, al establecer el ensayo, y cuando vaya a cambiar un montón de anticuerpos policlonales un-titularon o cambiar a un anticuerpo monoclonal. Esto es para identificar la concentración óptima o volumen de anti-D requerida para una prueba de antiglobulina (IAT) resultado de entre 3+ y 4+ y un resultado de la fagocitosis de entre 70 a 90 eritrocitos fagocitados por 100 monocitos contados. </li><li> Lavar el opsonized R 2 R 2 un total de tres veces en PBS mediante centrifugación a 350 xg durante 5 min cada uno. NOTA: opsonización exitosa de R 2 R 2 se puede confirmar mediante la realización de un IAT indirecta. Brevemente, se añaden secundarias anticuerpos anti-humanos policlonales para unirse a anticuerpos de opsonización primarias en superficies de glóbulos rojos, y la señal amplificada se pueden observar en la forma de la hemaglutinación. Un protocolo detallado fabricante se puede encontrar en el archivo de materiales suplementarios. </li><li> Reconstituir el lavado R 2 R 2 pellet al 1,25% v / v utilizando un medio completo RPMI. NOTA: El exceso de R opsonizado 2 R 2 se puede almacenar en solución de Alsever a 4 ° C durante un máximo de una semana. </li></ol> 4. La fagocitosis mediada por el receptor Fc <ol><li> Aspirar el fármaco o sobrenadante del medio de la corredera 8-cámara y añadir 400 l de la 1,25% v / v R 2 R 2 mezcla. Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> En popaer 2 h de incubación, retirar las cámaras que utilizan los adaptadores del fabricante. Frote el exceso de R2 R2 en una toalla de papel. Asegúrese de que la corredera no se seque. </li><li> Llenar un vaso de precipitados de 100 ml con PBS. Sumergir y lavar el carro moviendo lentamente la corredera hacia atrás y hacia adelante (en torno al 30-40 trazos) para eliminar la mayor parte de la ONU-fagocitados R2 R2. </li><li> Retire el portaobjetos del PBS. Frote el exceso de PBS usando una toalla de papel o tejido y seque al aire la diapositiva. </li><li> Fijar el portaobjetos se secaron al aire en metanol al 100% durante 45 s. A continuación, seque al aire la corredera fija. NOTA: Las diapositivas se pueden solucionar con otro método que es más compatible para la tinción de aguas abajo, tales como la mancha Grünwald-Giemsa 21 o la mancha de Wright-Giemsa 22. </li><li> Montar el porta por la en-casa-hecho de montaje Elvanol medio (u otro medio de montaje disponible en el mercado) y añadir cubreobjetos. NOTA: Elvanol medio de montaje se compone de 15% w / v poresina de alcohol lyvinyl y 30% v / v de glicerina en PBS. La mezcla se calienta hasta que toda la resina se haya disuelto y la glicerina es homogéneamente mezclado. Esto puede ser sustituido por otro medio de montaje disponible en el mercado. </li><li> Deje que el montaje se seque durante la noche antes de la cuantificación. </li></ol> 5. La cuantificación de la fagocitosis <ol><li> Utilizando un microscopio de contraste de fase y una lente objetivo de 40X, cuantificar manualmente la cantidad de eventos fagocíticas contando al menos 200 monocitos y el número de fagocitados R 2 R 2 dentro de estos monocitos. Tener un contador en cada mano para cuantificar simultáneamente el número de monocitos y el número de fagocitados R 2 R 2. </li><li> Obtener el índice fagocítico promedio dividiendo el número de fagocitados R 2 R 2 por el número de monocitos y multiplicando por 100. expresar los datos como la media (promedio) de índice fagocítico ± el error estándar de la media (SEM). </li&gt; </ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La MMA es una técnica laboriosa que requiere experiencia tanto en el cultivo de tejidos y la microscopía. Hay varios pasos críticos para asegurar el éxito: 1) generación de la monocapa de monocitos; 2) la opsonización de los glóbulos rojos, y 3) la cuantificación manual. La monocapa de monocitos no se adhiere muy fuertemente a la diapositiva cámara, por lo que el pH fisiológico debe mantenerse durante todo el ensayo de 11 y un número adecuado de PBMCs se debe sembrar. pipeteo vigoroso, lo que podría molestar a las células adheridas, deben ser evitados. Un enfoque es eliminar siempre y añadir soluciones de la misma esquina de la cámara y para asegurar que el movimiento es lento y constante. Del mismo modo, durante la última etapa de lavado para eliminar el exceso de glóbulos rojos, el movimiento debe ser lenta y constante. Esto asegura una mínima perturbación a la monocapa mientras que todavía la eliminación de la mayoría de los glóbulos rojos de la ONU-fagocitados. lavado inadecuado dará lugar a un alto fondo de los glóbulos rojos contaminantes, lo que hace qua Manualntification difícil. En segundo lugar, los R 2 R 2 RBCs deben ser suficientemente opsonizadas para obtener un índice de fagocitosis promedio de 80 a 120 para el control de la fagocitosis. Esta gama fagocítica deseada establece un equilibrio entre la facilidad de recuento (por ejemplo, los monocitos con más de 5 fagocitados RBCs son difíciles de cuantificar con precisión) y el mantenimiento de una cantidad adecuada de la fagocitosis para el análisis estadístico. El grado de opsonización puede ser confirmada por un IAT, y se necesita una lectura entre 3+ a 4+. El R 2 R 2 RBCs deben desecharse cuando hay exceso de lisis durante el lavado, cuando el sobrenadante se vuelve rojo oscuro, o cuando una disminución significativa en la fagocitosis se observa en los experimentos debido al envejecimiento de las células en almacenamiento. Por último, la cuantificación manual mediante el microscopio puede ser difícil, especialmente cuando se comparan los recuentos entre el personal del laboratorio y entre los experimentos. Examinando el mismo campo en cada pocillo, o simplemente contando más células, Un recuento más consistente se puede obtener. Se recomienda la formación de lado a lado con un técnico con experiencia y el uso de un conjunto designado de diapositivas de formación. Una crítica importante de la MMA es la subjetividad de la etapa de cuantificación manual. Sin embargo, con una formación adecuada, la consistencia se puede obtener a través de diferentes contadores. Otra limitación es la intrínsecas diferencias donante-donante en monocitos y capacidades fagocíticas en R 2 R 2 de superficie los niveles de expresión del antígeno, que es una fuente de variación de los datos cuando se trata de muestras humanas. Otras técnicas alternativas están disponibles para el examen de la fagocitosis mediada por FcyR. La mayoría de los kits comerciales utilizan salida fluorescente para controlar la fagocitosis (por ejemplo, biopartículas, la proteína de fluorescencia sensible al pH, o perlas de látex fluorescentes marcadas con IgG). El uso de la salida fluorescente sí ofrece una cuantificación más objetiva, pero también se necesita para conSider la disponibilidad, el coste, y la formación asociada con el uso de un microscopio de fluorescencia o un citómetro de flujo, así como la dependencia subsiguiente a kits disponibles en el mercado. Por último, este ensayo puede ser modificado dependiendo de la pregunta de investigación. Por ejemplo, cuando se prueba la inhibición de la fagocitosis de drogas, ya sea monocitos pueden ser tratados previamente o co-incubaron tanto con las drogas y los glóbulos rojos opsonizadas (es decir, un ensayo de competición). La señalización aguas abajo de anticuerpos de diferentes subtipos, anticuerpos quiméricos, o construcciones recombinantes también se puede probar. Con los recientes avances en el desarrollo de un análisis de sangre de antígeno nula universal de 24, el MMA se podría utilizar en las pantallas iniciales de estos glóbulos rojos antígeno nula con diversos anticuerpos para evaluar si efectivamente existe una eficacia baja en el desencadenamiento de la fagocitosis.

El ensayo de monocapa de monocitos (MMA) es un ensayo in vitro desarrollado originalmente para predecir mejor los resultados de las transfusiones de sangre en pacientes con autoanticuerpos o aloanticuerpos contra los glóbulos rojos (RBC)1-5. Al evaluar el efecto de los anticuerpos anti-RBC en la mediación de la fagocitosis mediada por el receptor Fcγ (FcγR) mediante este ensayo in vitro, es posible predecir el resultado clínico in vivo. De hecho, el MMA se ha utilizado con éxito para evitar la destrucción inmunitaria de los glóbulos rojos unidos a anticuerpos, a pesar de la transfusión de sangre serológicamente incompatible5. El procedimiento típico previo a la transfusión para las pruebas de compatibilidad, también denominado pruebas cruzadas, implica métodos serológicos que incluyen la tipificación de la sangre del paciente para los antígenos ABO y Rh y la detección de la presencia de anticuerpos anti-RBC en el paciente6. Se selecciona la sangre compatible con ABO/Rh y, si hay anticuerpos, se intenta identificarlos para que la sangre para la transfusión pueda seleccionarse aún más para evitar estos antígenos. Un resultado ideal de prueba cruzada ocurre cuando toda la sangre del donante es serológicamente compatible con la sangre del paciente, lo que reduce el riesgo de hemólisis post-transfusión7. Sin embargo, este sistema se queda corto para el pequeño grupo de pacientes que se han aloinmunizado tras una transfusión repetida o un embarazo. Estos pacientes producen aloanticuerpos contra antígenos específicos de glóbulos rojos. Algunos producen anticuerpos contra antígenos de muy alta frecuencia en la población general y, por lo tanto, se vuelven progresivamente más difíciles de cruzar8,9. Para aumentar la complejidad, no todos los aloanticuerpos son clínicamente significativos; en otras palabras, la unión de un aloanticuerpo a los glóbulos rojos detectados por una prueba serológica no necesariamente resulta en hemólisis cuando se transfunde sangre incompatible con antígeno positivo. El MMA se desarrolló originalmente para evaluar la posible importancia clínica de la sangre serológicamente incompatible en un entornotransfusional 1-5.
Dado que se sabe que la hemólisis extravascular de los glóbulos rojos unidos a anticuerpos está mediada por el sistema de fagocitos mononucleares, se utilizan monocitos/macrófagos primarios en el desarrollo de ensayos de diagnóstico. El primer ensayo para estudiar la interacción de monocitos, glóbulos rojos y anticuerpos se publicó en 1975, pero las condiciones subóptimas utilizadas solo condujeron a la formación de rosetas (la unión de glóbulos rojos a la periferia del monocito), y no se observó fagocitosis10. Varios grupos realizaron modificaciones significativas en el ensayo, lo que condujo a un ensayo en el que el nivel de fagocitosis de los glóbulos rojos unidos a aloanticuerpos pudo correlacionarse con el resultado clínico de la hemólisis1-5. Recientemente, se examinaron las condiciones óptimas de almacenamiento de las muestras clínicas y la optimización adicional de las condiciones de ensayo para mejorar la utilidad de una prueba cruzada clínica de MMA utilizando muestras de pacientes autólogos11.
Se han empleado otras tres técnicas diagnósticas además de la MMA para predecir los resultados de las transfusiones: la prueba de liberación de 51Cr, la prueba de roseta y la prueba de quimioluminiscencia (CLT). En la prueba de liberación de 51Cr, se inyecta al paciente 51glóbulos rojos de donantes marcados con Cr, y se monitoriza la vida media de los glóbulos rojos marcados y es predictiva de la supervivencia o el aclaramiento post-transfusión12,13. Como este método utiliza materiales radiactivos, ya no se realiza muy raramente. La prueba de la roseta consiste en mezclar e incubar monocitos con hematíes y cuantificar el nivel de formación de roseta (sin fagocitosis)14. La importancia clínica de los anticuerpos in vivo implica la fagocitosis activa de los macrófagos que se encuentran en el bazo y/o el hígado; Por lo tanto, este método no proporciona una lectura relevante de la fagocitosis. El CLT utiliza luminol para monitorear el estallido oxidativo durante la fagocitosis de monocitos de los glóbulos rojos, ya que el luminol emite fluorescencia azul cuando se oxida en el fagosoma15. Este método es bueno, pero la contaminación por neutrófilos puede confundir la lectura. Se han realizado comparaciones paralelas para evaluar la sensibilidad, practicidad y reproducibilidad de los cuatro métodos disponibles, y tanto el CLT como el MMA se clasificaron como superiores16. Sin embargo, el CLT se ha utilizado principalmente en la evaluación de la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido (HDFN), y el pH óptimo del ensayo de 8,0 podría comprometer el nivel de fagocitosis11.
Además de su utilidad diagnóstica y clínica, el MMA ha sido modificado para otros fines de investigación. De hecho, el MMA no solo puede servir como un ensayo funcional para abordar las discrepancias entre la serología y la biología, sino que también se ha utilizado para investigar retrospectivamente la causa de la hemólisis después de la terapia con inmunoglobulina intravenosa (IVIG)17. También se ha utilizado para examinar la estructura-función de los inhibidores químicos de la fagocitosis mediada por FcγR18-20 y para estudiar la señalización posterior de la fagocitosis mediada por FcγR21. En nuestro laboratorio, además de utilizar una MMA humana, estamos desarrollando una MMA murina utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) primarias de ratón y glóbulos rojos autólogos. El objetivo es examinar los anticuerpos que pueden inducir fagocitosis mediada por FcγR como intermediario para el desarrollo de un modelo de ratón in vivo de anemia hemolítica autoinmune (AIHA) (datos no publicados). Las diversas modificaciones se centran en diferentes aspectos de la interacción entre el anticuerpo IgG y el FcγR que inducen la fagocitosis.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers de citrato ácido dextrosa (ACD)</td><td>BD REF364606</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Multicell&nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr> <tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de 8 cámaras</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>glóbulos rojos R2R2 (cDE/cDE)</td><td>Servicios</td><td></td> Canadienses <td>de Sangre Disponible comercialmente (p. ej., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Anti-D policlonal a partir de suero humano</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Puede sustituirse por anti-D monoclonal disponible en el mercado o con inmunoglobulina Rh</td></tr><tr><td>Metanol 100%</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Resina</td> <td>de alcohol polivinílicoSigma</td><td>P8136</td><td>Se puede sustituir con la montura disponible en el mercado</td></tr><tr><td>Glicerina ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Cubrecubiertas</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Opcional para IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

el uso de una monocapa de monocitos ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor fc gamma

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Aunque originalmente se desarrolló para predecir los resultados de las transfusiones de sangre serológicamente incompatible, el ensayo de monocapa de monocitos (MMA) es un ensayo in vitro muy versátil que puede modificarse para examinar diferentes aspectos de la fagocitosis mediada por anticuerpos y receptores Fcγ (FcγR) tanto en investigación como en entornos clínicos. El ensayo utiliza monocitos adherentes de células mononucleares de sangre periférica aisladas de sangre total de mamíferos. El MMA ha sido descrito para su uso tanto en investigaciones humanas como murinas. Estos monocitos expresan FcγRs (por ejemplo, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB y FcγRIIIA) que están implicadas en las respuestas inmunitarias. El MMA explota el mecanismo de las interacciones mediadas por FcγR, en particular la fagocitosis, en la que los glóbulos rojos (RBC) sensibilizados por anticuerpos se adhieren y/o activan los FcγR y posteriormente son fagocitados por los monocitos. In vivo, principalmente los macrófagos tisulares que se encuentran en el bazo y el hígado llevan a cabo la fagocitosis mediada por FcγR de los glóbulos rojos opsonizados con anticuerpos, causando hemólisis extravascular. Mediante la evaluación del nivel de fagocitosis utilizando el MMA, se pueden investigar diferentes aspectos del proceso in vivo mediado por FcγR. Algunas aplicaciones de la MMA incluyen la predicción de la relevancia clínica de los aloanticuerpos o autoanticuerpos en un entorno de transfusión, la evaluación de fármacos candidatos que promueven o inhiben la fagocitosis y la combinación del ensayo con la microscopía fluorescente o la inmunotransferencia occidental tradicional para investigar los efectos de señalización posteriores de los fármacos o anticuerpos que se acoplan al FcγR. Algunas limitaciones incluyen lo laborioso de esta técnica, que toma un día completo de principio a fin, y el requisito de aprobación de ética de investigación para trabajar con sangre de mamíferos. Sin embargo, con diligencia y capacitación adecuada, los resultados de MMA se pueden obtener en un tiempo de rotación de 24 horas.

Siguiendo los pasos cruciales en la figura 1 y el procedimiento descrito anteriormente, el MMA se puede realizar de forma reproducible. IVIG fue usado como un ejemplo para la inhibición de la fagocitosis en la Figura 2. IVIG se sabe que se unen y bloquear los receptores Fc, inhibiendo así el resultado corriente abajo de la fagocitosis. Por titulación de la cantidad de IVIG utilizada, se observa una inhibición dependiente de la dosis, en la que las concentraciones por encima de 200 mg / ml dio lugar a cerca de 100% de inhibición y concentraciones por debajo de 0,5 g / ml no inhibió en absoluto (Figura 2A). Cuando los índices fagocíticas se transforman y se normalizaron con el control positivo R 2 R 2 como 0% de inhibición, una curva de inhibición con una CI 50 de 3 mg / ml se puede determinar (Figura 2B). Además de realizar el ensayo de manera consistente, quantificación del ensayo a veces puede ser difícil. La Figura 3 es una colección de imágenes de microscopía de contraste de fase de varios toboganes de MMA. Con la experiencia microscopía, se puede distinguir un monocito de un RBC contaminante (Figura 3D), o una vacuola de un RBC fagocitado (Figura 3B). Densos racimos de células y / o escombros deben evitarse durante la cuantificación (Figuras 3E y F). También, uno debe evitar el exceso de opsonizantes el R 2 R 2 RBC, lo que llevaría a la fagocitosis mayor que overcrowds el interior de monocitos e interfiere con la cuantificación exacta (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático de la MMA. Una pintura paso a paso de los pasos cruciales en la MMA: el aislamiento de PBMC de sangre completa, la alimentación de la monocyt adheridoí con opsonizado R2 R2, y el lavado de los portaobjetos de cámara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figura 2. intravenosa IgG (IVIG) inhibe la fagocitosis in vitro utilizando el MMA. IVIG es conocida para inhibir la fagocitosis y se utiliza como un control de inhibición en el MMA humano. (A) La titulación de IVIG resultó en una inhibición dependiente de la dosis de la fagocitosis en comparación con los no tratados R 2 R 2 de control. Los resultados muestran la media ± el error estándar de la media (SEM) de n = 3 experimentos. El análisis estadístico se realizó mediante la t de Student-test: ** *** p≤0.01 y p≤0.001. (B) La inhibición de la curva de IVIG con una CI 50 of 3 mg / ml (línea de puntos). Los resultados muestran los datos normalizados a no tratada R 2 R (0% de inhibición) 2; media ± SEM de n = 3 experimentos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes de microscopía de contraste de fase de diapositivas de muestra con una lupa de 40X. (A) El tobogán perfecto en el que los monocitos fagocitados 1-2 R2 R2 en promedio (flechas negras con un brillo distintivo de halo), con muy pocos contaminantes, no-fagocitado R2 R2 en el fondo (flechas blancas). Vacuolas (B) Como se muestra en esta diapositiva, monocitos veces han agrandado (flechas blancas), que puede ser confundido con fagocitado R2 R2. (C &lt;/ strong&gt;) Cuando R2 R2 han sido sobre-opsonizado, más de 4-5 fagocitado R 2 R 2 por monocitos (flechas negras) rinde precisa contar difícil, ya que el R2 R2 se llena dentro de los monocitos y células distinta límites no se pueden distinguir. (D) el lavado inadecuado de la corredera conduce a la abundante R2 R2 contaminación (flechas blancas), que podría confundirse con los glóbulos rojos adheridos. (E) A veces, los monocitos y los glóbulos rojos contaminantes pueden formar racimos. Clusters también indican la contaminación bacteriana, que debe ser evitado. (F) Los monocitos pueden formar agregados más grandes, que deben ser evitados durante la cuantificación. El uso de la selección al azar de los campos para ver, el panel A es lo que se observa por lo general si el MMA se ha realizado correctamente. La barra de escala es de 20 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí</a>para ver una versión más grande de esta figura.

El ensayo de monocapa de monocitos (MMA) es un ensayo in vitro que utiliza monocitos primarios aislados obtenidos de sangre periférica entera de mamíferos para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fcγ (FcγR).

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

El objetivo general de este ensayo funcional in vitro es evaluar varios aspectos de la fagocitosis mediada por FC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunohematología y la medicina de transfusión sanguínea, como cuál es la importancia clínica de los autoanticuerpos y aloanticuerpos contra los glóbulos rojos. Esta técnica proporciona un ensayo biológico funcional que se puede realizar in vitro para predecir el resultado de la transfusión en aquellos pacientes con anticuerpos preformados contra los glóbulos rojos.La demostración del procedimiento estará a cargo de Cindy Tong, una estudiante graduada de mi laboratorio. Ahora bien, no olvide que trabajar con sangre humana puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de batas protectoras y guantes al realizar este procedimiento. Después de obtener una o dos muestras de sangre total de 10 mililitros de un donante sano en tubos vacutainer que contienen citrato ácido dextrosa por venopunción, los tubos se colocan en una cabina de bioseguridad de clase II y la sangre se diluye en una proporción de uno a uno en medio completo tibio.A continuación, pipetee lentamente las células sanguíneas por los lados de un tubo de centrífuga en el gradiente de densidad a temperatura ambiente, teniendo cuidado de no mezclar las capas. Separar las células por centrifugación. A continuación, deseche la capa superior de plasma y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir la capa de leucemio que contiene PBMC a un nuevo tubo de 15 mililitros.Lave las PBMC aisladas tres veces en PBS, resuspendiendo las células en tres a siete mililitros de medio después de la tercera centrifugación. Después de contar, diluya las células a 1,75 veces 10 a la sexta concentración de células por mililitro en medio completo y siembre 400 microlitros de células en cada pocillo de un portaobjetos de ocho cámaras para una incubación de una hora a 37 grados Celsius y 5% de CO2 con humedad completa. Para opsonizar los glóbulos rojos R2R2, primero lave los glóbulos rojos tres veces en PBS.Diluir el pellet de R2R2 después de la tercera centrifugación en una proporción de uno a uno con anticuerpos policlonales anti-D de suero humano para una incubación de una hora a 37 grados Celsius con mezcla intermitente. Al final de la opsonización, retire las células de la incubadora y luego lávelas tres veces más en PBS como se acaba de demostrar. Vuelva a suspender el pellet a un 1,25% de volumen a volumen en medio RPMI completo.A continuación, reemplace el sobrenadante de cada pocillo del portaobjetos de ocho cámaras con 400 microlitros de las celdas R2R2 opsonizadas durante dos horas a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, utilice los adaptadores de portaobjetos para retirar las cámaras, frotando el exceso de R2R2 con una toalla de papel. Ahora, llene un vaso de precipitados de 100 mililitros con PBS y sumerja lentamente cada portaobjetos de 30 a 40 veces en la solución salina para eliminar la mayor parte del R2R2 no fagocitado.Después del secado, fije los portaobjetos en metanol al 100% durante 45 segundos y deje que las células se sequen antes de montar las muestras con cubreobjetos. Al día siguiente, cargue cada portaobjetos en un microscopio de contraste de fase con una lente objetivo de 40X y cuente manualmente al menos 200 monocitos y el número de R2R2 fagocitados dentro de cada monocito utilizando un contador en cada mano para cuantificar simultáneamente el número de monocitos y el número de células R2R2 fagocitadas por muestra. La inmunoglobulina intravenosa se une y bloquea los receptores FC, inhibiendo la fagocitosis de forma dependiente de la dosis, con una inhibición de casi el 100% observada a partir de concentraciones de 200 microgramos de la inmunoglobulina intravenosa por mililitro y casi sin inhibición observada a concentraciones inferiores a 0,5 microgramos del inhibidor.Cuando los índices fagocíticos se normalizan al control positivo R2R2 como 0% de inhibición, se puede determinar una curva de inhibición con un IC 50 de tres microgramos por mililitro. Con la experiencia, la microscopía de contraste de fase se puede utilizar para distinguir los monocitos de los glóbulos rojos contaminantes y las vacuolas de los glóbulos rojos fagocitados. Deben evitarse los grupos de células densas y los residuos durante la cuantificación, así como la opsonización excesiva de los glóbulos rojos R2R2, lo que puede provocar una fagocitosis elevada que abarrota el interior de los monocitos e interfiere con un análisis fagocítico preciso.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis u ocho horas si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunocitoquímica o la inmunofluorescencia mediante microscopía confocal para responder preguntas adicionales sobre la expresión de proteínas fagocíticas, las interacciones de los glóbulos rojos y la compartimentación. Con su desarrollo inicial y posterior optimización, esta técnica informará la forma en que los investigadores en los campos de la medicina transfusional y la biología celular exploran los sistemas de opsonización.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de monocapa de monocitos para evaluar los tipos de interacción de anticuerpos que provocan la fagocitosis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se presenta un análisis de flujo de alto rendimiento por citometría de determinar la actividad fagocítica de los antígenos específicos de los anticuerpos de muestras clínicas, la utilización de fluorescentes recubiertas de antígeno cuentas y una línea celular de monocitos que expresan múltiples receptores Fc-proporciona el uso de los receptores y las determinaciones de la actividad fagocítica en un estándar y forma reproducible por cualquier antígeno de interés.

La determinación de la actividad fagocítica de los anticuerpos de muestras clínicas

Fuente: Nagre, N., et al. Fagocitosis de macrófagos alveolar y eliminación bacteriana en ratones. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra la evaluación de la fagocitosis mediada por receptores del complemento utilizando glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgM y complemento, seguida de su captación por macrófagos de ratón. El grado de fagocitosis se cuantifica midiendo un producto cromogénico azul formado por la oxidación catalizada por hemoglobina del diaminofluoreno.

Modelado de la fagocitosis mediada por complemento utilizando glóbulos rojos opsonizados in vitro

Este video muestra un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo que involucra eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum marcados y opsonizados por monocitos. La citometría de flujo identifica la fluorescencia en los monocitos, lo que confirma la identificación exitosa de eritrocitos opsonizados a través de la fagocitosis.

Un ensayo para cuantificar la fagocitosis mediada por anticuerpos de eritrocitos infectados por parásitos

Este video muestra un ensayo de monocapa de monocitos que utiliza monocitos primarios de sangre periférica para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fcγ con glóbulos rojos R2R2 opsonizados con anticuerpos poli D.

Un ensayo para el estudio de la fagocitosis impulsada por el receptor Fcγ en monocapas de monocitos

Este video muestra un ensayo in vitro para explorar la influencia inmunomoduladora de las células madre mesenquimales (MSC) en la proliferación de células T efectoras. El ensayo incluye el cocultivo de MSC con PBMC para inducir a la población de monocitos a adquirir un fenotipo inmunomodulador, lo que conduce a la secreción de interleucina-10 (IL-10). Después de la incubación con linfocitos T CD4+ activados, los monocitos inducidos suprimen eficazmente la proliferación de linfocitos T.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto inmunomodulador de los monocitos en la proliferación de leucocitos

Este video muestra un ensayo para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) por fagocitos de la leche materna. Las microesferas marcadas con fluorescencia conjugadas en un complejo antígeno-anticuerpo se combinan con una suspensión celular aislada de la leche materna para inducir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por los leucocitos fagocíticos. Al marcar las células con anticuerpos contra el antígeno leucocitario común (CD45), se utiliza la citometría de...

Un ensayo in vitro para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por fagocitos

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

El propósito de este manuscrito es presentar un método para medir la fagocitosis de monocitos y granulocitos y la actividad de estallido oxidativo en muestras de sangre humana.

La medición de granulocitos y de monocitos fagocitosis y la actividad de la explosión oxidativa en la sangre humana

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Hemos desarrollado mejoras y actualizado métodos para el ensayo monocito-monocapa (MMA) existente, en el que se utilizan macrófagos para ayudar a predecir mejor la relevancia clínica de los aloanticuerpos de glóbulos rojos en medicina transfusional e inmunología. Este ensayo se denomina ensayo de monocitos-macrófagos (M-MA).

Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Aprende el ensayo de monocapa de monocitos para evaluar la fagocitosis mediada por receptores Fc gamma usando células de sangre humana. Este método permite predecir resultados de transfusiones en pacientes con anticuerpos preformados.

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

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