El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

El objetivo general de este ensayo funcional in vitro es evaluar varios aspectos de la fagocitosis mediada por FC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunohematología y la medicina de transfusión sanguínea, como cuál es la importancia clínica de los autoanticuerpos y aloanticuerpos contra los glóbulos rojos. Esta técnica proporciona un ensayo biológico funcional que se puede realizar in vitro para predecir el resultado de la transfusión en aquellos pacientes con anticuerpos preformados contra los glóbulos rojos.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Cindy Tong, una estudiante graduada de mi laboratorio. Ahora bien, no olvide que trabajar con sangre humana puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de batas protectoras y guantes al realizar este procedimiento. Después de obtener una o dos muestras de sangre total de 10 mililitros de un donante sano en tubos vacutainer que contienen citrato ácido dextrosa por venopunción, los tubos se colocan en una cabina de bioseguridad de clase II y la sangre se diluye en una proporción de uno a uno en medio completo tibio.

A continuación, pipetee lentamente las células sanguíneas por los lados de un tubo de centrífuga en el gradiente de densidad a temperatura ambiente, teniendo cuidado de no mezclar las capas. Separar las células por centrifugación. A continuación, deseche la capa superior de plasma y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir la capa de leucemio que contiene PBMC a un nuevo tubo de 15 mililitros.

Lave las PBMC aisladas tres veces en PBS, resuspendiendo las células en tres a siete mililitros de medio después de la tercera centrifugación. Después de contar, diluya las células a 1,75 veces 10 a la sexta concentración de células por mililitro en medio completo y siembre 400 microlitros de células en cada pocillo de un portaobjetos de ocho cámaras para una incubación de una hora a 37 grados Celsius y 5% de CO2 con humedad completa. Para opsonizar los glóbulos rojos R2R2, primero lave los glóbulos rojos tres veces en PBS.

Diluir el pellet de R2R2 después de la tercera centrifugación en una proporción de uno a uno con anticuerpos policlonales anti-D de suero humano para una incubación de una hora a 37 grados Celsius con mezcla intermitente. Al final de la opsonización, retire las células de la incubadora y luego lávelas tres veces más en PBS como se acaba de demostrar. Vuelva a suspender el pellet a un 1,25% de volumen a volumen en medio RPMI completo.

A continuación, reemplace el sobrenadante de cada pocillo del portaobjetos de ocho cámaras con 400 microlitros de las celdas R2R2 opsonizadas durante dos horas a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, utilice los adaptadores de portaobjetos para retirar las cámaras, frotando el exceso de R2R2 con una toalla de papel. Ahora, llene un vaso de precipitados de 100 mililitros con PBS y sumerja lentamente cada portaobjetos de 30 a 40 veces en la solución salina para eliminar la mayor parte del R2R2 no fagocitado.

Después del secado, fije los portaobjetos en metanol al 100% durante 45 segundos y deje que las células se sequen antes de montar las muestras con cubreobjetos. Al día siguiente, cargue cada portaobjetos en un microscopio de contraste de fase con una lente objetivo de 40X y cuente manualmente al menos 200 monocitos y el número de R2R2 fagocitados dentro de cada monocito utilizando un contador en cada mano para cuantificar simultáneamente el número de monocitos y el número de células R2R2 fagocitadas por muestra. La inmunoglobulina intravenosa se une y bloquea los receptores FC, inhibiendo la fagocitosis de forma dependiente de la dosis, con una inhibición de casi el 100% observada a partir de concentraciones de 200 microgramos de la inmunoglobulina intravenosa por mililitro y casi sin inhibición observada a concentraciones inferiores a 0,5 microgramos del inhibidor.

Cuando los índices fagocíticos se normalizan al control positivo R2R2 como 0% de inhibición, se puede determinar una curva de inhibición con un IC 50 de tres microgramos por mililitro. Con la experiencia, la microscopía de contraste de fase se puede utilizar para distinguir los monocitos de los glóbulos rojos contaminantes y las vacuolas de los glóbulos rojos fagocitados. Deben evitarse los grupos de células densas y los residuos durante la cuantificación, así como la opsonización excesiva de los glóbulos rojos R2R2, lo que puede provocar una fagocitosis elevada que abarrota el interior de los monocitos e interfiere con un análisis fagocítico preciso.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis u ocho horas si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunocitoquímica o la inmunofluorescencia mediante microscopía confocal para responder preguntas adicionales sobre la expresión de proteínas fagocíticas, las interacciones de los glóbulos rojos y la compartimentación. Con su desarrollo inicial y posterior optimización, esta técnica informará la forma en que los investigadores en los campos de la medicina transfusional y la biología celular exploran los sistemas de opsonización.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de monocapa de monocitos para evaluar los tipos de interacción de anticuerpos que provocan la fagocitosis.