Name: Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a evaluar condiciones de tratamiento que afectan la invasión perineural en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello utilizando ganglios de raíz dorsal de ratón. Este método permite realizar múltiples ensayos reproducibles en poco tiempo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado en su totalidad por los NIH a través de la subvención R21, "Mecanismos de invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello" y la beca de capacitación T32 del NCI, "Capacitación en investigación postdoctoral en oncología de cabeza y cuello (2T32CA060397-21)." Gracias a Richard Steiman, MD, PhD y al personal del laboratorio.

1. Preparación del medio de cultivo y platos (10 min) <ol><li> Añadir 100 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en V. </li><li> Retirar un pre-alícuotas-vial de aproximadamente 100 l de matriz semisólida del congelador 20 ° C y colocarlo directamente en hielo. NOTA: Para ello, antes de la ganglio de la raíz dorsal de la cosecha (DRG) porque la matriz semisólida tarda aproximadamente 30 min para alcanzar el estado líquido en el hielo, que es necesaria para las etapas ulteriores. Si no se mantiene la matriz semisólida en hielo en todo momento, el resultado es la matriz de gotitas de mala calidad. </li><li> culturas placas con tinta indeleble etiqueta de fondo de vidrio, la creación de identificadores únicos en cada una de las cuatro esquinas de la parte inferior de la placa. Colocar las placas del lado derecho hacia arriba en hielo para enfriar la superficie de la placa. NOTA: los rendimientos de cada ratón 32 - 40 DRG, por lo etiquetarlos de 1 a 40. No es necesario pre-enfriamiento del pimascotas consejos, como consejos refrigerados se calentará durante el transcurso de la colocación de las gotitas de la matriz, lo que podría introducir diferencias en la consistencia de la matriz. </li></ol> 2. Disección de murino DRG (45 min) <ol><li> La eutanasia a un ratón nude atímicos como por protocolos de laboratorio específicas, tales como mediante el uso de una cámara de CO 2 y una toracotomía. </li><li> Configurar el área de la disección y el microscopio. Utilice la parte inferior limpia, se esteriliza, y plano de contenedores de poliestireno de 15 ó tubos cónicos de 50 ml. NOTA: Además, son adecuados para uso como la superficie de disección, ya que son de bajo costo, desechables, y permitir la fijación de la columna vertebral utilizando agujas o alfileres. Sólo utilice los instrumentos y agujas esterilizadas. </li><li> Bajo la visión natural, hacer una incisión longitudinal a lo largo de la columna vertebral de la raíz de la cola a la cabeza del ratón con un par de tijeras finas rectas o curvas. </li><li> Use las mismas tijeras para dividir transversalmente por debajo de la sacral columna vertebral. Diseccionar ambos lados de la columna vertebral de todo el camino hasta la base del cráneo con las tijeras. En este punto, asegúrese de que la columna vertebral cervical se secciona cranealmente medida de lo posible con unas tijeras. </li><li> Observe el extremo cervical de la columna vertebral en el microscopio de operación a baja potencia. La médula espinal blanco es evidente en el medio de un anillo óseo, que está rodeado por cantidades variables de los músculos paraespinales y tejido blando. </li><li> Dividir el dorsal o aspecto superior de los primeros 2 - 3 cuerpos vertebrales con tijeras de primavera microscópicas. El uso de la acción de resorte de las tijeras, abrir este ósea inicial cortado para asegurar que la disección del cuerpo vertebral se produjo en la línea media. Continuar en pequeños incrementos hacia la columna vertebral sacro, y luego dividir en dos la columna vertebral, completando los cortes idénticos en el aspecto ventral o inferior de los cuerpos vertebrales. NOTA: Si no se garantiza la disección de la línea media de la columna vertebral ósea dará lugar a un rendimiento inferior DRG. </li><li> en Thipunto s, la columna vertebral se divide en dos mitades. Coloque una hemi-columna vertebral a un lado, con la médula espinal en su lugar y hacia abajo en una placa estéril. NOTA: Al salir de la médula espinal en su lugar evitará que los GRD se sequen, ya que los GRD son profundos a la médula espinal. </li><li> Asegure cada extremo de la otra hemi-espina dorsal con dos agujas de calibre 18 en la plataforma de poliestireno de disección. Comenzando en el extremo cervical (que es evidente porque la espina dorsal es más estrecha, el DRG están más cerca el uno al otro, y hay inserciones RIB), suavemente remueva la médula espinal de alrededor de 4 niveles vertebrales. </li><li> Observar los nervios sensoriales (generalmente dos) que conectan la DRG. En el área donde los nervios se insertan a la DRG, agarre suavemente la fascia circundantes con unas pinzas microscópicas. Diseccionar y recortar esta fascia y otros tejidos nerviosos con las tijeras de primavera microscópicas para liberar el GRD. la retracción suave traerá el DRG fuera de su posición dentro de la columna ósea. NOTA: El aumento de lapoder microscopio en este paso es beneficioso. Lesión por aplastamiento a la DRG limitará de forma significativa el crecimiento de neuritas. Esto se evita que nunca agarrando el DRG directamente, sino más bien agarrando la fascia de los alrededores. </li><li> Cortar el nervio periférico (DRG generalmente tiene un nervio periférico, que es profunda relación a la vista de disección) con las tijeras de primavera microscópicas para liberar el DRG. NOTA: Es más fácil de determinar, donde los extremos de los nervios y los GRD se inicia mientras está en tensión, por lo que hacer este corte lo más cerca posible a la GRD en este momento es ideal. Una vez que se corta esta rama distal, las ramas proximales se recortan también. </li><li> Recorte el DRG de las fibras nerviosas callejeros o uniones fasciales con las tijeras de primavera microscópicas. Después de un aislamiento adecuado, coloque el DRG en el medio a temperatura ambiente dentro de la placa de 96 pocillos de fondo en V. NOTA: La colocación de un fondo oscuro debajo de la placa hace que la visualización de la sub-mm GRD blanco más fácil. Instale solamente un GRD en el EACh así; de esta manera, que puede explicarse más fácilmente en las etapas subsiguientes. </li><li> Repita este proceso hasta el fondo de un hemi-espina dorsal y después el otro. Cada lado se obtiene 16 - 20 GRD, un total de 32 - 40. NOTA: Si hay menos GRD que esto, la disección de la columna vertebral debe ser llevado a cabo más cefálica y / o en sentido caudal. Los GRD se vuelven cada vez menos bien definida como se procede en sentido caudal. </li></ol> 3. Preparación de la matriz semiduros Las gotitas (&lt;1 min por placa) <ol><li> Retire una placa de vidrio pocillos de fondo de hielo y colocarlo en un bloque de hielo debajo del microscopio quirúrgico. Asegúrese de que la parte alícuota de la matriz se mantiene en hielo en todo momento. </li><li> Coloque una gota de 1,5 l de matriz en cada una de las cuatro esquinas de la placa con fondo de vidrio con un 2-l o micropipeta de 10 l, dejando una distancia al menos tan grande como la propia gota desde el borde de la copa también. <ol><li> Coloque la punta de la pipeta directamente sobreel vidrio en un ángulo de 45 grados. pipeta lentamente la matriz. Poco a poco alejarse de la parte inferior de vidrio después de la matriz se dedica en la placa. NOTA: La tensión superficial entre la matriz y el vidrio debe crear un hemisferio perfecto cada vez. </li><li> Deja de pipeteado justo antes de la punta está vacío, porque inyección inadvertida de aire en la gotita matriz hace que el diámetro de la gotita de matriz mucho mayor y es difícil de eliminar. NOTA: El uso de una segunda mano para estabilizar la mano de pipeteado facilita la colocación más precisa. </li></ol></li></ol> 4. La inserción de DRG en semiduros Matrix Las gotitas (&lt;2 min por placa) <ol><li> Deje el plato con las gotitas de matriz brevemente a temperatura ambiente (~ 1 min). Esto endurece ligeramente la matriz, por lo que es más fácil para la colocación precisa de la DRG. </li><li> Cucharada (no la sujete) el DRG suavemente con fórceps microscópicas cerradas en la mano izquierda. Una vez más, un fondo oscuro contra el pequeño, blancoDRG facilita la visualización. La transferencia de la DRG a la punta de una aguja de calibre 21 en la mano derecha. Esta transferencia dejará medios residual sobre los fórceps. </li><li> Introduzca suavemente el DRG en el medio de la gotita de matriz, usando la aguja de calibre 21 (Figura 1). La mayor parte del tiempo, el DRG se suelte fácilmente en la matriz y luego se puede colocar en el centro con la aguja. <ol><li> Si el DRG se pega a la aguja, utilice el fórceps microscópicas para empujar el DRG fuera de la aguja y en la gota de matriz. Wick el exceso de medios de las pinzas microscópicos con un paño de laboratorio. NOTA: La introducción de medios de comunicación a la matriz alterará el diámetro, el volumen y la consistencia del ensayo. Un bloque de hielo con el color o la escritura de color proporciona un contraste de fondo, lo que facilita la visualización de este delicado proceso. </li></ol></li><li> Después de que la placa tiene las cuatro GRD, lleve a cabo una inspección final para asegurar que el DRG está en el centro de la gotita de matriz. Hacer ajustessegún sea necesario con la aguja 21 de calibre. </li><li> Colocar la placa completada a una incubadora a 37ºC. Esto se solidificará la matriz semisólida y fijar la DRG en su posición. </li><li> Repita este procedimiento para todos los GRD. Coloque gotitas de matriz en blanco sin una DRG como el control negativo. </li><li> Añadir 4 ml de DMEM con 10% FBS a cada placa con fondo de vidrio después de completar todas las placas y exponiéndolos a la incubadora a 37ºC durante al menos 3 min. Colocar la placa en un ligero ángulo y se añade lentamente el medio, de manera que se trata poco a poco en contacto con las unidades de matriz-DRG. NOTA: Si se añade el medio demasiado rápido o con vigor, la matriz y / o DRG puede desalojarse. </li><li> Almacenar los ensayos en la incubadora a 37ºC durante las siguientes 48 - 72 h. NOTA: el examen periódico de los ensayos mostrará excrecencia circunferencial de neuritas hacia el borde de la matriz (Figura 2). Cuando las neuritas son mayores que las tres cuartas partes de la forma de la matriz, sees adecuado para la placa de las células. </li></ol> 5. Preparación de la Cabeza y Cuello células de cáncer NOTA: Las líneas celulares distintas de la cabeza y las células de carcinoma de células escamosas de cuello se pueden utilizar en este diseño experimental. <ol><li> Mantener las líneas celulares de carcinoma de células escamosas en DMEM con 10% de FBS en matraces o placas de cultivo preferidos en una incubadora a 37ºC. Para preparar células para la experimentación, la succión de todo el medio del matraz de cultivo o un plato y se lava dos veces con PBS. Suspender las células mediante la adición de una cantidad apropiada de 0,025% de tripsina durante 5 min, seguido de DMEM con 10% de FBS. Pipetear 4 ml de la mezcla de células y medios de comunicación en placas de cultivo de 6 ml. NOTA: Una placa de cultivo de 6 ml proporciona más que suficientes células, incluso cuando menos de 50% de confluencia. </li><li> Exponer las líneas celulares HNSCC a diferentes condiciones de 24 h antes de la tinción y placas en el ensayo DRG. Re-dosificar la condición una vez que las células se colocan para mantener un environme consistenteNuevo Testamento. NOTA: Añadir anticuerpos, factores de crecimiento, citoquinas, u otras moléculas a las placas de cultivo celular de 1 - 2 días después de la disección del ratón y la implantación del DRG en la matriz. </li><li> Añadir manchas de células fluorescentes 1 h antes en placas de las células (2 - 3 días después de la cosecha DRG y la implantación en la matriz). NOTA: Las manchas particulares usados ​​aquí pasar libremente a través de la membrana celular; sin embargo, después de reaccionar con los grupos tiol intracelulares, la mancha permanece dentro de la célula y se transmite a las células hijas. La tinción facilita en gran medida la visualización dentro de los ensayos. Estas manchas temporales son ideales para estos ensayos ya que la fluorescencia está presente durante 2 - 3 días, que es el período de tiempo de estos experimentos. También permite el uso de muchos colores diferentes y evita la necesidad de la creación de líneas celulares de proteína transfectadas fluorescentes. <ol><li> Preparar 10 M de solución de colorante mediante la mezcla de 2 l de 10 mM manchas de células de valores en 2 ml de DMEM libre de sueropara cada condición de la celda. Calentar este a 37 ° C antes de añadir a las células. </li><li> Retire el medio de cultivo dentro de la placa de 6 ml, dejando las células adherentes CECC en el plato. Añadir 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y retire 2 ml de DMEM 10 M tinción celular / sin suero añadieron a cada placa </li><li> Devolver la placa de cultivo de 6 ml con la mancha de células a la 37 ° C incubadora durante 40 min. </li><li> Después de 40 minutos, aspirar el medio. Añadir 2 ml de PBS y luego aspirar él. Añadir 1 ml de tripsina al 0,025% a cada placa y volver a colocarlas en la incubadora a 37ºC. </li><li> Añadir 2 ml de DMEM con 10% FBS después de 3-5 min y transferir las células suspendidas a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células y les volvió a suspender en 1 ml de DMEM con 10% de SFB. </li><li> Contar las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado, y luego añadir DMEM con 10% de FBS para crear una concentración final de células de 300.000 células por ml. </li></ol></li></ol> 6. Revestimiento del Jefe y NLas células del cáncer Eck <ol><li> Retire las placas con fondo de cristal con los ensayos de matriz-DRG de la incubadora. NOTA: Una vez más, que son pertinentes cuando neuritas son al menos 75% del camino hacia el borde de la matriz, que se produce generalmente después de 2 - 3 días. Esto se ve mejor utilizando al menos un objetivo de 10X. </li><li> Aspirar el medio dentro de la placa con fondo de vidrio. Completamente aspirar el medio dentro del vidrio bien sin la eliminación de las unidades de matriz-DRG. </li><li> Elaborar 200 l de las 300.000 células / ml de medio utilizando una pipeta de 200 l. Colocar dos gotas de las células sobre cada ensayo de matriz-DRG. Realice este paso para cada gotita matriz, creando cuatro repeticiones de cada condición de células en un plato. NOTA: La forma hemisférica de la matriz permite que las células se asientan en un anillo a lo largo de la periferia del ensayo (Figura 3a, Figura 3b). Encontrar una pipeta con un gatillo suave hace que la colocación de uniforme cae muy fácil. </li><li> Confirmar el número de células similares y distribution de las diversas condiciones de las celdas bajo microscopía de 4X. </li><li> Colocar las placas con fondo de vidrio en la incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 60 minutos. NOTA: A pesar de que sólo hay un pequeño volumen de las células y los medios de comunicación (~ 150 ml), los ensayos no se sequen hasta que hayan transcurrido varias horas de tiempo incubadora. </li><li> Después de 60 min, añadir con cuidado 4 ml de DMEM con 10% FBS a lo largo de la pared lateral de la placa de fondo de vidrio. NOTA: Durante un período de tiempo, las células se adhieren parcialmente a la placa inferior, y el método de añadir el medio no perturbar las células. Diferentes tipos de células pueden tardar más o menos tiempo para comenzar a adherirse a la placa con fondo de vidrio. </li><li> Reemplazar cualquier droga exógenos o factores de crecimiento en este momento para mantener los niveles de concentración anteriores. </li><li> Devolver los ensayos para la incubadora a 37ºC, excepto cuando se examinan al microscopio. Cuantificar los resultados de este ensayo de imágenes microscópicas. En pocas palabras, contar las hebras de la invasión perineural conen cuatro cuadrantes utilizando una imagen microscópica 4X. NOTA: un microscopio con una 4X capacidades objetivas y de fluorescencia es adecuada para la foto-documentación de los ensayos. El tamaño de los ensayos se adapta muy bien dentro del campo de un objetivo 4X, que se detalla lo suficiente para capturar las áreas individuales de la invasión perineural. La invasión perineural se hace evidente dentro de las 24 h, pero más allá de 48 h, la integridad de los ensayos comienza a debilitarse, ya que las células tumorales se dividen a lo largo de la periferia de la matriz e invaden. Más allá de 48 h, hay también flujo de salida sustancial de los fibroblastos de la DRG, que oscurece la visualización mediante microscopía de campo claro. Por lo tanto, es aconsejable foto-documento los resultados con microscopia 4X al menos dos veces durante esta ventana (por ejemplo, a las 24 y 48 h después de la siembra las células tumorales). Tener en cuenta que estos son ensayos de 3 dimensiones, y es difícil por completo la imagen de todo el ensayo. La mayoría invasión perineural se produce en un plano de la parte inferior de la placa, donde tque células están incrustadas en la matriz ligeramente por encima de la parte inferior de la placa. Debido a que este plano es cerca de la horizontal, la gran mayoría de las neuritas con las células tumorales se capturan una imagen de un solo nivel en 4X en. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2006%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2006.</a> CA Cancer J Clin. 56 (2), 106-130 (2006).</li>
<li>Hinerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+35-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity: 35-year experience.</a> Head Neck. 26 (11), 984-994 (2004).</li>
<li>Rahima, B., Shingaki, S., Nagata, M., Saito, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+perineural+invasion+in+oral+and+oropharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol+Oral+Radiol+Endod%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of perineural invasion in oral and oropharyngeal carcinoma.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 97 (4), 423-431 (2004).</li>
<li>Woolgar, J. A., Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+cervical+lymph+node+metastasis+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+tongue%2Ffloor+of+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Prediction of cervical lymph node metastasis in squamous cell carcinoma of the tongue/floor of mouth.</a> Head Neck. 17 (6), 463-472 (1995).</li>
<li>Tai, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+for+T1-2+oral+squamous+cell+carcinoma+with+or+without+perineural+invasion%3A+neck+dissection+and+postoperative+adjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Treatment for T1-2 oral squamous cell carcinoma with or without perineural invasion: neck dissection and postoperative adjuvant therapy.</a> Ann Surg Oncol. 19 (6), 1995-2002 (2012).</li>
<li>George, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+sinusitis+in+patients+in+the+medical+intensive+care+unit%3A+a+prospective+epidemiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial sinusitis in patients in the medical intensive care unit: a prospective epidemiological study.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 463-470 (1998).</li>
<li>Fagan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perineural+invasion+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Perineural invasion in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124 (6), 637-640 (1998).</li>
<li>Soo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+implications+of+perineural+spread+in+squamous+carcinomas+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Prognostic implications of perineural spread in squamous carcinomas of the head and neck.</a> Laryngoscope. 96 (10), 1145-1148 (1986).</li>
<li>Parsons, J. T., Mendenhall, W. M., Stringer, S. P., Cassisi, N. J., Million, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+factors+influencing+the+outcome+of+postoperative+irradiation+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">An analysis of factors influencing the outcome of postoperative irradiation for squamous cell carcinoma of the oral cavity.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 39 (1), 137-148 (1997).</li>
<li>Liao, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+adjuvant+radiation+therapy+improve+outcomes+in+pT1-3N0+oral+cavity+cancer+with+tumor-free+margins+and+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Does adjuvant radiation therapy improve outcomes in pT1-3N0 oral cavity cancer with tumor-free margins and perineural invasion.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 71 (2), 371-376 (2008).</li>
<li>Fan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+results+of+postoperative+radiotherapy+on+squamous+cell+carcinoma+of+the+oral+cavity%3A+coexistence+of+multiple+minor+risk+factors+results+in+higher+recurrence+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher recurrence rates.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 77 (4), 1024-1029 (2010).</li>
<li>Dai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+in+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer%3A+an+in+vitro+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer: an in vitro approach.</a> Hum Pathol. 38 (2), 299-307 (2007).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+invasion+in+pancreatic+cancer%3A+a+mutual+tropism+between+neurons+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neural invasion in pancreatic cancer: a mutual tropism between neurons and cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 374 (3), 442-447 (2008).</li>
<li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRalpha1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GFRalpha1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (19), 2008-2017 (2014).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+%28CCL2-CCR2%29+signaling+axis+mediates+perineural+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li>
<li>Bakst, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+impairs+perineural+invasion+by+modulating+the+nerve+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Radiation impairs perineural invasion by modulating the nerve microenvironment.</a> PLoS One. 7 (6), 39925(2012).</li>
<li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction%3A+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li>
<li>Na'ara, S., Gil, Z., Amit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modeling+of+Cancerous+Neural+Invasion%3A+The+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion.</a> J Vis Exp. (110), (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos críticos dentro del Protocolo Los pasos más importantes dentro de este protocolo son la disección precisa y extracción de los ganglios de la raíz dorsal. transección adecuado de la columna vertebral y una división de la línea media longitudinal en dos-hemi-espinas son críticos para la obtención de un gran número de DRG. Durante la disección de los GRD individuales, el ganglio nunca debe ser manejado directamente, sino más bien los que rodean la fascia se debe agarr...

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más común en los Estados Unidos, con 10.000 muertes al año a nivel nacional y 300.000 muertes al año en todo el mundo1. El pronóstico general para el HNSCC se ha mantenido sin cambios en el 50% durante las últimas décadas. La invasión perineural (PNI) es una de las características patológicas más destacadas que auguran un mal pronóstico en los pacientes con HNSCC. Desafortunadamente, la PNI es una ocurrencia frecuente en el HNSCC y puede encontrarse hasta en el 40% de los pacientes con HNSCC2,3. 
PNI es el proceso por el cual las células malignas se desplazan a lo largo de los nervios hasta los tejidos adyacentes, lo que permite tasas más altas de propagación local y a distancia. En consecuencia, los tumores HNSCC positivos para PNI tienen tasas más altas de recidivas locorregionales y metástasis a distancia, lo que resulta en una supervivencia general más baja en comparación con los pacientes con HNSCC sin PNI4-8.
Aunque el tratamiento de los pacientes con PNI generalmente se maximiza mediante el empleo de cirugía, radiación y quimioterapia, las tasas de supervivencia general de estos pacientes aún están disminuidas hasta en un 40% en comparación con los pacientes sin PNI9-11. Por lo tanto, está claro que las modalidades de tratamiento actuales para el HNSCC son ineficaces para mejorar el pronóstico adverso asociado con la PNI. El enfoque del desarrollo de la terapia dirigida contra la PNI en el HNSCC se ha visto obstaculizado por la escasa comprensión de los factores que regulan este proceso. Esto es, en parte, una consecuencia de la falta de un modelo in vitro consistente para el estudio de la PNI en el HNSCC. 
En los últimos años, varios grupos han estado utilizando un modelo in vitro para estudiar el PNI en cánceres predominantemente de páncreas y próstata12-19. Este modelo utiliza las neuritas generadas a partir de ganglios de la raíz dorsal aislados de ratones o ratas como sustituto de la invasión de nervios grandes. Los ganglios de la raíz dorsal se fijan en una matriz semisólida con factor deplecionado, que es una mezcla de proteínas de la membrana basal solubilizada secretada por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm. Esta matriz permite el crecimiento de las neuritas y el seguimiento de células cancerosas individuales a lo largo de estas neuritas. Aquí se describe la adaptación de este modelo para el examen de PNI en HNSCC.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12 50/50 Mezcla con L-glutamina y 15 mM HEPES</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-090-CV</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Flowery Branch, GA</td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>25200056</td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualif Mouse</td><td>Corning Incorporated</td><td>354277</td><td>Bedford, MA</td></tr><tr><td>Placas de cultivo con fondo de vidrio irradiadas con rayos gamma de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Ashland, MA</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8 Microscopio</td> de operación <td>Carl Zeiss Microimaging</td><td>495015-0021-000&nbsp;</td><td>Thornwood, Nueva York</td></tr><tr><td>Fuente de luz Schott ACE I</td><td>Schott</td><td>A20500</td><td>Alemania</td></tr><tr><td>CellTracker&nbsp;</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>C2925</td><td>Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>BD Aguja PrecisionGlide de 18 G y 21 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Franklin Lakes, NJ</td></tr><tr><td>Pinza de microdisección premium</td><td>Harvard Aparato</td><td>60-3851</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Tijeras estándar de operación fina premium</td><td>Harvard Aparato</td><td>52-2789</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte premium Harvard</td><td> Aparato</td><td>60-3923</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje</td><td>Harvard Aparato</td><td>72-8949</td><td>Holliston, MA</td></tr><tr><td>Ratones desnudos atímicos (002019)</td><td>Laboratorio Jackson 002019</td><td></td><td>Bar Harbor, ME</td></tr></tbody></table>

un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello carcinoma de células escamosas

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

La invasión perineural (PNI) se encuentra en aproximadamente el 40% de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). A pesar del tratamiento multimodal con cirugía, radiación y quimioterapia, las recidivas locorregionales y las metástasis a distancia se presentan en tasas más altas, y la supervivencia general se reduce en un 40 % en comparación con el HNSCC sin PNI. Los estudios in vitro de las vías implicadas en el PNI de HNSCC han sido históricamente un reto debido a la falta de un ensayo consistente y reproducible. Aquí se describe la adaptación del ensayo del ganglio de la raíz dorsal (DRG) para el examen de PNI en HNSCC. En este modelo, los DRG se extraen de la columna vertebral de un ratón desnudo sacrificado y se colocan dentro de una matriz semisólida. Durante los días siguientes, se generan neuritas que crecen en un patrón radial a partir de los cuerpos celulares del DRG. A continuación, las líneas celulares HNSCC se colocan periféricamente alrededor de la matriz e invaden preferentemente a lo largo de las neuritas hacia el DRG. Este método permite una evaluación rápida de múltiples condiciones de tratamiento, con tasas de éxito y reproducibilidad de ensayos muy altas.

Después de la disección de la DRG y la colocación dentro de la gotita de matriz, la aparición del ensayo debe parecerse a la Figura 1. Obsérvese que el DRG no es perfectamente redonda, pero se centra dentro de la gotita de matriz. Esto permite la excrecencia de neuritas en 360 grados, que se muestra parcialmente en la figura 2. Tenga en cuenta que ciertas partes de la DRG envían axones más rápido y en mayor número que los demás, por lo general correspond...

La invasión perineural (PNI) es una característica común del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), que confiere tasas de supervivencia más bajas. Sus mecanismos son poco conocidos. Utilizando neuritas generadas a partir de ganglios de la raíz dorsal murina confinados a una matriz semisólida, se pueden investigar las vías involucradas en el PNI de las líneas celulares HNSCC.

Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

El objetivo general de este protocolo experimental es evaluar rápidamente múltiples condiciones de tratamiento que afectan la invasión perineural en el cáncer escamoso de cabeza y cuello con tasas de éxito y reproducibilidad de ensayos muy altas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología de cabeza y cuello, como cuáles son los factores que influyen en la invasión perineural de las células del cáncer de cabeza y cuello. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar un gran número de ensayos de forma rápida y reproducible a partir de un ratón en un período de tiempo relativamente corto.Antes de comenzar el procedimiento de disección del ganglio de la raíz dorsal, o DRG, agregue medio fresco a temperatura ambiente a por lo menos 40 pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Luego, use un par de tijeras finas para hacer una incisión longitudinal a lo largo de la columna vertebral desde la raíz de la cola hasta la cabeza del ratón. Y divide transversalmente el tejido debajo de la columna sacra, diseccionando ambos lados de la columna, hasta la base del cráneo.Transfiera la muestra bajo el microscopio y observe el extremo cervical de la columna vertebral a baja potencia. La médula espinal blanca es aparente en el centro de un anillo óseo, que está rodeado por cantidades variables de músculos periespinales y tejido blando. Con unas tijeras de resorte microscópicas, divida la cara dorsal, o superior, de los primeros dos o tres cuerpos vertebrales.A continuación, utiliza la acción de resorte de las tijeras para abrir este corte óseo inicial, para asegurarte de que la disección del cuerpo vertebral se produzca en la línea media. Continúe en pequeños incrementos hacia la columna sacra, dividiendo la columna vertebral con cortes idénticos en la cara ventral o inferior de los cuerpos vertebrales. Colocando una hemispina a un lado, transfiera la otra mitad de la columna vertebral boca abajo sobre una placa estéril con la médula espinal en su lugar.Y use dos agujas de calibre 18 para asegurar ambos extremos de la hemispina en la plataforma de disección de poliestireno. A continuación, comenzando por el extremo cervical más estrecho, retire suavemente la médula espinal desde aproximadamente cuatro niveles vertebrales. En la región donde los nervios sensoriales se insertan en el DRG, agarre suavemente la fascia circundante con pinzas microscópicas y use tijeras de resorte microscópicas para recortar esta fascia y otro tejido nervioso para liberar el DRG.Con mayor aumento, use las tijeras de resorte para cortar el nervio periférico lo más cerca posible del DRG para liberar el tejido y recortar las ramas proximales. A continuación, recorte el DRG de cualquier fibra nerviosa perdida o inserciones fasciales y coloque el tejido aislado en un pocillo de la placa inferior en V de 96 pocillos. Para preparar las gotas de matriz semisólida, transfiera una placa de vidrio con el fondo del pozo de hielo a un bloque de hielo bajo el microscopio operativo.Coloque la punta de una pipeta de no más de 10 microlitros directamente sobre el vaso en un ángulo de 45 grados y dispense con cuidado una gota de matriz de 1,5 microlitros sobre el vaso. Aleje lentamente la punta de la pipeta del vidrio a medida que la matriz se acopla a la placa. Deposite una gota de matriz en cada una de las cuatro esquinas de la placa y transfiera la placa a una superficie a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto.Cuando la matriz se haya endurecido ligeramente, regrese la placa al bloque de hielo y use pinzas microscópicas cerradas para recoger el DRG suavemente con la mano izquierda. Con la mano derecha, transfiera con cuidado el tejido nervioso a la punta de una aguja de calibre 21 y use la aguja para insertar suavemente el DRG en el centro de la gota de la matriz. El DRG debe liberarse fácilmente en la matriz para su posicionamiento central con la aguja.Después de insertar una pieza de DRG en cada una de las cuatro gotas, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres minutos. Cuando se hayan incrustado todos los DRG, sostenga las placas una a la vez, en un ligero ángulo y agregue lentamente cuatro mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS a las placas, de modo que el medio solo entre en contacto gradualmente con las unidades de DRG de la matriz. Regrese las placas a la incubadora durante otras 48 a 72 horas.Cuando las neuritas alcancen al menos el 75% del camino hasta el borde de la matriz, aspire el medio de los pocillos sin quitar las unidades DRG de la matriz. A continuación, utilizando una pipeta de 200 microlitros, con un gatillo suave, coloque dos gotas de tres veces 10 a la quinta celda por mililitro de medio sobre cada ensayo de DRG de la matriz. Y regrese las placas a la incubadora.Después de una hora, agregue suavemente cuatro mililitros de DMEM con 10% de FBS a lo largo de la pared lateral de la placa con fondo de vidrio y devuelva las placas a la incubadora hasta su próxima evaluación microscópica. Después de su disección y colocación dentro de las gotas de la matriz, la apariencia del ensayo debe parecerse al DRG incrustado en la matriz que se muestra aquí. Tenga en cuenta que el DRG no es perfectamente redondo, sino que está centrado dentro de la gota de la matriz, lo que permite el crecimiento de las neuritas en 360 grados.Inmediatamente después de la siembra, las células escamosas del cáncer de cabeza y cuello forman un anillo circunferencial alrededor de la matriz, expandiéndose a lo largo de las neuritas durante los siguientes dos o tres días. Las células colocadas en gotas de control en blanco que contienen solo la matriz se dividen activamente alrededor de las matrices, pero no entran ni se extienden por la parte superior. Para cuantificar la invasión perineural de las células cancerosas, las imágenes de los ensayos se dividen en cuatro cuadrantes a través de una línea vertical y otra horizontal.A continuación, se puntúan una serie de puntos para cada extensión de invasión perineural observada en cada cuadrante, lo que permite comparar los crecimientos de células cancerosas a lo largo de las neuritas entre diferentes líneas celulares cancerosas. Una vez dominada, la técnica de aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal puede completarse en menos de dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante minimizar la manipulación excesiva de los ganglios de la raíz dorsal, ya que la lesión por aplastamiento es la razón más común del fracaso del ensayo.Después de este procedimiento, se pueden estudiar los mecanismos de invasión perineural, lo que podría conducir al desarrollo de terapias dirigidas contra este tipo de invasión de tejidos blandos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar los ganglios de la raíz dorsal de un ratón y configurar un ensayo para examinar la invasión perineural.

a-model-for-perineural-invasion-head-neck-squamous-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

En este video, describimos el método para co-cultivar ganglios de la raíz dorsal y células cancerosas en la membrana corioalantoidea de pollo o CAM para estudiar la invasión perineural.

Membrana corioalantoidea de pollo o modelo tumoral CAM: un método in ovo para simular la invasión perineural de células tumorales

En este video, demostramos el procedimiento para desarrollar un modelo de invasión de células de cáncer perineural in vitro mediante el cultivo conjunto de células de cáncer neurotrópico y ganglios de raíz dorsal de ratón. El modelo se puede utilizar para realizar ensayos de cáncer, produciendo resultados rápidos y reproducibles.

Establecimiento de un modelo de cocultivo tridimensional de ganglios de raíz dorsal murina y células cancerosas: un modelo in vitro para estudiar la invasión de células cancerosas perineurales

En este video, desarrollamos un modelo de ratón in vivo para la invasión perineural mediante la inyección de células de cáncer de páncreas en el nervio ciático. Este modelo ayuda a cuantificar el alcance de la invasión y a estudiar las interacciones entre las células cancerosas y los nervios.

Modelo de invasión perineural murina: generación de un modelo in vivo para simular la invasión perineural en el nervio ciático de ratón

En este video, describimos el procedimiento para establecer un modelo murino de invasión perineural mediante la inyección de células cancerosas en el nervio ciático. El modelo puede ayudar a comprender la magnitud de la invasión nerviosa para la posterior evaluación de fármacos contra el cáncer.

Modelo de invasión perineural o PNI del nervio ciático murino: extracción y procesamiento del nervio ciático para comprender la invasión por células cancerosas

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este artículo de video muestra el uso del modelo de ganglios de la raíz dorsal (DRG)/células cancerosas en el adenocarcinoma ductal pancreático.

En Vitro Modelado de canceroso Neural Invasion: Modelo del ganglio de la raíz dorsal

Describimos un modelo murino en vivo de invasión perineural por células de cáncer pancreático syngeneic de inyección en el nervio ciático. El modelo permite la cuantificación del grado de invasión del nervio y apoya la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la invasión perineural.

Un modelo de nervio ciático murinos In Vivo de invasión Perineural

Describimos la evolución de un modelo tridimensional, basado en el esferoide en vitro que nos permite poner a prueba el estándar actual de los regímenes de terapia experimental para cabeza y cuello de células escamosas en líneas celulares, con el objetivo de evaluar la terapia susceptibilidad y resistencia en células primarias de muestras humanas en el futuro.

Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

Aquí presentamos un método reproducible para el desarrollo de un modelo Murino ortotópico de cabeza y cuello de células escamosas. Tumores demuestran clínicamente relevantes características histopatológicas de la enfermedad, como necrosis, pobre diferenciación, metástasis ganglios, infiltración inmune. Ratones con tumores síntomas clínicamente relevantes incluyendo disfagia, desplazamiento de la mandíbula y pérdida de peso.

Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta

La invasión perineuronal es un fenotipo agresivo para carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello y otros tumores. El modelo de membrana corioalantoica de polluelos se ha utilizado para estudiar angiogénesis, invasión de cáncer, y metástasis. Aquí demostramos cómo este modelo se puede utilizar para evaluar la invasión perineural in vivo.

El modelo Chick Chorioalantoic Membrane In Vivo para evaluar la invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello

Aprende a evaluar condiciones de tratamiento que afectan la invasión perineural en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello utilizando ganglios de raíz dorsal de ratón. Este método permite realizar múltiples ensayos reproducibles en poco tiempo.

Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

Explorar más videos