Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

El objetivo general de este protocolo experimental es evaluar rápidamente múltiples condiciones de tratamiento que afectan la invasión perineural en el cáncer escamoso de cabeza y cuello con tasas de éxito y reproducibilidad de ensayos muy altas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología de cabeza y cuello, como cuáles son los factores que influyen en la invasión perineural de las células del cáncer de cabeza y cuello. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar un gran número de ensayos de forma rápida y reproducible a partir de un ratón en un período de tiempo relativamente corto.

Antes de comenzar el procedimiento de disección del ganglio de la raíz dorsal, o DRG, agregue medio fresco a temperatura ambiente a por lo menos 40 pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Luego, use un par de tijeras finas para hacer una incisión longitudinal a lo largo de la columna vertebral desde la raíz de la cola hasta la cabeza del ratón. Y divide transversalmente el tejido debajo de la columna sacra, diseccionando ambos lados de la columna, hasta la base del cráneo.

Transfiera la muestra bajo el microscopio y observe el extremo cervical de la columna vertebral a baja potencia. La médula espinal blanca es aparente en el centro de un anillo óseo, que está rodeado por cantidades variables de músculos periespinales y tejido blando. Con unas tijeras de resorte microscópicas, divida la cara dorsal, o superior, de los primeros dos o tres cuerpos vertebrales.

A continuación, utiliza la acción de resorte de las tijeras para abrir este corte óseo inicial, para asegurarte de que la disección del cuerpo vertebral se produzca en la línea media. Continúe en pequeños incrementos hacia la columna sacra, dividiendo la columna vertebral con cortes idénticos en la cara ventral o inferior de los cuerpos vertebrales. Colocando una hemispina a un lado, transfiera la otra mitad de la columna vertebral boca abajo sobre una placa estéril con la médula espinal en su lugar.

Y use dos agujas de calibre 18 para asegurar ambos extremos de la hemispina en la plataforma de disección de poliestireno. A continuación, comenzando por el extremo cervical más estrecho, retire suavemente la médula espinal desde aproximadamente cuatro niveles vertebrales. En la región donde los nervios sensoriales se insertan en el DRG, agarre suavemente la fascia circundante con pinzas microscópicas y use tijeras de resorte microscópicas para recortar esta fascia y otro tejido nervioso para liberar el DRG.

Con mayor aumento, use las tijeras de resorte para cortar el nervio periférico lo más cerca posible del DRG para liberar el tejido y recortar las ramas proximales. A continuación, recorte el DRG de cualquier fibra nerviosa perdida o inserciones fasciales y coloque el tejido aislado en un pocillo de la placa inferior en V de 96 pocillos. Para preparar las gotas de matriz semisólida, transfiera una placa de vidrio con el fondo del pozo de hielo a un bloque de hielo bajo el microscopio operativo.

Coloque la punta de una pipeta de no más de 10 microlitros directamente sobre el vaso en un ángulo de 45 grados y dispense con cuidado una gota de matriz de 1,5 microlitros sobre el vaso. Aleje lentamente la punta de la pipeta del vidrio a medida que la matriz se acopla a la placa. Deposite una gota de matriz en cada una de las cuatro esquinas de la placa y transfiera la placa a una superficie a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto.

Cuando la matriz se haya endurecido ligeramente, regrese la placa al bloque de hielo y use pinzas microscópicas cerradas para recoger el DRG suavemente con la mano izquierda. Con la mano derecha, transfiera con cuidado el tejido nervioso a la punta de una aguja de calibre 21 y use la aguja para insertar suavemente el DRG en el centro de la gota de la matriz. El DRG debe liberarse fácilmente en la matriz para su posicionamiento central con la aguja.

Después de insertar una pieza de DRG en cada una de las cuatro gotas, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres minutos. Cuando se hayan incrustado todos los DRG, sostenga las placas una a la vez, en un ligero ángulo y agregue lentamente cuatro mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS a las placas, de modo que el medio solo entre en contacto gradualmente con las unidades de DRG de la matriz. Regrese las placas a la incubadora durante otras 48 a 72 horas.

Cuando las neuritas alcancen al menos el 75% del camino hasta el borde de la matriz, aspire el medio de los pocillos sin quitar las unidades DRG de la matriz. A continuación, utilizando una pipeta de 200 microlitros, con un gatillo suave, coloque dos gotas de tres veces 10 a la quinta celda por mililitro de medio sobre cada ensayo de DRG de la matriz. Y regrese las placas a la incubadora.

Después de una hora, agregue suavemente cuatro mililitros de DMEM con 10% de FBS a lo largo de la pared lateral de la placa con fondo de vidrio y devuelva las placas a la incubadora hasta su próxima evaluación microscópica. Después de su disección y colocación dentro de las gotas de la matriz, la apariencia del ensayo debe parecerse al DRG incrustado en la matriz que se muestra aquí. Tenga en cuenta que el DRG no es perfectamente redondo, sino que está centrado dentro de la gota de la matriz, lo que permite el crecimiento de las neuritas en 360 grados.

Inmediatamente después de la siembra, las células escamosas del cáncer de cabeza y cuello forman un anillo circunferencial alrededor de la matriz, expandiéndose a lo largo de las neuritas durante los siguientes dos o tres días. Las células colocadas en gotas de control en blanco que contienen solo la matriz se dividen activamente alrededor de las matrices, pero no entran ni se extienden por la parte superior. Para cuantificar la invasión perineural de las células cancerosas, las imágenes de los ensayos se dividen en cuatro cuadrantes a través de una línea vertical y otra horizontal.

A continuación, se puntúan una serie de puntos para cada extensión de invasión perineural observada en cada cuadrante, lo que permite comparar los crecimientos de células cancerosas a lo largo de las neuritas entre diferentes líneas celulares cancerosas. Una vez dominada, la técnica de aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal puede completarse en menos de dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante minimizar la manipulación excesiva de los ganglios de la raíz dorsal, ya que la lesión por aplastamiento es la razón más común del fracaso del ensayo.

Después de este procedimiento, se pueden estudiar los mecanismos de invasión perineural, lo que podría conducir al desarrollo de terapias dirigidas contra este tipo de invasión de tejidos blandos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar los ganglios de la raíz dorsal de un ratón y configurar un ensayo para examinar la invasión perineural.