Name: Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprende a derivar fibroblastos meníngeos de tejido cerebral postmortem humano mediante cultivo de explantes. Este protocolo permite obtener líneas celulares fibronectina-positivas en 6-8 semanas para estudiar el Parkinson.

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El desarrollo de este protocolo fue financiado por donaciones privadas dirigidas al Programa de Donación de Cerebros del Instituto de Parkinson.

El registro de la donación de cerebro incluye documentación por el solicitante de registro de su intención de donar. El permiso de la autopsia para la recuperación de los tejidos es proporcionada por los familiares de lo permitido por la ley. Los estudios de investigación utilizando muestras de autopsia recogidos son revisados ​​por la Junta de Revisión Institucional (IRB) para garantizar el cumplimiento de portabilidad del seguro médico y reglamentos de la Ley de Responsabilidades (HIPAA). Nota: Las muestras leptomeninges son recogidos por el disector de cerebro o neuropathologist durante una disección cerebro y se almacenan en tubos cónicos de 50 ml que contenían 25-30 ml meninges medio de crecimiento. La muestra se almacena a 4 ° C hasta que la preparación de muestras. El tratamiento debe realizarse lo más pronto posible ya que la viabilidad de las células disminuye con el tiempo de post mortem. 1. Puesta en marcha antes de iniciar la disección leptomeninges NOTA: Los pasos 1.1 a 1.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. <ol><li> Preparar medio de crecimiento meninges combinando 375 ml de Dulbecco modificado de Eagle Media, 100 ml de suero bovino fetal, 5 ml 10 mM de aminoácidos no esenciales, 5 ml 200 mM L-alanil-L-glutamina, 5 ml de piruvato sódico 100 mM, 5 ml 10000 U / ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml 250 mg / ml de anfotericina B en 500 ml unidad de filtro. Filtrar y mezclar. Utilizar los medios de comunicación para un máximo de cuatro semanas. </li><li> Coloque todos los materiales en la cabina de bioseguridad antes de comenzar la disección: platos de Petri 4x, 2x placas de 6 pocillos, 2x escalpelos, 15-20 esterilizados cubreobjetos de 15 mm, tampón fosfato salino (PBS), pipetas serológicas, aspirando pipetas. </li><li> Añadir 1 ml de solución estéril en autoclave gelatina 0,1% a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Ajuste el plato a un lado durante 30-60 minutos. Preparar 2x placas de 6 pocillos. </li></ol> 2. Preparación de la muestra leptomeninges NOTA: Los pasos 2.1 a 2.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. <ol><li> Añadir aproximadamente 10 ml de PBS paraa 10 cm placa de cultivo tisular estéril y coloque la muestra meninges en el plato. Con unas pinzas, lavar suavemente leptomeninges con PBS para eliminar la sangre. </li><li> La transferencia de las meninges en un nuevo 10-cm placa de cultivo de tejido que contenía 10 ml de PBS fresco y seguir lavando. Repetir si es necesario para eliminar la mayor cantidad de sangre posible. </li><li> El uso de dos escalpelos, cortados leptomeninges tejido en un aproximado de 6 cm x 6 cm pedazo grande. </li><li> Coloque la tapa sobre una placa de cultivo y la transferencia a un microscopio de disección en una campana de flujo laminar horizontal. </li></ol> 3. La disección de tejidos de leptomeninges NOTA: Los pasos 03.01 a 03.03 se va a realizar dentro de una campana de flujo laminar horizontal usando un microscopio de disección. <ol><li> Eliminar los vasos sanguíneos de una región en la pieza leptomeninges (paso 2.3) lo suficientemente grande como para crear al menos 20-25 3 piezas mm x 3 mm. Mantenga las leptomeninges en su lugar con una bisturí y con la otra, utilizar un mo raspado suave y poco profundación para separar los vasos. </li><li> Cortar pequeños cuadrados de tejido de la región preparados. Cortar en un proceso por etapas primero haciendo pedazos más grandes y luego cortar los en secciones más pequeñas. </li><li> Utilice uno bisturí para mantener el tejido en su lugar y otro bisturí para cortar el tejido con un movimiento de balanceo. Debido a la consistencia del tejido, es difícil deslizar los escalpelos uno contra el otro. Esto sólo se rasgará el tejido aparte y los resultados en los bordes desiguales. </li><li> Continuar el corte de las piezas por la mitad hasta que hay alrededor de 20-25 piezas de 3 mm x 3 mm. </li></ol> 4. Transferencia de disecado meninges piezas en tejido Placas de Cultivo NOTA: El paso 4 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. <ol><li> Aspirar la gelatina de la placa de 6 pocillos (del paso 1.3). Añadir 1 ml de medio de crecimiento de las meninges a cada pocillo. El uso de pinzas estériles, coloque 3-4 piezas de biopsia en cada pocillo. </li></ol> 5. Colocación de la cubierta se desliza sobre MPiezas eninges NOTA: Los pasos 5.1 a 5.2 se va a realizar dentro de una campana de flujo laminar horizontal usando un microscopio de disección. <ol><li> Cubrir las piezas con 1-2 de 15 mm cubreobjetos circulares estériles por pocillo. </li><li> Presione hacia abajo firmemente con unas pinzas para asegurar las piezas estén en contacto con la parte inferior de la placa. Esto permite la unión de piezas de tejido a la parte inferior del pozo. </li><li> Coloque la placa de 6 pocillos en un 37 ° C, 5% de CO2. </li></ol> 6. Mantenimiento de Cultivos Celulares NOTA: Los pasos 6.1 a 6.3 se va a realizar dentro de una cabina de bioseguridad. Manejar con cuidado las placas de cultivo como cubreobjetos no deben mover y desplazar las piezas meninges. <ol><li> Después de 2 días de cultivo, añadir 1 ml adicionales de medio de cultivo fresco meninges a cada pocillo. </li><li> En el día 7, aspirar con cuidado los medios de comunicación y añadir 2 ml de medio fresco a cada pocillo. </li><li> Después Día 9, seguirá cambiando cada medio de crecimientodos días hasta que se convierte en la cultura confluente. </li></ol> 7. pases NOTA: Todos los pasos deben ser realizados dentro de una cabina de bioseguridad. Una vez que los fibroblastos meníngeos han emigrado fuera de las piezas de tejido meníngeas y empezar a crecer hacia los bordes del recipiente de cultivo, ampliar fibroblastos meníngeos en placa de cultivo más grande. <ol><li> Antes de iniciar el passaging, capa la placa de cultivo con 1% de gelatina durante 15-30 min. </li><li> Aspirar los medios de placa de 6 pocillos y lavar las células con 2 ml de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina / EDTA a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 a 10 min. No es necesario retirar los cubreobjetos o el tejido meníngeo para este paso. </li><li> Cuando las células se redondean y se empiezan a separar, añadir 2 ml de medio de cultivo. </li><li> Las células de la pipeta hacia arriba y abajo para interrumpir por completo todos los grumos y transferir la solución de células de placa de cultivo más grande. </li><li> Utilice una relación de 1: 3 a 1: 4 para combinar las células de los tres platos de 6 pocillos ena una placa de cultivo T75. </li><li> Una vez que las células fibroblastos meníngeos son confluentes en matraces de cultivo T75, trypsinize las células, y criopreservar en los medios de crioconservación en 1x10 6 células / ml por vial. Un matraz de cultivo T75 con meníngea fibroblastos confluentes contiene alrededor de 5-7 millones de células. </li></ol> 8. Caracterización de los fibroblastos meníngeos por inmunotinción NOTA: Antes de comenzar el procedimiento, preparar la solución de paraformaldehído al 4%, suero de cabra normal al 5% en PBS (tampón de bloqueo), 0,3% de Triton X-100 en PBS (tampón de permeabilización), soluciones de anticuerpos primarios y secundarios, y 1 mg / ml de Hoechst 33342 diluido en PBS a partir de 10 mg / mL de stock. <ol><li> Semilla de 15.000 a 30.000 fibroblastos meníngeos en 8 pocillos recubiertos con cámara de diapositivas 0,1% de gelatina. </li><li> Después de 24 h cuando se unen las células, fijar las células en 100 l 4% de paraformaldehído por pocillo durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x. </li><li> Permeabilizar las células con 150 l de 0,3% de Triton X-100 para 5 min a temperatura ambiente. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x. </li><li> Añadir 200 l de solución de bloqueo (PBS + 5% de suero normal de cabra) durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar la solución de bloqueo, y añadir 150 l de anticuerpos primarios deseados diluido en solución de bloqueo. Por doble tinción, preparar diluciones de trabajo de los anticuerpos primarios en tubos de centrífuga separados en el hielo de la siguiente manera: <ol><li> Preparar una dilución 1: 300 de anti-fibronectina + dilución 1: 200 de anti-nestina en solución de bloqueo. Preparar una dilución 1: 250 de anti-SERPINH1 + 1: 1000 dilución de anti-Tuj1 en solución de bloqueo. Preparar 1: 250 dilución de anti-SERPINH1 + 1: 100 dilución de anti-SOX2 en solución de bloqueo </li></ol></li><li> Se incuba a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x. </li><li> Preparar un trabajo dilución 1: 400 de la etiqueta fluorescente secundaria de anticuerpos de cabra anti-conejo (verde; Ex / Em 2 </shasta&gt; 495/519 nm) y de cabra anti-ratón (rojo; Ex / Em 2 590/617 nm) en solución de bloqueo y añadir 100 l a cada pocillo. Incubar durante 1 h, en la oscuridad, a temperatura ambiente. Luego se lavan los pocillos una vez con PBS 1x. </li><li> Añadir 100 l de 1 mg / ml de Hoechst 33342 (azul; Ex / Em 2 358/461 nm) solución a cada pocillo y se incuba en la oscuridad durante 3 min. Lavar los pocillos 3 veces con PBS 1x, dejando en la final de lavado 1x PBS en el pozo, y cubrir el portaobjetos con papel de aluminio. </li><li> Analizar las células bajo el microscopio de fluorescencia. </li></ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
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<li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li>
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<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
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<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un protocolo simple y robusto para derivar un cultivo de fibroblastos de meníngea leptomeninges postmortem humanos recogidos en conjunción con una donación cerebro. Hay muy pocas descripciones de los protocolos para derivar los cultivos celulares a partir de material humano postmortem. Dos estudios describen cultivos de fibroblastos 7, 8, de la piel derivado de 9, un estudio describe muestras Dura <sup c...

Meninges consisten en tres membranas que protegen el cerebro: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. Más recientemente, se ha reconocido que meninges también juegan un papel importante en el desarrollo del cerebro y el cerebro homeostasis 1. Meninges se derivan de mesenquimales y células derivadas de la cresta neural y de manera interesante, se ha demostrado que las células progenitoras que residen en meninges puede dar lugar a neuronas in vitro y después del trasplante in vivo 2, 3, 4. Culturas Meninges han sido también utilizado con éxito como capas de alimentación, ya que poseen actividad inductora de derivado de células del estroma para la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas dopaminérgicas 5. Por otra parte, leptomeninges tienen el potencial de diferenciarse directamente en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en condiciones isquémicas 6. Para este protocolo, humanos muestras postmortem meninges se recogen de la aracnoides y la piamadre, llamados colectivamente las leptomeninges, y se adquieren como parte de una donación de cerebro humano con fines de investigación. La disección del cerebro se lleva a cabo dentro de las 24 h de la muerte y la muestra leptomeninges se coloca en medio de cultivo frío para su posterior procesamiento en el próximo 6-8 h como se ilustra aquí en este protocolo. Este protocolo describe la disección y preparación de muestras meninges humanos para el desarrollo de cultivo de células primarias leptomeninges paciente. El tejido se corta en piezas de aproximadamente 25-30 3 mm x 3 mm cuadrados. Tres piezas se colocan en cada uno de 6 pocillos recubiertos de gelatina bien y se mantiene presionada con cubreobjetos de vidrio redondos. La disección de las meninges toma alrededor de 25-35 minutos. El principal reto con esta cultura es la esterilidad como la adquisición del cerebro, el transporte, y la disección generalmente no se llevan a cabo en condiciones estériles. Tor lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B y el uso de platos de múltiples pocillos de cultivo de tejidos por separado piezas. Consecuencia de fibroblastos meníngeos ocurre generalmente dentro de la primera semana. Medios se cambia cada dos o tres días hasta que las células son confluentes y las células se pasan enzimáticamente. Los fibroblastos meníngeos son criopreservados en 1 millón de células por ml / vial en los medios de crioconservación. Con este protocolo, 20-30 millones de fibroblastos meníngeos se pueden derivar en 6-8 semanas para la criopreservación. aplicaciones posteriores de estos fibroblastos meníngeos son cultivos primarios para la investigación de enfermedades, la diferenciación neuronal directa o derivación de células madre pluripotentes inducidas a partir de las leptomeninges para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad y para el desarrollo de fármacos.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 351029 <td></td></tr><tr><td>Nunc Placa de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes, hoja estéril, n.º 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvadas de punta de precisión</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning Unidad de filtro de 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Combine los componentes de los medios y filtro.</td></tr><tr><td>Matraces tratados con cultivo celular Nunc con tapones filtrantes, T175 cm2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B (Solución Amarilla/250 &micro; g/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Compañía</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Fibronectina Tinción</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 portaobjetos de cámara de pocillos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% de paraformaldehído&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% glicerol&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra 100% normal&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-fibronectina [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>dilución 1:300 en solución bloqueante</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul dilución</td><td>1:250 en solución bloqueante</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>dilución 1:100 en solución bloqueante</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 dilución en solución bloqueante</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>dilución 1:1.000 en solución bloqueante</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-conejo</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>dilución 1:400 en solución bloqueante; (Canal Verde; Ex/EM2 495/519 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-ratón</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>dilución 1:400 en solución de bloqueo; (canal rojo; Ex/EM2 590/617 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 tinte</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>diluido hasta una concentración final de 1,0 &mu; g/mL; (canal azul; Ex/EM2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Los proveedores son sugerencias, también se pueden utilizar productos similares de proveedores alternativos.</td></tr></tbody></table>

derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem humanos los donantes de cerebro

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

A pesar de que se han hecho grandes avances en la caracterización clínica de la enfermedad de Parkinson, varios estudios indican que el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson no está confirmado patológicamente en hasta el 25% de las enfermedades clínicamente diagnosticados de Parkinson. Por lo tanto, el tejido recogido de pacientes con diagnóstico clínico de enfermedad de Parkinson idiopática pueden tener una alta tasa de diagnóstico erróneo; por lo tanto, en estudios in vitro a partir de tales tejidos para estudiar la enfermedad de Parkinson como un modelo preclínico puede llegar a ser inútil. Mediante la recopilación de las leptomeninges humanos postmortem con un diagnóstico neuropatológico confirmado de la enfermedad de Parkinson y que se caracteriza por la pérdida de células nigroestriatal y las inclusiones de proteínas intracelulares llamadas cuerpos de Lewy, uno puede estar seguro de que el parkinsonismo clínicamente observada no es causada por otra enfermedad subyacente (por ejemplo, tumores, arteriosclerosis). Este protocolo presents la disección y preparación de las leptomeninges de cadáver utilizadas para derivación de un cultivo de fibroblastos meníngea. Este procedimiento es robusto y tiene una alta tasa de éxito. El reto de la cultura es la esterilidad como la adquisición cerebro generalmente no se lleva a cabo en condiciones estériles. Por lo tanto, es importante para complementar los medios de cultivo con un cóctel de penicilina, estreptomicina y anfotericina B. La derivación de los fibroblastos meníngeos de casos confirmados de la autopsia con la enfermedad de Parkinson proporciona la base para el modelado in vitro de la enfermedad de Parkinson. fibroblastos meníngeos aparecen 3-9 días después de la preparación de la muestra y cerca de 20-30 millones de células pueden ser criopreservados en 6-8 semanas. El cultivo de fibroblastos meníngea es homogénea y las células expresan la fibronectina, un marcador utilizado comúnmente para identificar meninges.

Cuando el protocolo de procesamiento leptomeninges ha tenido éxito, primero se observa consecuencia de fibroblastos meníngeos tres a nueve días después de la disección, aunque esto puede depender de la duración del intervalo post-mortem para el cerebro. La Figura 1 muestra los cultivos de fibroblastos meníngeas de cuatro donantes diferentes. La figura 1A muestra una pieza leptomeninges sujetado por un cubreobjetos de vidrio (línea diagonal oscura) y el c...

El protocolo de cultivo de explante de leptomeninges cerebral postmortem humana es una forma técnicamente robusto y sencillo para derivar los fibroblastos meníngeos fibronectina positiva dentro de 6-8 semanas y criopreservar aproximadamente 20-30 millones de células.

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Soy Birgitt Schule, directora del Programa de Donación de Cerebro del Instituto y Centro Clínico de Parkinson. En este vídeo, describimos una técnica para un cultivo de células explantadas y la duración de fibroblastos primarios de leptomeninges de cerebro humano post mortem de pacientes con enfermedad de Parkinson. Estos fibroblastos se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos basados en células.Esto es importante, porque podemos estudiar líneas celulares de casos probados por autopsias de enfermedad de Parkinson esporádica con patología de cuerpos de Lewy. Comience colocando todos los materiales necesarios en la campana de cultivo de tejidos. Todos los objetos que ingresen al capó deben rociarse con etanol al 70% y limpiarse.El primer paso es transferir las meninges del tubo al plato de corte. Comience vertiendo aproximadamente 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato en un plato de corte estéril de 10 centímetros. Aquí se pueden ver las meninges.Con pinzas estériles, transfiera con cuidado las meninges al plato de corte. Realice este paso lentamente para evitar que se rompa. El siguiente paso es lavar las meninges en PBS para eliminar la mayor cantidad de sangre posible.Si su muestra está demasiado sanguinolenta, puede considerar transferirla a otro plato de corte. Agregue otros 10 mililitros de PBS en un plato fresco de 10 centímetros. Repita este lavado para continuar eliminando la sangre de las meninges.Finalmente, transfiera las meninges a un plato fresco de 10 centímetros que contenga PBS. Cuando termine, cubra el plato y transfiéralo al microscopio de disección en la campana de flujo laminar. El siguiente paso es continuar seccionando las meninges en pedazos más pequeños.Con dos bisturíes estériles, separe suavemente los vasos sanguíneos de las meninges con un movimiento de raspado poco profundo. Prepare una región lo suficientemente grande como para cortar aproximadamente 18 piezas de 3 milímetros por 3 milímetros, como se muestra en esta imagen. Luego, tome el bisturí y, con un movimiento de balanceo, corte la región preparada en trozos de 3 milímetros por 3 milímetros.Es más fácil hacer esto en un proceso escalonado cortando primero las meninges en trozos más grandes y luego cortando esos trozos en secciones más pequeñas. Cubra el plato de corte y transfiéralo nuevamente a la campana de cultivo de tejidos. A continuación, prepárese para transferir las meninges a una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos que haya sido bastante cubierta con 1 mililitro de gelatina al 0,1 por ciento durante 30 a 60 minutos.Agregue un mililitro de medio de meninges en cada pocillo. Luego, con pinzas estériles, transfiera tres o cuatro piezas de meninges al centro de cada pocillo. Las células que crezcan en esta placa serán un pasaje cero.El siguiente paso utiliza cubreobjetos para asegurarse de que las piezas de meninges estén fijas y permanezcan en contacto con la placa de cultivo. Coloque un cubreobjetos circular estéril de 15 milímetros sobre las piezas de meninges. Si es necesario, vuelva a colocar las piezas de meninges con un cubreobjetos.Luego, con las pinzas, presione firmemente el cubreobjetos para asegurarse de que las piezas toquen la placa. Esta imagen muestra las piezas de meninges sujetas con un cubreobjetos. Coloque la tapa sobre la placa de seis pocillos y transfiera con cuidado la placa a una incubadora configurada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Después de dos días en cultivo, agregue un mililitro adicional de medio de meninges fresco a cada pocillo. A los siete días, aspira los medios. Luego, vuelva a llenar cada pocillo con 2 mililitros de medio fresco.Después del séptimo día, continúe rellenando los pozos con 2 mililitros de medios frescos cada dos días. Esta imagen muestra el día inicial de las meninges y el cultivo bajo un microscopio invertido. Después de aproximadamente seis a nueve días, se puede observar la unión celular en la primera excrecencia.Entre 15 y 19 días, el número de células aumenta y el crecimiento se vuelve más denso. Los fibroblastos meníngeos se caracterizan por la expresión de fibronectina. Estas imágenes muestran células meníngeas cultivadas que se han teñido y son positivas para fibronectina.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar cultivos de explantes de leptomeninges de donantes de cerebro humano post mortem. Esta técnica proporciona una forma sencilla y robusta de derivar fibroblastos meníngeos en un plazo de tres a seis semanas, y permite almacenar de 15 a 20 millones de células con un número de paso bajo.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

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Este video muestra una técnica para establecer un cultivo tridimensional de células gliales. Las células gliales derivadas del cerebro de rata están encapsuladas dentro de una matriz polimérica fotoreticulable que contiene componentes de la matriz extracelular. Al incubar en un medio de crecimiento, las células gliales proliferan dentro de la matriz de soporte para crear un cultivo tridimensional.

Establecimiento de un cultivo tridimensional de células gliales derivadas del cerebro de rata

El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de...

Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

Este protocolo describe un método para rastrear trayectorias individuales de envejecimiento cerebral a través de un programa de donación cerebral y caracterización adecuada de cerebros. Los donantes cerebrales participan en un estudio longitudinal a largo plazo que incluye evaluaciones multidimensionales en serie. El protocolo contiene una descripción detallada del procesamiento cerebral y una metodología de diagnóstico precisa.

Protocolo del Banco Cerebral Abbiategrasso para Recopilar, Procesar y Caracterizar Cerebros De Envejecimiento

Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.

Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.

Recolección y cultivo primario de células endoteliales linfáticas leptomeníngeas

En este artículo se describe un protocolo para la propagación de células tumorales circulantes por líquido cefalorraquídeo (CTC-LCR) recolectadas de pacientes con enfermedad leptomeníngea asociada a melanoma (M-LMD) para desarrollar modelos preclínicos para estudiar la M-LMD.

Ex Vivo Cultivo de células tumorales circulantes en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con melanoma para estudiar la enfermedad leptomeníngea asociada al melanoma

Aprende a derivar fibroblastos meníngeos de tejido cerebral postmortem humano mediante cultivo de explantes. Este protocolo permite obtener líneas celulares fibronectina-positivas en 6-8 semanas para estudiar el Parkinson.

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

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