Name: El cultivo de Caenorhabditis elegans En tres dimensiones en el Laboratorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a cultivar Caenorhabditis elegans en sistemas tridimensionales que simulan hábitats naturales. Este método mejora el estudio del comportamiento y la fisiología de nematodos en condiciones más realistas que los cultivos bidimensionales convencionales.

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Este trabajo fue apoyado por un investigador de Nueva Concesión [2014R1A1A1005553] de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) para JIL; y la Universidad de Yonsei líder futuro desafío de Grant [2015-22-0133] para JIL

1. Preparar soluciones para NGT-3D y 3D-NGB <ol><li> Preparar las siguientes soluciones estériles: 1 L de solución 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl 2, 1 L de 1 M MgSO 4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 M KPO 4 tampón (108,3 g de KH 2 PO 4 y 35,6 g de K 2 HPO 4, y llenar H2O hasta 1 l). La producción de NGM el uso de estas soluciones se pueden encontrar en un protocolo anterior 10. </li><li> soluciones autoclave a 121 ° C, 15 min. </li><li> Preparar 50 ml de una solución estéril 5 mg / ml de colesterol. En un tubo cónico de 50 ml, mezclar 0,25 g de colesterol y 50 ml de 99,99% de etanol y se mezcla bien. No esterilizar en autoclave. Esterilizar la solución colesterol usando una jeringa de 50 ml con un filtro de jeringa de 0,45 micras. También se eliminará cualquier colesterol no disuelto. </li><li> (Opcional) Preparar 10 ml de una 150 mM de 2&#39;-desoxi-5-fluorouridina (FUdR) stock. En un tubo cónico de 15 ml, mezclar 0,3693 gde FUdR y 10 ml de agua destilada. Agitar bien. </li></ol> 2. Preparar Cultura de las bacterias para NGT-3D y 3D-NGB <ol><li> Inocular 10 ml de caldo LB con bacterias. Las bacterias habituales utilizados para la alimentación de C. elegans es E. coli cepa OP50. </li><li> Cultura de la inoculación de bacterias a 37 ° C en una incubadora con agitación durante la noche. </li><li> En la preparación para una dilución en serie, alícuotas 9 ml de la solución de NaCl en 15 ml tubos cónicos estériles. Por ejemplo, parte alícuota de 9 ml en un total de 7 tubos para hacer una dilución 10 -7 de la cepa OP50 E. coli. </li><li> Usando una pipeta estéril 1,000 l, pipetear 1 ml de cultivo bacteriano o un cultivo bacteriano diluido en el nuevo tubo estéril con 9 ml de solución de NaCl y agitar bien la mezcla de 10 ml. Repita hasta que se alcanza la dilución bacteriana deseada. NOTA: La dilución bacteriana deseada depende del tipo y condición de bacterias, así como las condiciones experimentales exactas.Por ejemplo, un 10 -6 - dilución de la cepa de E. coli OP50 10 -8 era suficiente para producir a partir de 1 - 200 colonias por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms fiable desarrollan y se reproducen normalmente cuando el número de colonias era más de 60, que se produjo a una dilución de 10 -6-10 -7. Para NGB-3D, utilizar una dilución de 10 -8. </li></ol> 3. Hacer NGT-3D y 3D-NGB (200 ml) <ol><li> Después de la preparación del cultivo bacteriano, la mezcla 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, y 0,5 g de peptona en un matraz de 500 ml. Insertar una barra de agitación magnética en el matraz. </li><li> Añadir 195 ml de agua destilada y cubrir la boca del matraz con papel de aluminio. </li><li> Autoclave 121 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar el matraz en autoclave caliente sobre una placa de agitación, y se agita a una velocidad moderada durante al menos 2 horas. Se enfría el matraz a 40 ° C. Asegúrese de que se enfríe lo suficiente como para continuar de aquí a altas temperaturas puede dar lugar a pérdida de transparencia del agar acabado.Sin embargo, temperaturas más bajas pueden resultar en el endurecimiento prematuro de la agar. <ol><li> (Opcional) Para acelerar el proceso de enfriamiento, colocar el matraz en un baño de agua a 40 ° C 15 min antes de colocar sobre una placa de agitación. </li></ol></li><li> Cuando la temperatura de los medios de agar alcanza 40 ° C, añadir 200 l 1 M CaCl 2, 200 l de solución de colesterol 5 mg / ml, 200 l 1 M MgSO 4 y 5 ml 1 M KPO 4 tampón como la solución sigue agitar a concentraciones finales de 1 mM CaCl colesterol 2, 5 mg / ml, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4. <ol><li> (Opcional) Para el ensayo de vida útil NGT-3D añaden 80 l de FUdR 150 mM a una concentración final de 120 mM 12. </li></ol></li><li> Añadir 6 ml de los 10 ml de cultivo bacteriano diluido a partir del paso 2.4 en el matraz directamente. <ol><li> (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de medio de agar antes del paso 3.6 y mantenerlo caliente por separado. Este medio se utiliza para los libre de bacteriascapa superior. </li></ol></li><li> El uso de procedimientos estériles, prescindir de los medios de comunicación en una cámara de cultivo estéril. Asegúrese de que la cubierta de la cámara se cierra herméticamente. <ol><li> (Opcional) Para prevenir la formación de colonias de bacterias de la superficie superior de la agar, hacer una capa de libre de bacterias medios de agar de la etapa 3.6.1 en la parte superior antes de los medios de comunicación desde el paso 3.7 se endurece por completo. Esto creará una zona libre de bacterias en la parte superior de la NGT-3D. </li><li> Para NGT-3D, verter 6,5 ml de medio a los 8 ml tubos de ensayo de plástico transparente para hacer una capa de agar bacterias, y dispensar cuidadosamente 200 l de los medios de comunicación libre de bacterias en la parte superior de los medios de comunicación semi-endurecido 3D para hacer una fina bacterias- capa libre en la parte superior. </li><li> Para NGB-3D, verter 65 ml de medio a los 25 cm de botella de cultivo de células de plástico transparente 2. Esta cantidad debe llenar el cuerpo de la 25 cm botella de cultivo 2 celular. </li></ol></li><li> Deja cámaras verticalmente a temperatura ambiente durante una semana para permitir que las colonias bacterianas que crecena un tamaño considerable de al menos 1 mm de diámetro. <ol><li> (Opcional) Para el ensayo de vida útil en NGT-3D, cámaras de cubierta con papel de aluminio para evitar la degradación de la luz de FUdR. </li></ol></li></ol> 4. Medir la aptitud de la población de gusanos en NGT-3D (Cría relativa Ensayo de tamaño) <ol><li> Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recogida y traslado en una placa de NGM sin bacterias. Permitir que el gusano se mueva libremente alrededor de unos pocos minutos para eliminar bacterias adheridas a su cuerpo. </li><li> Repita el paso 4.1 y asegúrese de que el gusano está libre de bacterias. En general, dos repeticiones de 4.1 son suficientes. </li><li> Con cuidado, coloque el gusano limpia en la superficie de los medios de comunicación en 3D con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D. </li><li> Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, pero evitando el secado de los medios de agar. </li><li> Incubar durante 96 horas a 20 ° C. </li><li> Después de 4 días, cerrar las tapas firmemente y coloque lacámara de cultivo NGT-3D en un baño de agua a 88 ° para fundir el agar. El calor mata los gusanos pero sus cuerpos permanecen intactos. NOTA: El uso de tubos de 8 ml de NGT-3D, 20 - 30 min de incubación suele ser suficiente. </li><li> Usando una pipeta de vidrio, transferir los medios fundidos en un 9 cm placa petri de plástico. No se recomiendan pipetas de plástico, como los gusanos pueden a menudo se adhieren a ellos. </li><li> El uso de un microscopio de disección estéreo de transmisión, contar el número de gusanos en la L3, L4 y etapas adultas. No contar los gusanos que son L2 escenario y más joven, ya que las generaciones F1 y F2 se pueden confundir aquí. Por lo tanto, este ensayo es un ensayo de tamaño de la camada relativa en lugar de un total de ensayo tamaño de la camada. </li></ol> 5. Imagen y comportamiento de estos animales en el Registro NGB-3D <ol><li> Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recoger y eliminar las bacterias adheridas a la superficie mediante la transferencia a una placa de NGM sin bacterias y permitiendo que se mueva libremente durante unos minutos. </li><li> Repita el paso 5.1 para asegurarse de que el worm está libre de bacterias. </li><li> Colocar con cuidado el gusano limpio en el centro de la superficie de agar de la NGB-3D cerca del cuello de la botella con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D. </li><li> Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, al tiempo que evita el secado de los medios de agar. </li><li> Imagen o grabar el gusano bajo un microscopio de disección estéreo de transmisión. Ajuste el enfoque como el gusano se mueve a través de la matriz 3D. </li></ol>

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<li>Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+C.+elegans+behavioral+genetics+in+3-D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments.</a> Sci Rep. 5, 9564(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El cultivo de laboratorio de C. elegans usando las placas de medio de crecimiento de nematodos clásicos fue crucial para los cientos de descubrimientos importantes que la investigación en C. elegans ha proporcionado. A continuación, presentamos nuevos métodos para cultivar C. elegans en un entorno que refleja con mayor precisión sus hábitats naturales tridimensionales. Aunque otros métodos se han utilizado para observar C. elegans en 3D 13, este es el primer protocolo que p...

El estudio del nematodo Caenorhabditis elegans en el laboratorio ha llevado a descubrimientos seminales en el campo de la biología durante las últimas cinco décadas1. C. elegans fue el primer organismo multicelular en tener su genoma secuenciado en 19982, y ha sido invaluable para comprender las contribuciones de los genes individuales al desarrollo, la fisiología y el comportamiento de un organismo completo. Los científicos ahora están tratando de comprender mejor cómo estos genes pueden contribuir a la supervivencia y la aptitud reproductiva de los organismos en sus entornos naturales, haciendo preguntas sobre ecología y evolucióna nivel genético. 
C. elegans una vez más puede proporcionar un excelente sistema para responder a estas preguntas. Sin embargo, se sabe poco sobre la biología de C. elegans en hábitats naturales de nematodos, y no existen métodos actuales para simular las condiciones naturales controladas de C. elegans en el laboratorio. En el laboratorio, C. elegans se cultiva en la superficie de placas de agar sembradas con la bacteria E. coli 6. En la naturaleza, sin embargo, C. elegans y los nematodos relacionados se pueden encontrar escasamente habitando en suelos de todo el mundo, pero se encuentran específicamente prosperando en frutas podridas y materia vegetal7,8. Estos entornos complejos tridimensionales (3D) son bastante diferentes de los entornos 2D simples a los que se exponen los gusanos en el laboratorio. 
Para comenzar a responder preguntas sobre la biología de los nematodos en un entorno 3D más natural, hemos diseñado un hábitat 3D para el cultivo de nematodos en laboratorio al que llamamos Nematodos Growth Tube 3D o NGT-3D para abreviar9. El objetivo era diseñar un sistema de crecimiento en 3D que permitiera un crecimiento, desarrollo y fertilidad comparables a las placas estándar de los medios de crecimiento de nematodos (NGM)en 2D 10. Este sistema apoya el crecimiento de bacterias y nematodos durante todo su ciclo de vida en 3D, permite que los gusanos se muevan y se comporten libremente en tres dimensiones, y es fácil y económico de fabricar y emplear. 
En el estudio actual, proporcionamos un método paso a paso para fabricar NGT-3D y evaluar el desarrollo y la fertilidad de los gusanos. Además de evaluar la aptitud de los gusanos en 3D, buscamos obtener imágenes, videos y evaluar el comportamiento y la fisiología de los gusanos en el cultivo en 3D. Así, además de NGT-3D, presentamos aquí un método alternativo llamado Nematodo Growth Bottle 3D o NGB-3D, para la obtención de imágenes microscópicas de C. elegans durante el cultivo en 3D. Esto será especialmente importante para el estudio de los comportamientos conocidos identificados en 2D, y la identificación de nuevos comportamientos exclusivos del cultivo en 3D.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>224620</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>DAEJUNG</td><td>7548-4400</td><td>58.44 MW</td></tr><tr><td>Agar, Granulado</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio, dihidratado</td><td>Bio Basic</td><td>CD0050</td><td>2*H2O; 147.02 MW</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Bio Básico</td><td>CD0122</td><td>386.67 MW</td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>B& J</td><td>RP090-1</td><td>99,99%; 46,07 MW</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio, anhidro</td><td>Bio Basic</td><td>MN1988</td><td>120,37 MW</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico, anhidro</td><td>Bio Basic</td><td>PB0445</td><td>136,09 MW</td></tr><tr><td>2'-Desoxi-5-fluorouridina</td><td>Tokio Industria Química</td><td>D2235</td><td>246,19 MW</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, dibásico, anhidro</td><td>Bio Basic</td><td>PB0447</td><td>174,18 MW</td></tr><tr><td>Tubos de ensayo multiusos</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8570</td><td>Cierres</td></tr><tr><td>de tubos de ensayo de</td> 8 ml <td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8575</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular</td><td>SPL Lifescience</td><td>70125</td><td>25 cm2</td></tr><tr><td>Research Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de cámara en color de alta definición</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de control basada en PC</td><td>Nikon</td><td>DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Investigación básica, software de imagen de microscopio</td><td>Nikon</td><td>MQS32000</td><td></td></tr></tbody></table>

el cultivo de<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; en tres dimensiones en el laboratorio

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

El uso de organismos modelo genéticos como Caenorhabditis elegans ha llevado a descubrimientos seminales en biología durante las últimas cinco décadas. La mayor parte de lo que sabemos sobre C. elegans se limita al cultivo en laboratorio de los nematodos, que puede no reflejar necesariamente los entornos en los que normalmente habitan en la naturaleza. El cultivo de C. elegans en un hábitat 3D que es más similar a la matriz 3D que los gusanos encuentran en frutas podridas y compost vegetativo en la naturaleza podría revelar nuevos fenotipos y comportamientos que no se observan en 2D. Además, los experimentos en 3D pueden abordar cómo los fenotipos que observamos en 2D son relevantes para el gusano en la naturaleza. Aquí, se presenta un nuevo método en el que C. elegans crece y se reproduce normalmente en tres dimensiones. El cultivo de C. elegans en el tubo de crecimiento de nematodos-3D (NGT-3D) puede permitirnos medir la aptitud reproductiva de las cepas de C. elegans o diferentes condiciones en un entorno 3D. También presentamos un método novedoso, denominado Nematodo Growth Bottle-3D (NGB-3D), para cultivar C. elegans en 3D para su análisis microscópico. Estos métodos permiten a los científicos estudiar la biología de C. elegans en condiciones que reflejan mejor los entornos que encuentran en la naturaleza. Estos pueden ayudarnos a comprender la relevancia evolutiva subyacente de la fisiología y el comportamiento de C. elegans que observamos en el laboratorio.

La construcción de NGT-3D es un protocolo simple y directo que resulta en un tubo de ensayo de agar-llena de pequeñas colonias bacterianas espaciados en todo el agar (Figura 1A). Los gusanos pueden moverse libremente a través de la matriz de agar, la búsqueda y el consumo de las colonias bacterianas. Para confirmar si C. elegans pueden reproducirse y crecer normalmente en NGT-3D, se comparó la fertilidad y el desarrollo de las larvas en 3D con placas estándar 2D...

Se presenta un método sencillo de construir sistemas de cultivo de nematodos 3D llamados NGT-3D y NGB-3D. Éstos se pueden utilizar para estudiar la aptitud de los nematodos y los comportamientos en los hábitats que son más similares a los naturales Caenorhabditis elegans hábitats que las placas de cultivo estándar en 2D elegans C. laboratorio.

El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar un sistema de cultivo tridimensional para nematodos que pueda simular mejor las condiciones naturales. Este método puede responder a preguntas clave en el campo del desarrollo, la fisiología y el comportamiento de C. elegans. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando estábamos estudiando el comportamiento natural de los nematodos en la fruta en descomposición, que es un entorno 3D.Esta técnica es una ventaja en comparación con las técnicas de cultivo bidimensional estándar porque los nematodos residen en hábitats 3D en la naturaleza. Aunque este método se ha desarrollado en el cultivo de C. elegans, también se puede aplicar a otros nematodos. Para demostrar este procedimiento estará Tong Young Lee, un estudiante graduado en mi laboratorio.Para comenzar este procedimiento, Otto Clave las soluciones preparadas a 121 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, prepare 50 mililitros de la solución estéril de colesterol a 5 miligramos por mililitro. En un tubo cónico de 50 mililitros, agregue 0,25 gramos de colesterol y 50 mililitros de etanol al 99,99% y mezcle bien.A continuación, esterilice la solución de co

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Fuente: Petersen, C. et al., Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra el aislamiento y cultivo de especies bacterianas asociadas a Caenorhabditis elegans. Una lisis basada en perlas de C. elegans, seguida de un cultivo selectivo, permite aislar diversas cepas microbianas para su análisis posterior.

Aislamiento y cultivo de Caenorhabditis elegans - Bacterias asociadas

Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elegans células cultivadas.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.

El cultivo Caenorhabditis elegans En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans

El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Los microcosmos de compost llevan la diversidad microbiana que se encuentra en la naturaleza al laboratorio para facilitar la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans. Aquí se proporcionan protocolos para establecer experimentos de microcosmos, y los experimentos demuestran la capacidad de modular la diversidad microbiana ambiental para explorar las relaciones entre la diversidad microbiana ambiental y la composición del microbioma intestinal del gusano.

Microcosmos de compost como entornos microbianamente diversos y naturales para la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans

Aquí se presenta un protocolo optimizado para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos en dispositivos microfabricados de múltiples pocillos. Este enfoque permite que los animales individuales sean monitoreados a lo largo de sus vidas para una variedad de fenotipos relacionados con el envejecimiento y la salud, incluida la actividad, el tamaño y la forma del cuerpo, la geometría del movimiento y la supervivencia.

Cultivo a largo plazo y monitorización de Caenorhabditis elegans aislada en medios sólidos en dispositivos multipocillos

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos para el seguimiento de parámetros fisiológicos de por vida y la cuantificación de fluorescencia. Este sistema de cultivo incluye una barrera de ácido palmítico alrededor de pozos de un solo gusano para evitar que los animales huyan, lo que permite el uso de intervenciones aversivas, incluidas bacterias patógenas y estresores químicos.

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

Aprende a cultivar Caenorhabditis elegans en sistemas tridimensionales que simulan hábitats naturales. Este método mejora el estudio del comportamiento y la fisiología de nematodos en condiciones más realistas que los cultivos bidimensionales convencionales.

El cultivo de

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