El cultivo de Caenorhabditis elegans En tres dimensiones en el Laboratorio

El objetivo general de este procedimiento es fabricar un sistema de cultivo tridimensional para nematodos que pueda simular mejor las condiciones naturales. Este método puede responder a preguntas clave en el campo del desarrollo, la fisiología y el comportamiento de C. elegans. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando estábamos estudiando el comportamiento natural de los nematodos en la fruta en descomposición, que es un entorno 3D.

Esta técnica es una ventaja en comparación con las técnicas de cultivo bidimensional estándar porque los nematodos residen en hábitats 3D en la naturaleza. Aunque este método se ha desarrollado en el cultivo de C. elegans, también se puede aplicar a otros nematodos. Para demostrar este procedimiento estará Tong Young Lee, un estudiante graduado en mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, Otto Clave las soluciones preparadas a 121 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, prepare 50 mililitros de la solución estéril de colesterol a 5 miligramos por mililitro. En un tubo cónico de 50 mililitros, agregue 0,25 gramos de colesterol y 50 mililitros de etanol al 99,99% y mezcle bien.

A continuación, esterilice la solución de colesterol con una jeringa de 50 mililitros con un filtro de jeringa ventilado de 0,45 y elimine el colesterol no desarrollado. Luego, inocula 10 mililitros de caldo de lisogénia con bacterias. Cultive la inoculación bacteriana a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora durante la noche.

En preparación para una dilución en serie, asigne nueve mililitros de la solución de cloruro de sodio en siete tubos cónicos estériles de 15 mililitros. Para hacer una carpa de la dilución del séptimo pliegue de Opi 50 Cepa E Coli. Luego, saque un mililitro del cultivo bacteriano o el cultivo bacteriano diluido en un tubo nuevo con nueve mililitros de solución de cloruro de sodio.

Y vórtice bien la mezcla. Después de preparar el cultivo bacteriano, agregue 0,6 gramos de cloruro de sodio, un gramo de barrena granulada y 0,5 gramos de peptona en un matraz de 500 mililitros. Coloque una barra magnética para agitar en el matraz.

Luego agregue 195 mililitros de agua destilada y cubra el matraz con papel de aluminio. A continuación, Otto Clave la muestra a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Posteriormente, coloque el matraz Otto Claved caliente en una placa de agitación, revuelva a velocidad moderada durante al menos dos horas hasta que alcance los 40 grados centígrados.

Alternativamente, el matraz se puede enfriar a 40 grados centígrados colocándolo en un baño de agua a 40 grados centígrados durante 15 minutos antes de transferirlo a una placa de agitación. Asegúrese de enfriar lo suficiente como para continuar desde aquí. Una temperatura alta puede provocar la oscurecimiento de la barrena terminada, pero una temperatura demasiado baja puede provocar un endurecimiento prematuro de la barrena.

Cuando la temperatura del medio de la barrena alcance los 40 grados centígrados, agregue cloruro de calcio, solución de colesterol, sulfato de magnesio y tampón de fosfato de potasio y continúe revolviendo la solución. Para el ensayo de vida útil NGT-3D, agregue 80 microlitros de FUDR de 150 milímetros al medio para obtener una concentración final de 120 micromolares. Luego, retire seis mililitros de medio de barrena en un tubo cónico estéril y manténgalo caliente en una incubadora.

Este medio se utilizará para la capa superior libre de bacterias. A continuación, añada seis mililitros del cultivo de bacterias diluidas en el matraz directamente sobre un banco esterilizado. Para NGT-3D, vierta 6,5 mililitros de medio en los tubos de ensayo de plástico transparente de ocho mililitros para formar una capa de barrena para bacterias.

Y dispense con cuidado 200 microlitros de medios libres de bacterias encima de los medios 3D semiduros para hacer una capa delgada libre de bacterias en la parte superior. A continuación, cierre bien la tapa de la cámara. Para NGB-3D, vierta 65 mililitros de medio en una botella de cultivo celular de plástico transparente de 25 centímetros cuadrados.

A continuación, coloque la cámara verticalmente a temperatura ambiente durante una semana para permitir que las colonias bacterianas crezcan hasta alcanzar un tamaño considerable de al menos un milímetro de diámetro. En este procedimiento, elija un gusano L de cuatro etapas y transfiéralo a una placa NGM libre de bacterias. Luego, deja que el gusano se mueva libremente durante unos minutos para eliminar las bacterias de su cuerpo.

Y repita el procedimiento dos veces más. Después, coloque con cuidado el gusano limpio sobre la superficie del medio 3D. El tornillo sin fin debería haber entrado en la matriz de la barrena 3D.

A continuación, cierre la tapa sin apretar para incubar durante 96 horas a 20 grados centígrados. Después de cuatro días, cierre bien la tapa y coloque la cámara de cultivo NGT-3D en un baño de agua a 88 grados centígrados para derretir la barrena. Con una pipeta de vidrio, transfiera el medio derretido a una placa de Petri de plástico de nueve centímetros.

A continuación, utilizando un microscopio de disección estereoscópica de transmisión, se cuenta el número de gusanos en las etapas L3, L4 y adulta. Como se muestra aquí, la construcción de NGT-3D es un protocolo simple y directo que da como resultado un tubo de ensayo lleno de barrena con pequeñas colonias bacterianas espaciadas a lo largo de la barrena. Para confirmar si C. elegans puede reducirse y crecer normalmente en NGT-3D, la fertilidad y el desarrollo de las larvas se comparan en 3D con las placas NGM 2D estándar.

En el ensayo de tamaño relativo de la cría, los hermafroditas adultos de C. elegans en NGT-3D se reprodujeron tan bien como los hermafroditas en las placas MGM 2D estándar cuando las colonias bacterianas son abundantes con al menos 60 colonias. Además, el desarrollo de las larvas en NGT-3D también se desarrolla normalmente cuando hay muchas colonias bacterianas y la mayoría de los gusanos están en estado adulto después de 96 horas. Sin embargo, si las colonias bacterianas son escasas en la matriz 3D, tanto el tamaño relativo de la cría como el desarrollo de las larvas se ven afectados negativamente.

Aquí hay una curva de supervivencia de los elegans de tipo salvaje C elegans en placas NGT-3D o NGM. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de esperanza de vida y el análisis del comportamiento, para responder a preguntas sobre el envejecimiento y el comportamiento en 3D.

Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en los campos de la genética exploren preguntas sobre la ecología y la evolución en C. elegans. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar nematodos en un entorno de laboratorio 3D.