Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina

El objetivo general de este método es evaluar la integridad del ADN libre de células de la orina en secuencias específicas de oncogenes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer urológico, como el diagnóstico temprano no invasivo del cáncer de vejiga y próstata. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de hacer y analizar.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de las neoplasias urológicas malignas, ya que normalmente liberan células y ácidos nucleicos libres en la orina. Aunque este método puede proporcionar información sobre las muestras de orina, también se puede aplicar a otros sistemas como el suero o el plasma. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque la concentración de ADN libre de células en la orina suele ser baja.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentamos encontrar un método sencillo para la detección temprana no invasiva del cáncer de vejiga. Para comenzar el procedimiento, obtenga una muestra de orina de 50 mililitros de captura limpia de la primera mañana que se haya almacenado a cuatro grados centígrados durante no más de tres horas. Invierta la muestra dos veces y luego divida la muestra en dos tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros.

Centrifugar la muestra a 850 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, para cada tubo, transfiera 10 mililitros de la parte superior del sobrenadante a dos tubos de cinco mililitros, dejando al menos dos mililitros de sobrenadante por encima del pellet. Deseche los gránulos y almacene el sobrenadante a menos 80 grados centígrados.

Repita este proceso para obtener muestras de orina adicionales según sea necesario. Para comenzar la purificación del ADN, para cada muestra se descongela una alícuota de sobrenadante de orina. Agite la muestra descongelada e invierta el tubo dos veces.

Coloque un mililitro de la muestra en un tubo de cinco mililitros y almacene el resto a menos 80 grados centígrados. Prepare un kit de purificación de ADN adecuado para muestras de orina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir 100 microlitros de proteinasa K y un mililitro de tampón de lisis a la muestra y mezclar bien con una pipeta.

Incubar la muestra a 56 grados centígrados durante 15 minutos. Durante la incubación, prepare los tampones de lavado en una columna de centrifugado. Después de la incubación, deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente y luego agregue un mililitro de etanol absoluto y mezcle bien mediante pipeteo.

Transfiera 650 microlitros de la muestra a la columna. Centrífuga a 6000 veces G durante un minuto. Vuelva a colocar el tubo de recolección y repita este proceso hasta que toda la muestra se haya cargado en la columna.

A continuación, añada 500 microlitros del primer tampón de lavado y centrifugar la columna a 6000 veces G durante un minuto. Reemplace el tubo de recolección, agregue 500 microlitros del segundo tampón de lavado y centrifugue la columna a velocidad máxima durante tres minutos. Coloque la columna en un tubo de recolección limpio y centrifugue a velocidad máxima durante otros tres minutos para eliminar el tampón de lavado residual.

Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Cargue 50 microlitros de tampón de elución en la columna y deje que el tampón penetre en la columna durante siete minutos. A continuación, centrifugar la columna a 6000 veces G durante un minuto.

Pipetear el eluido de nuevo en la columna y centrifugar la columna a máxima velocidad durante un minuto para obtener el ADN libre de células de orina. Para comenzar a preparar los estándares, primero aísle el ADN de una línea celular apropiada utilizando un kit de purificación. Cuantifique el ADN de cada muestra de orina purificada en la línea celular con un espectrofotómetro según las instrucciones del fabricante del kit.

Diluya el ADN UCF a un nanogramo por microlitro y almacene las muestras diluidas a menos 20 grados Celsius hasta que estén listas para la prueba de integridad. Diluya el ADN de la línea celular para crear seis estándares de 100 microlitros de diferentes concentraciones. Almacene los estándares a menos 20 grados centígrados.

Para comenzar la prueba de integridad del ADN, descongele las muestras de ADN de UCF, los estándares, los cebadores de PCR apropiados y la supermezcla verde en hielo. A continuación, configure la placa de disco del rotor de 72 pocillos con tubos de tira. Coloque dos alícuotas de 10 microlitros de estándar y luego cada muestra en pocillos.

Preparar dos pocillos de 10 microlitros de agua libre de RNasa como controles negativos. Para cada pocillo lleno, prepare una mezcla de un microlitro de cada cebador, 12,5 microlitros de supermezcla verde y 6,5 microlitros de agua libre de RNasa. Transfiera 15 microlitros de la mezcla a cada pocillo lleno y luego transfiera los pocillos a un disco de rotor de 72 pocillos.

Realice la PCR con un instrumento en tiempo real de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Con el software del instrumento, compruebe si alguna réplica tiene una diferencia de valor de umbral de ciclo de uno o más. Deseche esas muestras del análisis y evalúe el umbral de ciclo medio para las muestras restantes.

Realice un análisis de fusión en cada muestra con un valor umbral de ciclo medio de 36 o menos para evaluar la especificidad del producto de PCR. A continuación, utilice la curva estándar para determinar una concentración en nanogramos por microlitro para cada aplico. Se aisló ADN libre de células en orina y se evaluó la integridad del ADN en cuatro regiones que muestran un mayor número de copias de ADN en tumores sólidos.

También se evaluó una secuencia de control para verificar que la cantidad de ADN en cada muestra era suficiente para la prueba de integridad. Se calculó la concentración total de ADN libre y los coeficientes de variación para cada gen. Este método muestra una sensibilidad del 73% y una especificidad del 84% para detectar el cáncer de vejiga, pero solo del 58% de sensibilidad y del 44% de especificidad para el cáncer de próstata.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día hábil si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR digital o la secuenciación de nueva generación para responder a preguntas adicionales como el inductor del número de copias de los genes de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el ADN libre de células de la orina de una manera muy simple, y cómo estudiar la integridad de regiones específicas de interés utilizando enfoques de PCR en tiempo real.