Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

El objetivo general de este procedimiento es aislar la matriz extracelular de las células cultivadas para una amplia variedad de experimentos posteriores, para ayudar a comprender las funciones y propiedades de la matriz extracelular en tejidos normales y procesos de enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la matriz extracelular, como la organización, la composición molecular, las interacciones proteicas o las propiedades funcionales de la matriz extracelular. Además, la matriz extracelular podría prepararse a partir de cualquier tipo de célula adherente.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden llevar a cabo en diferentes escalas para eliminar células de manera eficiente y retener proteínas de la matriz extracelular. Silvia Rosini, estudiante de posgrado en mi laboratorio, y Andrew Hellewell, investigador postdoctoral, demostrarán el procedimiento. Para empezar, las células de placa en los cubreobjetos para la obtención de imágenes de células vivas y la matriz extracelular o MEC.

Para estudios de microscopía de florescencia, un ECM fijo. O para la preparación de MEC derivada de células para estudios funcionales a pequeña escala. Incubar las células a una temperatura y humedad adecuadas durante un tiempo adecuado para que las células depositen ECM.

Por lo general, más de 16 horas. En una campana extractora, prepare 20 milimolares de hidróxido de amonio en un recipiente adecuado utilizando agua desionizada para diluir la solución madre de uno a 14. Retire las células de la incubadora y retire suavemente el medio de cultivo.

A continuación, añada el PBS sin calcio ni magnesio vertiendo suavemente contra la pared del plato. Agita el plato dos veces y vierte el líquido. Luego repita el lavado dos veces más.

En la campana extractora, retire el último lavado de PBS, agregue 1,5 mililitros de hidróxido de amonio por plato de 60 milímetros e incube las placas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Agite suavemente los platos cada minuto para asegurar la lisis de todas las células. A continuación, agregue grandes cantidades de agua desionizada a cada plato y agite el plato.

Luego vierta el material solubilizado con hidróxido de amonio, que está compuesto por hidróxido de amonio, células lisadas y agua desionizada. Lave la capa insoluble de ECM en grandes cantidades de agua desionizada cuatro veces más, para asegurar la eliminación completa de todo el material solubilizado con hidróxido de amonio. Es esencial que las células se eliminen por completo con abundantes lavados en agua desionizada.

Si estos pasos no se realizan adecuadamente, el material celular puede permanecer en el plato y contaminar el análisis posterior. Para el examen de la MEC por inmunofluorescencia, retire el agua desionizada restante, fije la MEC añadiendo un 2% de paraformaldehído, PFA abreviado, e incube las placas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilice PBS para lavar cada muestra fija dos veces y desechar la solución en un contenedor de residuos líquidos antes de realizar la microscopía de fluorescencia de acuerdo con el protocolo de texto.

En una campana de flujo laminar, prepare soluciones estériles de PBS sin calcio y magnesio, hidróxido de amonio de 20 milimolares y agua desionizada pasando cada solución a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros a un recipiente estéril apropiado. Mientras mantiene la técnica estéril, use PBS estéril para lavar suavemente las células productoras de la matriz en los cubreobjetos tres veces. Después de retirar el lavado final de PBS, agregue 1,5 mililitros de hidróxido de amonio estéril a la placa de 60 milímetros e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos con balanceo intermitente.

Agregue grandes cantidades de agua desionizada estéril al plato con mecedora, vierta el lisado celular en un contenedor de desechos apropiado. Repita este lavado cuatro veces más para asegurar la eliminación completa del material solubilizado. Después de intentar tripsinizar y peletizar las células de acuerdo con el protocolo de texto, vuelva a suspender las células de prueba en un medio estéril fresco y use un hemocitómetro para contar las células.

A continuación, coloque el número adecuado de células de prueba y medio de cultivo en el ECM aislado estéril en cubreobjetos e incube durante dos o tres horas o durante el tiempo necesario. Para examinar la organización del citoesqueleto de actina, fije las células de prueba en PFA al 2% y téñalas con FITC-Phalloidin para visualizar la F-actina y DAPI para visualizar los núcleos. Después de cultivar un gran número de células, retirar las células y lavar el ECM como se demostró anteriormente en el vídeo, incline cada placa en ángulo para drenar el agua residual hasta el fondo de la placa y utilice una pipeta P200 para eliminar con cuidado el agua restante hasta que la placa esté completamente seca.

Al mismo tiempo, caliente el tampón de muestra SDS-PAGE que contiene 100 milimolares de DDT a 95 grados centígrados durante dos minutos, y agregue 200 microlitros a cada placa de 100 milímetros para ser examinada por inmunotransferencia. Use un raspador de células para recoger la muestra a un lado de la placa y use una punta de pipeta de 200 microlitros para transferirla a un tubo. Para analizar el ECM por espectrometría de masas, prepare una muestra más concentrada recogiendo el tampón de muestra SDS-PAGE de la placa, recalentándolo a 95 grados Celsius y utilizando la misma alícuota en dos o tres placas adicionales.

Transfiera cualquier extracto tampón de muestra SDS-PAGE residual de la punta del raspador celular al tubo para minimizar la pérdida de material ECM. Para una extracción eficaz del ECM aislado en el tampón de muestra SDS-PAGE, es esencial que el tampón de muestra se caliente a 95 grados, contenga un agente reductor y que la placa se raspe ampliamente. Aquí se muestran células COS-7 cultivadas en cubreobjetos de vidrio.

El tratamiento con hidróxido de amonio eliminó las células de manera efectiva, según lo establecido por la pérdida de los núcleos celulares y el citoesqueleto de actina. En esta figura, las células COS-7 se transfectaron con trombospondina-1 con la etiqueta RFP. Y se visualizó el ECM antes y después del tratamiento con hidróxido de amonio.

Se infiere que los puntos fluorescentes identificados en ambas imágenes están asociados con la MEC. En este experimento, los fibroblastos dérmicos humanos se extrajeron con hidróxido de amonio y la MEC se probó con el anticuerpo anticolágeno 1, que demostró un patrón de tinción característico del peroné y la malla. Como se muestra aquí, la tinción de fibronectina se llevó a cabo en la MEC a partir de células de condrosarcoma de rata extraídas con hidróxido de amonio.

En este ejemplo, las células COS-7 de prueba se sembraron durante dos horas en una MEC estéril producida por células RCS y se analizó la organización de la F-actina mediante tinción con FITC-Phalloidin. En comparación con las células COS-7 que producen su propia ECM. En este experimento, la MEC se aisló de células de condrosarcoma de rata y las proteínas derivadas de la MEC se separaron mediante SDS-PAGE.

Y las cuatro bandas principales fueron aisladas y analizadas por espectrometría de masas. Se identificaron fibronectina, trombospondina-1 y cinco, y matrilina-1. Finalmente, se analizó la MEC endógena de fibroblastos dérmicos humanos mediante inmunotransferencia.

Se detectaron fibronectina y trombospondina-1, mientras que las proteínas intracelulares alfa-tubulina y beta-actina estaban ausentes. Una vez dominado, la extracción de células con hidróxido de amonio y la extracción de ECM con tampón de muestra SDS-PAGE caliente de tres placas de 100 milímetros se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar hacer soluciones de trabajo de hidróxido de amonio nuevas cada vez para eliminar las células.

También es muy importante utilizar lavados abundantes con agua desionizada para asegurarse de eliminar todas las células. Siguiendo este procedimiento se encuentran los métodos como el análisis proteómico de la ECM extraída con el fin de responder a preguntas adicionales como la abundancia relativa de proteínas de la ECM producidas por diferentes tipos de células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo eliminar células de manera eficiente de las placas de cultivo celular y cómo extraer ECM.

No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana extractora y usar equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.