Name: El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende a confirmar la identidad de TMEM184A como receptor de heparina en células vasculares mediante un constructo etiquetado con GFP. Este método permite la identificación funcional de genes huérfanos.

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La investigación en el laboratorio de Lowe-Krentz está respaldada por HL54269 de becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud a LLK.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
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<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
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<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos divulgados aquí fueron diseñados para proporcionar evidencia confirmatoria para la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina en las células vasculares 1. técnicas desmontables se utilizan habitualmente como un mecanismo para confirmar la identificación de nuevas proteínas. Sin embargo, una cierta pérdida funcional después de la caída no suele ser suficiente prueba de que una proteína candidata es en realidad el receptor correcto (u otra proteína funcional). También es...

Identificación de proteínas candidatas para nuevas funciones a menudo depende de protocolos de aislamiento basados ​​en afinidad seguido por determinación de la secuencia parcial. Ejemplos recientes de proteínas recientemente identificados incluyen la proteína transmembrana 184A (TMEM184A), un receptor de heparina identificado después de interacciones de afinidad de heparina 1, y TgPH1, una proteína de dominio de homología pleckstrin que se une PI phosphoinositide (3,5) P 2 2. Otros novela identificación de proteínas implica el análisis de secuencia directa de péptidos como la que por Vit, et al. que se utiliza para identificar péptidos transmembrana productos proteicos de genes previamente caracterizados 3. Del mismo modo, la identificación de nuevas secuencias de proteínas se puede lograr usando la bioinformática en busca de familias de proteínas previamente caracterizadas, como la identificación de nuevas proteínas 4TM 4. El examen de las secuencias de genes de la familia de acuaporina tiene alasí producido la identificación de nuevos miembros con nuevas funciones 5. Después de la identificación, el análisis de la función de proteínas es típicamente un siguiente paso, que a veces puede ser examinada usando un ensayo específico de la función de proteínas, tales como en el caso de acuaporina. Cuando sea posible, la función de una proteína recientemente identificada puede ser examinado con enzimático específico o ensayos de la función similares in vitro. Debido a que muchas funciones de nuevas proteínas dependen de interacciones complejas que ocurren sólo en las células intactas o los organismos, en ensayos in vitro no siempre son eficaces. Sin embargo, los ensayos in vivo deben ser diseñados de tal manera que dependen de la secuencia del gen. En el cultivo de células y / o organismos modelo simples, desmontables puede aportar elementos de prueba para la identificación de proteínas / función 6. Con nuevas proteínas identificadas como se señaló anteriormente, a menudo es insuficiente para simplemente derribar una proteína para confirmar la función, unad el diseño de ensayos funcionales in vivo que dependen de la secuencia del gen se convierte en importante para la caracterización de nuevas proteínas. La reciente identificación de TMEM184A como un receptor de heparina (que modula la proliferación en el músculo liso vascular y las respuestas inflamatorias en las células endoteliales) utilizando cromatografía de afinidad y MALDI MS 1, 7 proporcionan una oportunidad para desarrollar una colección de ensayos después de caída produjeron resultados coherentes con la identificación . Una revisión reciente confirmó que la heparina interactúa específicamente con muchos factores de crecimiento, sus receptores, componentes de matriz extracelular, receptores de adhesión celular, y otras proteínas 8. En el sistema vascular, la heparina y proteoglicanos heparán sulfato (que contiene cadenas de heparán sulfato similares en estructura a la heparina) interactuar con varios cientos de proteínas 9. Para confirmar funcionalmente that TMEM184A estaba involucrado con la absorción de la heparina y vinculante, se han desarrollado técnicas que emplean para la construcción del gen TMEM184A. El presente informe incluye una colección de ensayos basados ​​en un GFP-TMEM184A construir para su uso en la confirmación de la identidad de TMEM184A como un receptor de heparina.

<table><tbody><tr><td>Construcción GFP-TMEM184A</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Fluoresceína-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Light Sensitive</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA, sin metanol)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, disponible a través de Fisher Scientific</td><td>PI28908 en Fisher</td><td>Uso en</td></tr><tr><td>placas de neutravidina reacti-bond (placas negras de 96 pocillos recubiertas de avidina)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, a través de Fisher Scientific</td><td>PI15510 en Fisher</td><td>Preste atención a la vida útil</td></tr><tr><td>Placas negras de 96 pocillos</td><td>Corning Life Sciences Plástico, comprado a través de Fisher Scientific 064432</td><td>en Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 célula de músculo liso vascular línea</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Se puede cambiar por MEM medio1</td></tr><tr><td>BAOEC células endoteliales aórticas bovinas</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>El cultivo recomendado inicialmente, se puede cambiar a medio MEM para un cultivo continuo1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC células de músculo liso aórtico bovino</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>El cultivo recomendado inicialmente, se puede cambiar a medio MEM para continuar el cultivo1</td></tr><tr><td>RAOEC células endoteliales aórticas de rata</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>El cultivo R304-05a</td><td>como se recomendó inicialmente, se puede cambiar a un medio MEM para un cultivo continuo7</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, a través de Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Perlas recubiertas de estreptavidina</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Disponible en Bio-Rad</td><td></td><td>Se puede preparar en el laboratorio. El pH es de 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A anticuerpo contra el N-terminal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>Solo conocido TMEM184A anticuerpo para la región N-terminal.</td></tr><tr><td>TMEM184A anticuerpo contra el C-terminal</td><td>Obtenido de ProSci Inc, Poway, CA&nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci utilizado en anticuerpos <fuerte>Figura 1</fuerte></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Utilizado en <fuerte>Figura 5</anticuerpos fuertes></td></tr><tr><td>secundarios, marcados con TRITC o Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (anti-conejo burro, TRITC) 715 165 150 (anti-ratón burro, Cy3)</td> <td>Mínima reactividad cruzada para minimizar cualquier tinción inespecífica.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Comprado en Sigma</td><td>C5849</td><td>Tenga en cuenta que este número de catálogo específico ha sido descontinuado. El proveedor proporcionará información sobre el reemplazo.</td></tr><tr><td>Imágenes en vivo Antenas de 35 mm</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta con lente de inmersión en aceite de 63X</td><td>Se utiliza para imágenes e imágenes en vivo en Figuras 1, 2 y 3</td></tr><tr><td>Confocal Microscopio</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal con una lente de inmersión en aceite de 60X</td><td>Se utiliza para imágenes en Figura 5</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>LSM 880 con lente de inmersión en aceite 63X</td><td>Se utiliza para imágenes en equipos de electroporación Figure 2C</td></tr><tr><td>Electroporation</td> Pulsador de genes <td>Bio-Rad</td> Sistema <td></td><td>X-Cell</td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación</td><td>disponibles en MidSci</td><td>EC2L</td><td>También se puede obtener del proveedor de equipos</td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg; m200 Pro </td><td>Lector de placas Lecturas en el centro de los pozos en lugar de en la superficie.</td></tr><tr><td>Programa informático para medir la intensidad de las manchas</td><td>Imagen J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Programa e información disponible en línea</td><td>Se puede utilizar cualquier programa apropiado. Consulte https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html para obtener más detalles&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de tripsina para cultivo celular</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>adquirida como solución 10x</td></tr></tbody></table>

el uso de un tmem184a gfp-etiquetados constructo para la confirmación de heparina receptor de identidad

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Cuando nuevas proteínas se identifican mediante el aislamiento y la bioinformática análisis basado en afinidad, que a menudo son en gran parte no caracterizado. Los anticuerpos contra péptidos específicos dentro de la secuencia predicha permiten algunos experimentos de localización. Sin embargo, otras posibles interacciones con los anticuerpos a menudo no pueden ser excluidas. Esta situación proporciona una oportunidad para desarrollar un conjunto de ensayos que dependen de la secuencia de la proteína. Específicamente, se obtuvo un constructo que contiene la secuencia del gen acoplado a la secuencia que codifica GFP en el extremo C-terminal de la proteína y emplea para estos fines. Los experimentos para caracterizar la localización, la afinidad del ligando, y la ganancia de la función se diseñaron y llevaron a cabo para confirmar la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina 1 en un principio. Además, el constructo se puede emplear para estudios relacionados con preguntas topología de la membrana y de las interacciones proteína-ligando detalladas. El presente informe se presenta arange de protocolos experimentales basados ​​en el constructo GFP-TMEM184A expresado en las células vasculares que podrían ser fácilmente adaptado para otras proteínas novedosas.

Mientras que, en teoría, la transfección de cualquier constructo de ADN en las células podría lograrse con reactivos de transfección lipófilos, los informes anteriores indican transfección más eficaz de GFP construcciones en células endoteliales utilizando electroporación 12. El protocolo aquí proporcionada típicamente logra GFP-construcción de expresión en más del 80% de las células endoteliales primarias derivadas de músculo liso y células utilizadas. Diseño del...

A TMEM184A construcción que codifica con una etiqueta GFP en el extremo carboxi-terminal diseñado para la expresión eucariótica, se empleó en ensayos diseñados para confirmar la identificación de TMEM184A como un receptor de heparina en las células vasculares.

El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

El objetivo general del uso de una construcción marcada con GFP es confirmar la identidad de una proteína previamente desconocida utilizando la GFP como identificador. Este método puede ayudar con la identificación funcional de genes huérfanos cuando una actividad enzimática específica no está disponible para su confirmación. La principal ventaja de esta técnica es que la etiqueta GPF permite utilizar el mismo constructo para varios tipos de experimentos.Generalmente, los individuos que son nuevos en este método pueden tener problemas, porque la transfección no siempre da como resultado la expresión de constructo fuerte, y las células no siempre reviven. La primera vez que tuvimos la idea de este método, fue cuando empezamos a reconocer las dificultades de identificar una proteína utilizando únicamente los anticuerpos creados contra ella. Comience resuspendiendo las células de interés en un mililitro de tampón de electroporación salina tamponado con HEPES e inmediatamente coloque las células en hielo.Agregue un volumen suficiente de plasma marcado con GFP-TMEM184A a las células para lograr una concentración final de 20 microgramos por mililitro de ADN, y transfiera aproximadamente

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

Aquí se demuestra el uso de colorante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localización en la superficie del receptor y endocitosis en las neuronas del hipocampo. A través del uso de construcciones que tienen una etiqueta extracelular corta que se une α-bungarotoxina, análisis de membrana de tráfico endocítica de proteínas de plasma se puede lograr.

El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico

Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

Las proteínas de la envoltura nuclear juegan un papel central en muchos procesos biológicos básicos y han sido implicadas en una variedad de enfermedades humanas.  Este protocolo describe un nuevo modelo de ratón basado en Cre/Lox que permite el control espacio-temporal de la interrupción de los complejos LINC.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Aquí, presentamos un protocolo robusto y optimizado para la producción de cantidades de miligramos de monómeros nativos, libre de etiqueta y las fibrillas de la exon1 de la proteína huntingtina (Httex1) basado en la fusión transitoria de ubiquitina pequeños modificadores relacionados (SUMO).

Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Este manuscrito describe un enfoque de cribado basado en células a escala del genoma para identificar interacciones extracelulares entre receptores y ligand.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.

Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Aprende a confirmar la identidad de TMEM184A como receptor de heparina en células vasculares mediante un constructo etiquetado con GFP. Este método permite la identificación funcional de genes huérfanos.

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