El uso de un TMEM184A GFP-etiquetados Constructo para la Confirmación de heparina receptor de Identidad

El objetivo general del uso de una construcción marcada con GFP es confirmar la identidad de una proteína previamente desconocida utilizando la GFP como identificador. Este método puede ayudar con la identificación funcional de genes huérfanos cuando una actividad enzimática específica no está disponible para su confirmación. La principal ventaja de esta técnica es que la etiqueta GPF permite utilizar el mismo constructo para varios tipos de experimentos.

Generalmente, los individuos que son nuevos en este método pueden tener problemas, porque la transfección no siempre da como resultado la expresión de constructo fuerte, y las células no siempre reviven. La primera vez que tuvimos la idea de este método, fue cuando empezamos a reconocer las dificultades de identificar una proteína utilizando únicamente los anticuerpos creados contra ella. Comience resuspendiendo las células de interés en un mililitro de tampón de electroporación salina tamponado con HEPES e inmediatamente coloque las células en hielo.

Agregue un volumen suficiente de plasma marcado con GFP-TMEM184A a las células para lograr una concentración final de 20 microgramos por mililitro de ADN, y transfiera aproximadamente 0,4 mililitros de células a una cubeta de electroporación preenfriada. Electroporar las células. A continuación, observe las células transfectadas en placas de cultivo de tejidos y colóquelas en una incubadora de cultivo celular durante 24 a 72 horas.

La etapa de transfección es la etapa más crítica del procedimiento, porque la mayor parte del trabajo experimental restante no puede completarse de manera efectiva si las células no son viables y no expresan niveles significativos de la construcción marcada con GFP. En el momento experimental apropiado, agregue 100 microgramos por mililitro de heparina de rodamina al medio de cultivo celular que expresa GFP y oxide las células, protegidas de la luz, hasta que se alcance el nivel deseado de tinción observado por microscopía de fluorescencia. A continuación, enjuague las células con PBS y unos segundos de agitación suave, protegidas de la luz, seguidas de una fijación con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.

Para evaluar la colocalización de la heparina rodamina marcada con GFP, utilice un microscopio confocal con la excitación adecuada de GFP y rodamina y láseres disminuidos para obtener imágenes de al menos 50 células de cada experimento de etiquetado por separado. Examine las imágenes en el programa de análisis de imágenes apropiado para determinar el hallazgo relativo de rodamina y la absorción en cada célula, utilizando una herramienta a mano alzada para rodear las células dentro de cada imagen fluorescente. Utilice la herramienta de medición para determinar la intensidad dentro de cada espacio encerrado en un círculo y, a continuación, exporte los datos de intensidad de fluorescencia a una hoja de cálculo para calcular el área multiplicada por la intensidad, restando el fondo de la misma cantidad de área para cada celda.

A continuación, se puede promediar la fluorescencia por célula para todas las células, para obtener datos estadísticamente significativos. Para facilitar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la TMEM184A GFP a la heparina de rodamina, primero montó células marcadas con heparina de rodamina TMEM184A GFP fijas transfectadas en portaobjetos de microscopio de vidrio. Excite las células a 405 nanómetros para obtener imágenes de la emisión de rodamina, seguido de una excitación de 488 nanómetros para obtener imágenes de la emisión de GFP.

A continuación, excite las células a 561 nanómetros para obtener una segunda imagen de emisión de rodamina. Para obtener imágenes de células vivas de la absorción de heparina de rodamina, siembre un cultivo en placa confluente de 100 mililitros de las células transfectadas con GFP TMEM184A en placas de imágenes de células vivas de 635 milímetros para obtener células cerca de la confluencia. Después de 48 horas, reemplace el sobrenadante con medio de cultivo sin rojo de fenol y transfiera una placa de células a un microscopio confocal con una etapa de calentamiento ajustada a 37 grados Celsius.

Enfoca el microscopio y agrega 100 microgramos por mililitro de heparina de rodamina a las células con una mezcla suave. Luego, comience a grabar inmediatamente las imágenes en vivo. Si no se produce una absorción de heparina dentro del campo de visión, mueva ligeramente la placa para identificar las células con al menos una vesícula verde, que contiene la etiqueta de rodamina.

Para la evaluación de la unión de heparina in vitro, enjuague una placa de 96 pocillos con recubrimiento de ativan negro y una placa de 96 pocillos negra sin recubrimiento con 200 microlitros de 0.2%CHAPS PBS pro-well al 0.2% durante tres lavados de cinco minutos con agitación. Después del último lavado, agregue 100 microlitros de 60 picomoles por pocillo de anti-GFP biotinilado por triplicado a la placa recubierta de ativan para cada grupo de hallazgo de GFP. A continuación, agregue tampón solo a los pocillos de control y selle todos los pocillos con una cubierta de placa para una incubación de dos horas a temperatura ambiente con agitación.

Al final de la incubación, lavar todos los pocillos tres veces en CHAPS PBS, como se acaba de demostrar, y agregar 100 microlitros de cinco nanomoles por pocillo de GFP TMEM184A, o GFP solo, a los pocillos apropiados en la placa recubierta de ativan. Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente con agitación, lavar todos los pocillos con CHAPS PBS fresco y agregar 100 microlitros de cada concentración experimental de fluoresceína-heparina, a los pocillos de prueba apropiados por triplicado, a la placa recubierta de ativan. Añada los patrones de concentración tanto a las placas recubiertas como a las no recubiertas, e incube ambas placas durante 10 minutos a temperatura ambiente, agitándolas, protegidas de la luz.

Ahora, use un lector de placas para registrar la emisión inicial de fluorescencia de heparina en los pocillos de control de ambas placas, y la emisión inicial de fluorescencia total de los pocillos con la GFP inmovilizada o GFP TMEM184A en la placa recubierta de ativan. A continuación, transfiera la heparina fluorescente no unida de los pocillos con el TMEM184A GFP inmovilizado o GFP a los pocillos correspondientes en la placa negra sin recubrimiento. Después de leer inmediatamente la emisión de fluorescencia en la placa negra sin recubrimiento, agregue 100 microlitros de CHAPS PBS fresco nuevamente a los pocillos de los que se eliminó la fluoresceína-heparina, y lea las emisiones de fluorescencia de estos pocillos para obtener la emisión de fluorescencia de las muestras eliminadas y no unidas en la placa sin recubrimiento.

Cuando se hayan obtenido todas las lecturas no consolidadas, utilice los valores totales de emisión de heparina para confirmar que se agregaron los niveles correctos de heparina a cada pocillo, restando las lecturas de fondo promedio de los valores. A continuación, cree un gráfico de la emisión frente al total de fluoresceína-heparina añadida, para determinar la escala de la emisión frente a la cantidad de heparina, y trace el gráfico de la heparina ligada corregida, frente a la heparina añadida para los triplicados de los pocillos de TMEM184A GFP y GFP. El tiempo transcurrido desde la transfección afecta a la distribución de la TMEM184A GFP, que parece acumularse durante al menos 72 horas, con más GFP aparente en la región paranuclear a lo largo del tiempo.

El patrón de tinción de GFP en este cultivo de células vasculares representativas parece ser el más similar al de un anticuerpo levantado contra un péptido C-terminal, un resultado lógico, dado que la GFP se encuentra en el extremo C de la proteína. El uso de un ligando fluoresceína-rodamina-heparina también se puede utilizar para la evaluación en tiempo real de la colocalización del receptor del ligando a lo largo del tiempo. La captación de heparina aumenta en GFP TMEM184A construir células knockdown estables transfectadas, lo que da como resultado células que pueden recuperar la capacidad de internalizar la heparina de rodamina al nivel o por encima del nivel de las células de tipo salvaje.

Utilizando el sistema táctico de GFP codificado por plásmidos demostrado, la construcción de GFP aislada TMEM184A anticuerpo anti-GFP demuestra una unión específica a la heparina satriple, mientras que la GFP de control no se une a ninguna heparina. La tinción simple con inmunofluorescencia con anticuerpos de nuevo GFP también puede proporcionar información sobre la ubicación de GFP, basada en el acceso de anticuerpos en células no permeabilizadas, proporcionando evidencia preliminar de que la GFP expresada en la membrana plasmática es extracelular. Una vez dominada, esta técnica puede dar lugar a una excelente expresión de constructo GFP, después de 24 a 48 horas de cultivo.

Al intentar el protocolo de imágenes en vivo, es importante recordar que es posible que algunas células no exhiban la absorción colocalizada, por lo que a menudo es necesario examinar otras células. Los ensayos de unión con ligandos GFP pueden complicarse por dímeros o agregados de orden superior de la proteína GFP, especialmente si se encuentran en micelas detergentes. En general, la expresión de proteínas marcadas con GFP puede facilitar una amplia variedad de experimentos para confirmar la identidad de una proteína previamente desconocida.