La disección de la Auditivo Bulla en ratones postnatales: Aislamiento de los huesos del oído medio y el análisis histológico

El objetivo general del procedimiento de disección es aislar la bulla auditiva y la cápsula, seguidas de los huesecillos auditivos individuales de ratones postnatales para varios análisis histológicos y de montaje completo. Este método se puede utilizar para abordar cuestiones clave en el campo de la biología de heridas, como los mecanismos de mala morfogénesis, la osificación endocondral o el mal metabolismo mineral. Este método se basa en un conocimiento profundo de los detalles anatómicos.

En general, los individuos nuevos en el ratón como sistema biológico pueden tener dificultades, porque su conocimiento del oído medio humano puede no ser aplicable a la contraparte del ratón. La demostración del procedimiento estará a cargo de Ayako Sakamoto, una técnica de mi laboratorio. Comience colocando la bulla auditiva y la cápsula con el hueso del cráneo circundante en una placa de muestra que contenga solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 a temperatura ambiente.

Bajo un microscopio de disección binocular, identifique los huesos del cráneo que rodean la cápsula auditiva como se muestra aquí. Use un juego de pinzas para agarrar el cráneo circundante y un segundo juego para separar el hueso basefenoidal y occipital. A continuación, utilice las pinzas para separar suavemente los huesos interparietal y parietal de la cápsula y retírelos cuando estén completamente aflojados.

A continuación, separe el escamoso de la bulla y la cápsula y retire suavemente el hueso y los tejidos blandos. A continuación, agarre el oído externo y voltee la muestra para revelar el lado medial. A continuación, gire la muestra 180 grados, agarre la cápsula y retire los tejidos blandos restantes.

La cresta dorsal ahora es visible. En este ángulo, los nervios facial y vestibulo-coclear en el conducto auditivo interno, la fosa subarcuada y el canal semicircular anterior son claramente visibles. Cuando la cresta dorsal está inclinada hacia el fondo de la placa de disección, se ve claramente la bulla auditiva.

Si la preparación está ligeramente inclinada, entonces el martillo es visible dentro de la bulla. Comience usando fórceps para fracturar el conducto auditivo externo por encima del martillo y lateral al surco timppánico. Cree una segunda factura anterior a la primera.

A continuación, retire el trozo de conducto auditivo externo para que la membrana timpánica sea visible. A continuación, extirpe parte de la membrana timpánica y el hueso timppánico cerca del proceso corto malleal, tanto en la pared ventral como en la posterior. El martillo, el yunque, el estribo y el músculo tensor del tímpano ahora deben estar expuestos.

Levanta el martillo y corta el músculo tensor del tímpano con el borde biselado de una aguja de calibre 27. Nótese que el manubrio malleal se adhiere firmemente a la membrana timpánica, como se observa en otros mamíferos. Dislocar el martillo del yunque en la articulación osicular fracturando la apófisis anterior del martillo en el gonialo.

Aísle el martillo de la bulla auditiva con fórceps. Retire la parte mayor de la bulla auditiva para exponer el yunque y el estribo. A continuación, utilice el borde biselado de una aguja de calibre 27 para cortar el ligamento posterior del yunque en la cresta corta.

Aísla el yunque con fórceps. Corta la arteria estapedial cerca del estribo con el borde biselado de una aguja de calibre 27. Gire la muestra de modo que la ventana redonda se coloque en la parte inferior.

A continuación, inserte una aguja de coser en el agujero obturador del estribo y levante el estribo. Después de quitar el estribo, la abertura de la ventana ovalada debe ser claramente visible. Use la aguja de calibre 27 para empujar el estribo fuera de la aguja de coser.

Para comenzar la inclusión del tejido, primero use unas tijeras para cortar el proceso estiliforme en el extremo anterior de la bulla. El martillo y la cresta dorsal son visibles a través de la porción cortada. Sumerja la bulla y la cápsula en 1-2% de paraformaldehído en PBS.

Si hay aire atrapado en la bulla, retírelo con una aguja y una jeringa. Deje la bulla y la cápsula en el fijador a cuatro grados centígrados durante la noche en un rotador de tubo. Al día siguiente, lave la bulla y la cápsula rápidamente en PBS.

Luego, sumérjalo inmediatamente en un compuesto crioincrustante líquido a cuatro grados centígrados. Es común que se formen burbujas de aire en el compuesto crioincrustante a nivel del oído medio y externo. Retire la burbuja de aire del oído medio mediante aspiración con una aguja.

Use la misma técnica para la burbuja de aire en el oído externo. Una vez eliminadas todas las burbujas de aire, orientar el tejido según el tipo de secciones a obtener. A continuación, el tejido se puede incrustar en bloques congelados antes de seccionarlo.

Esta imagen muestra la tinción H y E de una sección longitudinal de parafina de un martillo descalcificado, indicada por la letra M, y la bulla auditiva y la cápsula de un ratón P14. La membrana timpánica se indica con la letra TM. Esta imagen muestra el marcaje óseo de calcio de una sección longitudinal de martillo congelado sin descalcificar, indicado por la letra M, y la bulla auditiva de un ratón P21. Las señales de color verde calcio revelan la formación de hueso nuevo en el martillo, la bulla y la cápsula.

Una vez dominada la técnica, la bulla auditiva y la cápsula se pueden aislar en diez minutos si el procedimiento se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de las orientaciones anatómicas de los huesecillos auditivos y las bullas en el ratón, que se describió en el texto principal.