Name: Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar microvesículas de membrana plasmática de sangre periférica mediante citometría de flujo y Western Blot. Este método permite identificar biomarcadores tumorales en aproximadamente dos horas y media.

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Los autores agradecen a Meike Schaffrinski por su excelente asistencia técnica. Nos gustaría agradecer a las siguientes personas por su ayuda en la recolección de muestras de sangre periférica (todas del Centro Médico Universitario de Göttingen): Henrietta Vida (Departamento de Medicina Transfusional), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Departamento de Cirugía General, Visceral y Pediátrica), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Departamento de Neurocirugía), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Departamento de Otorrinolaringología, Cirugía de Cabeza y Cuello) así como a todos los empleados de la interdisciplinaria oncología de corta duración. Agradecemos a Dirk Wenzel (Instituto Max Planck de Química Biofísica, Göttingen) por su ayuda con la microscopía electrónica de MVs. 
El estudio fue financiado por el proyecto MetastaSys del Ministerio de Educación e Investigación de Alemania (BMBF) (subvención n.º 0316173), así como por la Ayuda Alemana contra el Cáncer (subvención n.º 109615).

Todos los experimentos que incluyen sujetos humanos han sido aprobados por el comité de ética local (aprobación no. 02.03.14). Para la elección de los pacientes hay que señalar que varios factores tales como la edad, el sexo, los regímenes de tratamiento actuales y muchos más pueden influir en la composición de MT en la sangre y por lo tanto deben ser tomados en consideración antes de la recogida de muestras 22,23. 1. Preparación de muestras de plasma <ol><li> Dibuje 1 - 2 tubos de sangre por donante a través de una aguja de mariposa de calibre 21 en un tubo de recogida de sangre Vacutainer que contiene EDTA (1,6 mg / ml de sangre). Asegúrese de invertir los tubos (s) varias veces para garantizar la anticoagulación de la sangre eficiente. Nota: El volumen recomendado de sangre para su posterior citometría de flujo y análisis de Western Blot es de 5 - 15 ml. Con el fin de evitar la degradación y pérdida MV, muestras de sangre deben ser manejados &lt;30 min después de la retirada de la sangre. </li><li> Preparar muestras de plasma por centrifugación de las muestras durante 15 minutos a 1200 xgatemperatura ambiente (RT). </li><li> Aplicar un filtro de la válvula con el fin de ayudar a la separación de plasma (= capa superior) a partir de células sanguíneas (= capa inferior) restante. </li><li> Transferir el plasma en un tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 1.500 xg, RT para sedimentar los restos celulares más grandes y eliminar las plaquetas restantes. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de 15 ml y proceder directamente con muestras de aislamiento o almacenar MV para un máximo de 6 meses a -20 ° C. NOTA: El protocolo presentado también se puede utilizar para aislar MVs (y Exos) de sobrenadantes de cultivo celular. Con el fin de hacerlo, cultivar las células a 60 - 80% de confluencia durante 24 - 48 h en medio de cultivo suplementado con FCS vesículas empobrecido, y luego recoger el sobrenadante. Centrifugar durante 5 min a 750 xg, 4 ° C para agotar las células flotantes residuales, llenar el sobrenadante en un nuevo tubo y se centrifuga de nuevo 15 ml durante 5 minutos a 1500 xg, 4 ° C para sedimentar los residuos celulares más grande. Este sobrenadante se puede entonces utilizar para el aislamiento de MVscomo se describe en el Paso 2.1 a 2.16. </li></ol> 2. Aislamiento de las VM <ol><li> La transferencia de la muestra de plasma en un tubo de centrifugación adecuado. Si es necesario, llenar el tubo con PBS con el fin de diluir la muestra y evitar el colapso de los tubos de pared delgada durante el procedimiento de centrifugación. </li><li> Se centrifuga durante 35 min a 14.000 xg, 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante, mantienen los tubos se volvieron al revés y ponen sobre una toalla de papel. Espere 3-5 min hasta que todo el sobrenadante restante se ha empapado en la toalla y por lo tanto extraído de la muestra. </li><li> Resuspender el precipitado en MV 1.000 l de PBS, transferir a un tubo de centrífuga y 1,5 ml durante 35 minutos a 14.000 xg, 4 ° C en una centrífuga de mesa. </li><li> Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en MV 50-500 l de PBS, dependiendo del tamaño de la pastilla. Alternativamente, lyse MVs directamente, por ejemplo, en tampón RIPA (NaCl 150 mM / 0,1% SDS / 0,5% de Na-desoxicolato / 1% de Triton X-100 / Tris 50 mM, pH 7,2)para su posterior análisis de Western Blot. MV almacenar a -20 ° C. Ellos permanecerán estables durante varios meses, pero evite la congelación-descongelación ciclos repetidos. </li><li> Opcional: Determinar la concentración de proteínas MV con un ensayo de proteínas (por ejemplo, Bradford o el método de Lowry) a fin de evaluar los rendimientos de MT o la dosis MVs para experimentos posteriores. </li><li> Si Exos adicionales han de ser aislado de las muestras de plasma, se decanta el sobrenadante del paso 2.3 en un tubo de ultracentrifugación y centrifugar durante 2 horas a 110.000 xg, 4 ° C. Decantar el sobrenadante como se describe en el paso 2.3, resuspender Exo pellet en 1000 l de PBS y transferir en pequeños (1,5 ml) tubos de ultracentrifugación. <ol><li> Ultracentrífuga durante 2 horas a 110.000 xg, 4 ° C, el sobrenadante aspirado y resuspender Exo pellet en 50 a 75 l de PBS o tampón RIPA. </li></ol></li></ol> 3. Caracterización de las VM por Citometría de Flujo <ol><li> Transferencia de 15 l de PBS + 1% de vesículas empobrecido de suero de ternera fetal (FCS) en un tubo de citometría de flujo. NOTA: empobrecido en vesículas FCS se prepara por centrifugación inactivado por calor (30 min a 56 ° C) de FCS durante 18 horas a 110.000 xg y filtrando el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras como se describió anteriormente 24. </li><li> Se añaden 5 g (en el caso de los bajos rendimientos de 3 mg) también son de aplicación de las VM en PBS. </li><li> Incubar las muestras durante 30 minutos a RT con el fin de bloquear los sitios de unión no específica en la superficie MV y con ello reducir la tinción de fondo. </li><li> Añadir un anticuerpo marcado con fluorescencia contra el interés de la proteína. Valorar la cantidad de anticuerpo usado para la tinción antes de su uso con el fin de determinar la concentración óptima y garantizar una ración de bajo señal a ruido. Asegúrese de incluir también un tubo con VM sin teñir como control negativo y un tubo de las VM teñidas con el anticuerpo de control de isotipo coincidente con la misma concentración (por ejemplo, si se usa 1 mg de anticuerpo, también utilizar 1 g del un control de isotipotibody) para cuantificar la tinción de fondo. NOTA: También es posible llevar a cabo el flujo multicolor citometría mediante la adición de varios anticuerpos acoplados a diferentes fluorocromos. </li><li> Incubar durante 20 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 250 l de PBS y proceder con la medida de la muestra utilizando un citómetro de flujo. <ol><li> En caso de que las muestras no se pueden medir inmediatamente, añadir 150 l de PBS y 50 l 4% de paraformaldehído (PFA) para fijar las muestras y se almacena a 4 ° C. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico. Usar guantes y equipo de protección personal adecuado. </li></ol></li><li> Reducir el umbral del citómetro de flujo al valor más bajo posible y la búsqueda de la población MV utilizando una dispersión frontal (FSC) frente a dispersión lateral trama (SSC) en escala logarítmica. Puerta de la población MV y evaluar la señal fluorescente en un histograma correspondiente. </li></ol> 4. Caracterización de MV por Western Blot <ol><li> Resuspender el precipitado en MV directamenteun tampón de lisis adecuado (por ejemplo, tampón RIPA). <ol><li> En caso de que el pellet MV ya se ha resuspendido en PBS, se diluye por lo menos 1: 1 en un tampón de lisis adecuado (por ejemplo, tampón RIPA). </li></ol></li><li> Determinar la concentración de proteína de la muestra MV, por ejemplo, por el ensayo de Lowry. </li><li> Preparar 10 - 20 mg de las VM en 22,5 l de tampón RIPA. A continuación, añadir 7,5 l de 4x tampón de carga de Laemmli y el calor durante 5 minutos a 95 ° C. </li><li> Cargar las muestras en un gel de poliacrilamida y realizar electroforesis e inmunotransferencia de acuerdo con protocolos estándar. </li><li> Después de transferir las proteínas a la membrana, realizar una tinción de Ponceau como control de carga de acuerdo con protocolos estándar. </li><li> membrana Destain en TBST durante 5 min a TA. </li><li> Bloquear la membrana durante 30 minutos hasta 1 hora a temperatura ambiente en 5% de BSA en TBST. </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche o durante 2 horas a RT. </li><li> Se lava la membrana con TBST 3 x 5 min.</li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo secundario acoplado a HRP a una dilución de 1: 10.000 en 5% de BSA. Nota: En caso de altas señales de fondo, utilizar leche en polvo en lugar de BSA. </li><li> Se lava la membrana con TBST 3 veces 5 min. </li><li> Desarrollar membrana con un reactivo de detección ECL y detectar señales en películas de quimioluminiscencia o un sistema de imágenes de quimioluminiscencia. NOTA: Con el fin de discriminar las variedades modernas de Exos, proteínas como la tubulina, actinina-4 o mitofilin se puede utilizar, que deben ser presente principalmente en las variedades modernas 16,25. Prestar atención a que los anticuerpos más tetraspanin (por ejemplo, CD9, CD81), utilizados como marcadores para Exos, no funcionan en condiciones reductoras y por lo tanto deben estar preparados en tampón no reductor de carga seguido de calentamiento durante 10 minutos a 70 ° C. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Los estudios recientes sobre los vehículos eléctricos en la sangre han demostrado que la composición EV y recuentos cambian durante la causa de varias enfermedades. Por lo tanto, el análisis y la caracterización adicional de estos vehículos eléctricos son de gran interés para evaluar más a fondo su potencial uso como biomarcadores de la enfermedad para el diagnóstico y el pronóstico o para evaluar las respuestas de terapia. El protocolo que aquí presentamos permite el aislamiento de vesículas con un diámetro de hasta 600 nm, que no contiene ningún orgánulos celulares. Estas observaciones están de acuerdo con la definición actual de las VM y no incluyen la presencia de cuerpos apoptóticos 2. El uso de Western Blot, hemos sido capaces de demostrar que las variedades modernas aisladas muestran una alta expresión de tubulina, mientras que los tetraspanins CD9 y CD81 que se utilizan a menudo como marcadores Exo se expresaron sólo ligeramente. Esto confirma que las variedades modernas difieren de Exos y se adapta a la reciente caracterización y comparación de ambas poblaciones EV en profundidad por la proteómica 25. contenido &quot;&gt; Durante la adquisición de muestras de sangre, es fundamental para mantener el tiempo entre la punción venosa y la preparación de plasma lo más corta posible con el fin de prevenir la degradación de MV. Además, el almacenamiento prolongado de las muestras de sangre podría dar lugar a la activación de células de la sangre que causa una mayor MV vertimiento y en última instancia, la apoptosis que resulta en la liberación de cuerpos apoptóticos. Otra consideración importante para el aislamiento de MV es para evitar contaminaciones de preparaciones MV con las proteínas plasmáticas o Exos más pequeñas. por lo tanto, es fundamental para eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible después de girar hacia abajo las MVs en 14.000 x g. Dado que el pellet es normalmente visible y fuertemente unido a la pared del tubo, el sobrenadante se puede quitar fácilmente con una punta de pipeta. En contraste con Exos que tienden a formar agregados durante la preparación mediante ultracentrifugación de alta velocidad y son a menudo difíciles de volver a suspender, este problema no se produce con MVS. Nuestro estudio muestra que es posible para caracterizar subpoblaciones de MT presentes en la sangre por citometría de flujo. A pesar de que el límite de detección de la mayoría de los citómetros de flujo es de alrededor de 200 - 300 nm, VM se midieron de manera reproducible en el donante, así como muestras de cultivo celular con los mismos parámetros de análisis y puertas que permitían claramente su distinción de las señales de fondo. Es importante verificar antes de las mediciones que el PBS utilizado para los análisis no contiene partículas contaminantes que podrían causar un fondo alto durante citometría de flujo (Figura 3). Aunque algunas variedades modernas más pequeñas no pueden ser capturados en un enfoque de citometría de flujo, se han detectado las variedades modernas de las principales poblaciones de células sanguíneas (por ejemplo, plaquetas, glóbulos rojos, leucocitos, células endoteliales). En nuestro análisis hemos utilizado marcadores estándar para las diferentes células sanguíneas que se han encontrado previamente en las VM 26 - 29. Debe tenerse en cuenta que con el fin de obtener los mejores resultados posibles por citometría de flujo, tque cantidad y la concentración de todos los anticuerpos se debe ajustar en una muestra MV que expresa el antígeno de interés. Si subpoblaciones específicas de MT en la sangre serán identificados con mayor especificidad, es posible llevar a cabo la doble tinción contra dos antígenos diferentes presentes en los respectivos MVs y sólo considerar todas las MVs dobles positivos para análisis posteriores 23. Actualmente, se están realizando esfuerzos para definir una gama estándar de las subpoblaciones de MT en la sangre de individuos sanos 23,30. Estos estudios ya han demostrado que las variedades modernas derivados de las plaquetas constituyen la mayor población de las VM en la sangre que está en correspondencia con nuestras observaciones. Una de las ventajas de la citometría de flujo para caracterizar muestras de MT es que este método ya está bien establecido con fines de diagnóstico en la mayoría de los centros clínicos que permitan el posible uso de las VM como biomarcadores en el diagnóstico clínico de todos los días. Estudios previos sobre los vehículos eléctricos en la sangre que tienen en su mayoría se centraned en Exos más pequeños, se basan en cualquiera de los procedimientos de clasificación específicos para analizar selectivamente la población objetivo Exo deseada 31,32 o requiere una (2 días) proceso de aislamiento que consume tiempo con acoplamiento de Exos a perlas de látex antes del análisis 18. Nuestras propias observaciones no publicadas sugieren que el análisis de citometría de flujo de MVs a partir de preparaciones de sangre completa incluso permite la detección de MVs como MVs derivadas de tumores sin ayuda de tales procesos de selección. En su conjunto, el protocolo presentado aquí permite el aislamiento rápido de las VM a partir de muestras de sangre periférica con equipo de laboratorio estándar y su posterior caracterización mediante citometría de flujo y transferencia Western. Todo el proceso se puede realizar en alrededor de 2 h que facilitará los estudios futuros sobre los perfiles de MT en la sangre de los pacientes que se requieren para evaluar el potencial de MVs como biomarcadores de la enfermedad.

En los últimos años, muchos estudios in vitro han demostrado que las vesículas extracelulares (EVs) juegan un papel importante en la comunicación intercelular. Las células vivas excretan constantemente vesículas que difieren en tamaño, contenido y la biogénesis. Los vehículos eléctricos mejor estudiados son los exosomas que se originan en el sistema endosomal en el que se almacenan como vesículas intraluminales en los cuerpos multivesiculares. Una vez que éste se fusionan con la membrana plasmática, las vesículas se liberan contenidos como exosomas (Exos, diámetro de 30 - 100 nm 1). Una segunda población de EV que ha ganado una creciente atención en los últimos años son grandes microvesículas (MVs, diámetro 100 - 1000 nm), que brotan fuera directamente de la membrana plasmática 2. Ambos tipos de vesículas están rodeados por una bicapa lipídica y contienen ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN, ARNm o miARN 3-5, y una gran cantidad de proteínas que pueden transferir a la vecina cells. Si bien en general la composición de proteína de las vesículas refleja el estado de la célula de origen, algunas proteínas parecen ser dirigidos y enriquecido en vehículos eléctricos 1 de forma selectiva. Una gran interés la investigación es la caracterización de los vehículos eléctricos a partir de células anormales y enfermas con el fin de definir las firmas EV específicos que podrían permitir el uso de los vehículos eléctricos como nuevos biomarcadores. Especialmente en el cáncer, en el que a menudo el tumor en sí mismo no es fácilmente accesible, biopsias líquidas dirigidas a los vehículos eléctricos específicos de tumores en la sangre pueden permitir el seguimiento de las respuestas de terapia o ayudar a caracterizar el tumor primario sin la necesidad de procedimientos invasivos 6. De hecho, los vehículos eléctricos ya se han aislado con éxito de varios fluidos corporales, incluyendo la orina 7, 8 CSF, la leche materna o la sangre 9 10. Varios estudios identifican los cambios en los recuentos de EV y la composición de diferentes enfermedades humanas. Por ejemplo, en pacientes con sepsis el número de MVs pro-coagulante seaumentado de manera significativa en comparación con los individuos sanos 11. También en pacientes con malaria cerebral grave un aumento en el total de las VM en la sangre puede ser observado y cargos de las VM derivados de las plaquetas se correlaciona con la profundidad coma y trombocitopenia 12. Otros estudios informan de números elevados de vesículas derivados del endotelio en pacientes con lupus eritematoso sistémico o la insuficiencia cardíaca y en el caso de este último, esto se correlaciona con una mayor probabilidad de eventos cardiovasculares 13,14. Especialmente en el cáncer, los vehículos eléctricos en la sangre se discuten actualmente como nuevos biomarcadores con valor diagnóstico y pronóstico. Los niveles de MVs que expresan proteínas asociadas a tumores, tales como MUC1, EGFR o FAK parecen ser elevados en la sangre de pacientes con cáncer de mama 15,16. También para Exos, estudios recientes han demostrado que los Exos derivados de la sangre que llevan antígenos específicos de tumores tales como Glipicano-1 de cáncer de páncreas o Del-1 de cáncer de mama permite temprana de la enfermedad deprotección con una alta especificidad y sensibilidad 17,18. Además, tumor derivado del suero Exos puede contener ADN que se puede utilizar para la detección de mutaciones, tales como KRAS y p53 que sugiere su uso para la predicción de la terapia 19. Los avances recientes han demostrado que el análisis de Exos en la sangre de los pacientes de glioblastoma utilizando un chip de microfluidos específico permite la monitorización de la terapia 20. Tomados en conjunto, estos resultados implican que el análisis de subpoblaciones específicas de la enfermedad de vesículas da valiosa información sobre el diagnóstico, el pronóstico, así como opciones terapéuticas y el éxito. Sin embargo, el aislamiento y el análisis de Exos de la sangre es que consume tiempo, requiere un equipo especial de laboratorio y por lo tanto todavía no es adecuado para el diagnóstico clínico de rutina. Por el contrario, MVs pueden aislarse mucho más rápido y, debido a su mayor tamaño, se puede analizar fácilmente mediante citometría de flujo sin la necesidad de ellos par a perlas de látex, ya que es necesario para Exos 18, 21. Por lo tanto, aquí se presenta un protocolo que se puede utilizar para el aislamiento normalizado de MVs de muestras de sangre y la posterior caracterización de subpoblaciones de MT por citometría de flujo. Este protocolo permitirá que el estudio y la caracterización de los perfiles de profundidad de media tensión en grandes grupos de pacientes que serán necesarios con el fin de utilizar las variedades modernas para el diagnóstico clínico de todos los días.

<table><tbody><tr><td>aguja de mariposa (calibre 21)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina Fracción V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>Para 10x TBS pesa 24,2 g Tris base y 80 g NaCl, ad 1 L H2O y ajusta el pH a 7,6</td></tr><tr><td colspan="4">Para 1x TBS-T mezclar 100 mL 10x TBS con 900 mL H2O y añadir 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>uso 5 y micro; l para la tinción</td></tr><tr><td>de CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>uso 5 y micro; l para la tinción</td></tr><tr><td>de CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>uso 0.8 y micro; g para la tinción</td></tr><tr><td>de CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>uso 0.1 y micro; g para la tinción del</td></tr><tr><td>anticuerpo CD81</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2.000 en 5% BSA en TBS-T; uso de condiciones no reductoras para el</td></tr><tr><td>anticuerpo CD9</td> de Western Blotting <td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1.000 en 5% de BSA en TBS-T; uso de condiciones no reductoras para Western Blotting</td></tr><tr><td>Quimioluminiscencia generador de imágenes ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC kit de ensayo de proteínas II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000112</tr><tr><td>Reactivo de detección ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Vacunas EDTA para la extracción de sangre</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>suero fetal para terneros (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>inactivado por calor (30 min, 56 & deg; C)</td></tr> <tr><td>filtro 0.22 y micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a HRP</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>uso 1:10.000 en leche en polvo al 5% en TBS-T</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a HRP</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>uso 1:10.000 en leche en polvo al 5% en TBS-T</td></tr><tr><td>4x Tampón de carga Laemmli, Roti-Load 1</td> Microfuge <td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>leche en polvo (Blotting-Grade Blocker, leche en polvo descremada)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, sin Ca y Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>jeringa perfusora 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>solución de tinción Ponceau-S Rotor</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>Sw32.1 Ti para ultracentrifugación (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Rotor Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 para ultracentrifugación (10 x 1,5 mL)</td><td>Beckman Tubos Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para citometría de flujo (5 mL, fondo redondo)</td>Tubos de <td>352054</td><td></td> <td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>para ultracentrifugación (15 mL)</td>Tubos de <td>344061</td><td></td> <td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>para ultracentrifugación (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Tubulina</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5.000 en 5%BSA en TBST</td></tr><tr><td>ultracentrífuga Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrífuga TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro de válvula Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53.428</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

La liberación de vesículas extracelulares (EVs), incluidas las pequeñas exosomas derivados de endosomal (Exos, diámetro &lt;100 nm) y microvesículas de membrana derivada de plasma grande (VM, diámetro&gt; 100 nm) es un proceso celular fundamental que se produce en todas las células vivas. Estas proteínas de transporte de vesículas, lípidos y ácidos nucleicos específicos para su célula de origen y en estudios in vitro han puesto de relieve su importancia como mediadores de la comunicación intercelular. Vehículos eléctricos se han aislado con éxito de diversos fluidos corporales y, especialmente, los vehículos eléctricos en la sangre han sido identificados como prometedores biomarcadores para el cáncer o enfermedades infecciosas. Con el fin de permitir el estudio de las subpoblaciones de MT en la sangre, se presenta un protocolo para el aislamiento normalizado y caracterización de MVs a partir de muestras de sangre periférica. MVs se sedimentan a partir de muestras de plasma EDTA anticoagulada por centrifugación diferencial y típicamente poseen un diámetro de 100 - 600 nm. Debido a su mayor tamaño, que puedenfácilmente ser estudiadas por citometría de flujo, una técnica que se utiliza de manera rutinaria en el diagnóstico clínico y disponible en la mayoría de los laboratorios. se darán varios ejemplos para los ensayos de control de calidad de las MVs aisladas y se presentarán los marcadores que se pueden utilizar para la discriminación de las diferentes subpoblaciones de MT en la sangre.

Con el fin de cuantificar el rendimiento de las VM que se pueden aislar siguiendo el protocolo descrito, se calculó la cantidad de VM aisladas a partir de muestras de sangre de 10 donantes. El rendimiento MV, que fue evaluada en un ensayo de proteínas de Lowry, varió de 10 hasta 30 g con una media de 19,2 mg por ml de sangre MV (Tabla 1). La concentración de partículas se determinó por análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) varió de 1,66 x 10 9-2,36 x 10 10 con una media de 5,9 x 10 9 partículas por ml muestra de plasma (Tabla 2). Además de la caracterización de las variedades modernas de microscopía electrónica de transmisión reveló una población de vesículas con un diámetro&gt; 100 nm, que estaban rodeados por una bicapa lipídica y no contenían ningún orgánulos celulares (Figura 1A). NTA confirmó que el tamaño de las MVs aislados varió desde 100 hasta 600 nm (Figura 1B) y el tamaño medio de MV fue 201nm (Figura 1C). La tinción para típicos de MT y Exo marcadores mediante transferencia de Western demostró que los MVs aislados fueron positivos para la tubulina y sólo mostró una ligera expresión de CD9 y CD81, mientras que Exos fueron negativos para la tubulina y enriquecido en CD9 y CD81 (Figura 2). Análisis de las MVs aislados por citometría de flujo (Figura 3A) reveló una población de vesículas definido que podría ser cerrada utilizando los mismos parámetros utilizados normalmente para MVs aisladas a partir de sobrenadantes de cultivo celular y que era claramente diferente de la señal de fondo obtenida por la medición de PBS + 1% vesículas con depleción de FCS sin adición de MVs (Figura 3B). Para el análisis de las diferentes poblaciones de MT presentes en la sangre, MVs se tiñeron con los marcadores establecidos para las diferentes poblaciones de células sanguíneas, por ejemplo, CD62P para MVS derivado de plaquetas, CD45 para MVs derivadas de leucocitos, CD235a paraMV y CD62E sangre roja derivado de células para MVS derivadas de células endoteliales (Figura 4). Esta caracterización mostró que el porcentaje de subpoblaciones de MT difería entre las muestras de sangre de donantes investigados, mientras que la mayoría de MVs parecía ser derramada por las plaquetas en todas las muestras. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Figura 1: Distribución del Tamaño de las VM aisladas de la sangre periférica. A, MVs aisladas se visualizaron por microscopía electrónica de transmisión. B, el análisis de seguimiento de nanopartículas Representante (NTA) de las VM que ilustran la distribución del tamaño de las vesículas. C, El tamaño medio de 10 MV preparaciones independientes se midió por NTA (media). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la col</a>Arger versión de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Figura 2: Caracterización de las VM aisladas por el Western Blot. la expresión diferencial de proteínas en las MVs aislados y Exos de dos donantes se visualizó mediante transferencia Western. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Figura 3: Análisis de las VM mediante citometría de flujo. A, MV se visualizan por primera vez el frontal (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) parcelas de compuerta en la respectiva población MV. Posteriormente, estos MVs se caracterizan por el antígeno de interés por<html> el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra el antígeno. B, FSC típica frente a las parcelas SSC para MVS aisladas del plasma de dos donantes. Como comparación, un gráfico típico para MVs derivadas de las células tumorales de las células de cáncer de pulmón A549 aisladas a partir de sobrenadante de cultivo celular, así como un control negativo usando sólo PBS + 1% de vesículas empobrecido FCS sin MVs se muestra a la derecha. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Figura 4: Caracterización de las VM aislados por citometría de flujo. MVs de tres donantes se caracterizaron para la expresión de marcadores de células de sangre establecidos (rojo) por citometría de flujo. Los respectivos controles de isotipo se muestran en gris.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> MV / ml de sangre [g] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: MV producción de proteína a partir de muestras de sangre periférica. </strong&gt; que se muestra es la cantidad de VM por ml de sangre periférica que se ha elaborado a partir de 10 donantes. los rendimientos de MT se cuantificaron mediante el ensayo de Lowry. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Muestra </td><td> MV / ml de plasma [recuento de partículas] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Rendimiento MV de partículas de muestras de sangre periférica. </strong&gt; MV fueron aisladas de muestras de plasma de 10 donantes y recuentos de partículas se determinaron por análisis de seguimiento de nanopartículas. Se muestra el valor medio de tres mediciones independientes.

Las vesículas extracelulares presentes en la sangre han sido sugeridas como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades. En este trabajo se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes microvesículas derivadas de membrana plasmática a partir de muestras de sangre periférica y su posterior análisis mediante citometría de flujo convencional y Western Blotting.

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Los objetivos generales de este método son caracterizar y estudiar poblaciones de microvesículas derivadas de la membrana plasmática en sangre periférica. Las microvesículas de pacientes con tumores, son ensayos proinvasivos y funcionales. Por lo tanto, una caracterización adicional proporcionará información sobre cómo estas vesículas realmente contribuyen a la invasión y la metástasis.La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis relativamente rápido de las microvesículas en la sangre, sin necesidad de materiales y equipos sofisticados o costosos. Después de obtener uno o dos tubos de sangre de un voluntario en tubos de recolección que contienen EDTA, invierta los tubos varias veces para garantizar una anticoagulación sanguínea eficiente. Dentro de la media hora posterior a la extracción de sangre, centrifugue las muestras y agregue un filtro de válvula a los tubos para ayudar a separar el plasma de la sangre restante.Transfiera el plasma a un tubo de 15 mililitros para una segunda centrifugación. Coseche el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo. Agregue PBS si es necesario.Centrifugar el plasma que contiene sobrenadante diluido en PBS según sea necesario para recoger las microvesículas. Luego decanta el sobrenadante y coloca los tubos boca abajo sobre una toalla de papel durante tres a cinco minutos. Cuando todo el sobrenadante restante haya empapado la toalla, retire cualquier resto de plasma del borde de los tubos y vuelva a suspender la pastilla de microvesículas en un mililitro de PBS.Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5. Luego, después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 50 a 500 microlitros de PBS, dependiendo del tamaño del pellet. A continuación, determine la concentración de proteínas de las microvesículas con un ensayo de proteínas.Para caracterizar las microvesículas por citometría de flujo, transfiera 15 microlitros de PBS, suplementados con FCS empobrecido en vesículas al 1% en un tubo de citometría de flujo, seguido de tres a cinco microgramos de microvesículas suspendidas en PBS. Incubar la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión inespecífica en la superficie de la microvesícula. A continuación, añada el anticuerpo marcado con fluorescencia de interés para una incubación a temperatura ambiente de 20 minutos en la oscuridad.A continuación, diluya la muestra en 250 microlitros de PBS fresco y cargue las microvesículas en el citómetro de flujo. Reduzca el umbral del citómetro de flujo al valor más bajo posible y busque la población de microvesículas utilizando un diagrama de dispersión frontal frente a lateral en una escala logorítmica. A continuación, haga una puerta alrededor de la población de microvesículas y evalúe la señal fluorescente en un histograma correspondiente.El rendimiento de microvesículas de las muestras de sangre del donante se puede evaluar en el ensayo de proteínas de Lowry con rendimientos típicos entre 10 y 30 microgramos de vesícula por milímetro de sangre, y una concentración de partículas que oscila entre 1,66 veces 10 y 9, y 2,36 veces 10 y 10, según lo determinado por el análisis de seguimiento entre partículas. La caracterización adicional de las microvesículas mediante microscopía electrónica de transmisión revela una población de vesículas con un diámetro superior a 100 nanómetros rodeadas por una bicapa lipídica que no contiene ningún orgánulo celular. El análisis de seguimiento de nanopartículas también confirma que el tamaño promedio de las microvesículas aisladas oscila entre 100 y 600 nanómetros, con una media de 201 nanómetros.La tinción de marcadores típicos de microvesículas y exosomas mediante Western blot demuestra que las microvesículas aisladas en sangre suelen ser positivas para tubulantes, con una expresión débil de CD9 y CD81, mientras que los exosomas son generalmente negativos para tubulantes y están enriquecidos con los otros dos marcadores. La citometría de flujo revela una población definida de vesículas derivadas del donante que se pueden controlar utilizando los mismos parámetros utilizados para las microvesículas aisladas sobrenadantes de cultivo celular. Esto también es claramente diferente de la señal de fondo observada para el PBS controlado, complementado con muestras de FCS con un 1% de vesículas disminuidas.La tinción de microvesículas con marcadores establecidos para diferentes poblaciones de células sanguíneas revela que el porcentaje de subpoblaciones de microvesículas difiere entre las muestras de donantes de sangre, y que la mayoría de las microvesículas parecen ser desprendidas por las plaquetas en todas las muestras. Una vez dominado, el aislamiento de las microvesículas y su posterior caracterización por citometría de flujo se puede realizar en unas 2 horas y media. La caracterización de las subpoblaciones de microvesículas ayudará a identificar una firma tumoral en los pacientes frente a los controles.Esto puede ser útil como biomarcador para el diagnóstico y la terapia contraria.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo detalla un método para aislar vesículas extracelulares (SVE), pequeñas partículas membranosas liberadas de las células, a partir de tan poco como 10 muestras de suero l. Este enfoque evita la necesidad de ultracentrifugación, requiere sólo unos pocos minutos de tiempo de ensayo, y permite el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de muestras de volúmenes limitados.

Dispositivos basados ​​en papel para aislamiento y caracterización de extracelular vesículas

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

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Presentamos un protocolo sencillo para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total obtenida de pacientes diagnosticados con Síndrome de Sézary, seguido de selección de linfocitos T CD4+, su estimulación con forbol12-miristato13-acetato e ionóforo A23187, y preparación de ARN para el perfil transcriptómico.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana y células T CD4 + de pacientes con síndrome de Sézary para perfiles transcriptómicos

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

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Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

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Aquí, demostramos el método de caracterización de vesículas extracelulares (EV) recolectadas de fluidos biológicos, como lágrimas y saliva, de sujetos humanos. El escáner utilizado en este método es capaz de detectar el fenotipo, el tamaño y el recuento total de partículas de los EV a partir de 1 μL de la muestra.

Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.

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Aprende a aislar y caracterizar microvesículas de membrana plasmática de sangre periférica mediante citometría de flujo y Western Blot. Este método permite identificar biomarcadores tumorales en aproximadamente dos horas y media.

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

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