Name: Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a realizar crioseccionado de músculo esquelético de ratón para correlacionar datos histológicos y moleculares del mismo tejido. Este método permite obtener ARN de alta calidad y optimizar el análisis experimental.

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Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre y Junna Luan proporcionaron asistencia técnica. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio número AR065077. El contenido es responsabilidad exclusiva del autor y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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</ol>

La autora declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.

Para lograr los mejores resultados con este método, mantenga la resina de inclusión restringida al tercio inferior o la mitad del músculo durante la criopreservación de tejidos porque el exceso de resina ralentizará la recolección de las criosecciones agrupadas y puede aumentar la contaminación de la resina de inclusión en el aislamiento de ARN. Además, es importante prestar especial atención durante la homogeneización de la aguja para maximizar el rendimiento y minimizar la probabilidad de obstruir la aguja. El protocol...

El objetivo de esta técnica es hacer múltiples análisis experimentales por diferentes modalidades, como la histología y la expresión génica, accesible desde un solo pequeño tejido fuente músculo esquelético. aplicaciones de microscopía son los más sensibles a la muestra métodos de conservación, que deben ser controladas cuidadosamente para limitar la formación de artefactos de cristales de hielo durante la criopreservación. Por lo tanto, el desarrollo del método se basa en el tibial anterior (TA) de músculo congelado parcialmente cubierta con incrustación de resina en un baño de 2-metilbutano enfriado con nitrógeno líquido -140 ° C como el material de origen tanto para microscopía de inmunofluorescencia y análisis de la expresión génica. La necesidad de utilizar la misma fuente de material para diversos enfoques técnicos es particularmente importante para los experimentos basados ​​en la inyección intramuscular donde los músculos izquierda y derecha representan diferentes condiciones, uno experimental y uno de control. Por ejemplo, en estudios de regeneración del músculo, uno muSCLE se inyecta con una toxina para causar daño tisular generalizado mientras que el músculo contralateral sirve como control 1 del vehículo de inyección. Del mismo modo, los estudios de terapia génica para trastornos musculares comienzan típicamente con la validación del vector de terapia génica mediante inyección intramuscular a ser comparado con el vector vacío, vector no relacionado o de control del vehículo en el lado contralateral 2. Por lo tanto, no es posible a la fuente de cada músculo TA para una aplicación diferente. Las estrategias comunes para hacer frente a este problema son: i) utilizar un grupo muscular diferente para cada aplicación, ii) utilizar los ratones adicionales, o iii) para cortar un trozo de músculo para cada aplicación. Sin embargo, las diferencias sustanciales entre los grupos musculares hacen que sea difícil comparar los datos de aplicaciones por separado, y los animales adicionales aumentan los gastos y son poco justificada si existen otras alternativas. Dividiendo el músculo después de la disección a la fuente de las diferentes aplicaciones es la mejor opción in muchos casos. Sin embargo, las piezas musculares son a menudo demasiado pequeñas para ser usadas pulverización en atmósfera de nitrógeno líquido o técnicas de molienda mecánica para la homogeneización 2-5. Como el músculo es un tejido altamente estructural lleno de proteínas de la matriz extracelular y contráctiles, inadecuado homogeneización mecánica conduce a un bajo rendimiento de ADN posterior, ARN o proteína. El método detallado aquí permite a las pequeñas cantidades de tejido de un músculo fuente para el uso en varias aplicaciones, y la inclusión de cryosectioning y la aguja trituración mejora la homogeneización mecánica para un mejor rendimiento de ARN.

<table><tbody><tr><td>Corcho</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Cortar en cuadrados pequeños con una cuchilla afilada.</td></tr><tr><td>Funda de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Se utiliza para orientar el músculo durante la congelación.</td></tr><tr><td>Termómetro de baja temperatura</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Precaución: producto químico peligroso. Almacenar en un armario inflamable.</td></tr><tr><td>Resina de inclusión: "cryomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific 6769006</td><td></td><td>Otras resinas de inclusión pueden sustituirse por cryomatrix.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 con portacuchillas desechable</td><td>Cualquier criostato que funcione debería ser suficiente para el protocolo.</td></tr><tr><td>Cuchilla de criostato desechable Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Utilice una cuchilla o cuchillo adecuado para el criostato que se va a utilizar.</td></tr><tr><td>Solución de descontaminación de ARNasa: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Úselo para manipular criosecciones. Se puede encontrar en tiendas con materiales de arte simples.</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de extracción orgánica de ARN: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Atención: TRIzol es un producto químico peligroso. Nota: Solo se recomiendan reactivos de extracción orgánicos para la extracción de ARN del músculo esquelético.</td></tr><tr><td>aguja de calibre 18</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 22</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 26</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Opcional. Se puede utilizar para una tercera ronda de trituración de muestras en el protocolo de extracción de ARN.</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>Para muestras de muy alto valor, se recomienda una jeringa Luer-Lok (p. ej., VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-cloopentano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Para etanol al 70% en agua DPC: alcohol de 200 grados</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Mezcle 35 ml de alcohol de 200 grados + 15 ml de agua DEPC.</td></tr><tr><td>Para etanol al 70% en agua DEPC: Agua tratada con DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Mix 35 ml de alcohol de 200 grados + 15 ml de agua DEPC.</td></tr><tr><td>Kit de purificación de ARN: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Pasos finales de la preparación del ARN.</td></tr><tr><td>Agua libre de DNasa/Rnasa&nbsp;</td><td>También se puede utilizar agua tratada con DEPC</td> <td>Gibco</td><td>10977</td>.</tr><tr><td>Espectrofotómetro: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Trate el ARN purificado para eliminar cualquier contaminación del ADN antes de las aplicaciones posteriores.</td></tr><tr><td>Bolígrafo hidrofóbico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS para protocolo de inmunofluorescencia.</td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Rehidrate el reflujo de suero de burro normal de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego diluya una alícuota al 5% para inmunofluorescencia.&nbsp; También se puede utilizar suero de cabra normal.</td></tr><tr><td>Anticuerpo eMHC</td><td>Universidad de Iowa Estudios del Desarrollo Banco de Hibridoma</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de colágeno VI</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-conejo AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-fenilindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje acuosos: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Utilice únicamente medios de montaje diseñados para aplicaciones fluorescentes con propiedades antidecoloración.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Uso para el montaje de portaobjetos al final del prototipo de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express, o productos más avanzados</td><td>Freeware ImageJ también deberían funcionar para el conteo manual. Un software más avanzado con capacidades de segmentación puede permitir la automatización parcial del proceso; por ejemplo, , ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Fusionar y mapear imágenes de sección: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 ha sido descontinuado. Otras opciones para la cardiotoxina son EMD Millipore #217503; Corporación Americana de Productos Químicos Personalizados # BIO0000618; o Ge Script # RP17303; Pero estos no han sido validados.</td></tr><tr><td>kit de transcripción inversa: Superscript III Sistema de síntesis de primera cadena</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Se puede utilizar cualquier reactivo de transcripción inversa validado y de alta calidad.</td></tr><tr><td>PCR estándar: Sistema de polimerasa GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Se puede utilizar cualquier sistema de polimerasa Taq validado y de alta calidad. Si se va a utilizar la secuenciación del ADN para cualquier aplicación posterior a la PCR, se debe utilizar un sistema de PCR de alta fidelidad.</td></tr><tr><td>SYBR verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>Para uso en qPCR cuando no se utiliza una mezcla maestra de qPCR dedicada. Úselo con SuperROX (para instrumentos de Applied Biosystems) y GoTaq Flexi polimerasa y tampones.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX es más estable en la reacción de PCR, por lo que se prefiere su uso como colorante de referencia pasivo de qPCR sobre ROX (carboxi-X-rodamina). Para qPCR con instrumentos de Applied Biosystems</td></tr><tr><td>PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Con este método, cryosections consecutivas se recogen para permitir que las aplicaciones de microscopía para histología de tejido y el enriquecimiento de ARN para la expresión de genes utilizando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. Por lo general, es difícil lograr una homogeneización adecuada de pequeñas muestras de músculo esquelético debido a los volúmenes de tampón puede ser demasiado baja para aplicaciones de molienda eficiente, pero sin la suficiente alteración mecánica, la arquitectura del tejido denso de los límites del músculo penetración de los reactivos de amortiguamiento, en última instancia, causando bajo rendimiento de ARN. Siguiendo el protocolo informado aquí, 30 micras secciones se recogen y se agruparon permitiendo cryosectioning y posterior homogeneización aguja para interrumpir mecánicamente el músculo, aumentar el área de superficie expuesta para la penetración buffer. Las limitaciones principales de la técnica son que requiere un criostato, y es relativamente bajo rendimiento. Sin embargo, el ARN de alta calidad puede obtenerse a partir de pequeñas muestras de m agrupadocryosections uscle, haciendo de este método accesible para muchas diferentes músculos esqueléticos y otros tejidos. Análisis Además, esta técnica permite adaptado (por ejemplo, la histopatología de tejidos y la expresión de genes) de las regiones adyacentes de un solo músculo esquelético de modo que las mediciones se pueden comparar directamente entre aplicaciones para reducir la incertidumbre experimental y para reducir los experimentos con animales replicativos necesario a la fuente de un pequeño tejido para múltiples aplicaciones.

RNA cryosection muscular es de alta calidad y proporciona un rendimiento suficiente para la mayoría de aplicaciones Los análisis de dieciséis preparaciones de ARN de músculo esquelético se muestran en la Tabla 1 usando 19,4 a 41 mg de músculo agrupada tibial anterior (TA) a partir de 8 ratones de control. Tanto la izquierda (L) y derecho músculos (R) TA se prepararon en los experimentos de regeneración con los mú...

Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir el análisis de parámetros histológicos y moleculares de secciones adyacentes de un solo tejido. Con este método, podemos ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del músculo esquelético y las enfermedades. Por ejemplo, ¿cuáles son los efectos regenerativos después de una lesión muscular y cuáles son los efectos de la entrega de genes virales por inyección intramuscular?La ventaja de este método es que los datos histológicos y moleculares se pueden correlacionar directamente a partir de un solo tejido. Eso hace que el análisis de datos sea más efectivo y un mejor uso de los tejidos experimentales. Cinco minutos antes de completar las disecciones, enfríe el baño de criopreservación.Cuando las muestras de tejido estén listas para ser incrustadas, primero aplique resina de inclusión en el tercio inferior o la mitad del tejido, donde el músculo se encuentra con el corcho. Esto debe hacerse de forma ordenada para reducir la interferencia de la resina con los escalones posteriores. Luego, deje caer inmediatamente el corcho en el baño de 2-metilbutano enfriado a menos 140 grados centígrados.Incluya hasta ocho prepar

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Investigación

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Biología

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

Este video describe el procedimiento para congelar el tejido muscular y obtener sus secciones delgadas. La técnica puede ayudar a estudiar la caquexia relacionada con el cáncer en modelos de ratón con cáncer de colon.

Congelación rápida de tejido muscular para seccionamiento: un protocolo para obtener secciones ultrafinas de tejido muscular murino congelado rápidamente

La unión neuromuscular (NMJ) está alterada en una variedad de condiciones que a veces pueden culminar en una falla sináptica. Este informe describe los métodos basados en microscopios de fluorescencia para cuantificar dichos cambios estructurales.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

Aquí demostramos los métodos más eficientes para congelar, incrustar, crioseccionar y teñir biopsias musculares para evitar la congelación de artefactos.

Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico

Aquí describimos un método simple para el aislamiento de células de la superficie epitelial del colon murino espacialmente distintas de las células de la base de la cripta subyacente.

Método cryosectioning para microdisección de murino mucosa colónica

Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.

Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores

Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

Presentamos un protocolo práctico, paso a paso, rápido para la extracción del cerebro del ratón y la disección de regiones discretas del tejido cerebral fresco. La obtención de regiones cerebrales para el análisis molecular se ha convertido en una rutina en muchos laboratorios de neurociencia. Estas regiones cerebrales se congelan inmediatamente para obtener datos transcriptómicos de alta calidad para el análisis a nivel de sistema.

Microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Aprende a realizar crioseccionado de músculo esquelético de ratón para correlacionar datos histológicos y moleculares del mismo tejido. Este método permite obtener ARN de alta calidad y optimizar el análisis experimental.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

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