Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

El objetivo general de este procedimiento es permitir el análisis de parámetros histológicos y moleculares de secciones adyacentes de un solo tejido. Con este método, podemos ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del músculo esquelético y las enfermedades. Por ejemplo, ¿cuáles son los efectos regenerativos después de una lesión muscular y cuáles son los efectos de la entrega de genes virales por inyección intramuscular?

La ventaja de este método es que los datos histológicos y moleculares se pueden correlacionar directamente a partir de un solo tejido. Eso hace que el análisis de datos sea más efectivo y un mejor uso de los tejidos experimentales. Cinco minutos antes de completar las disecciones, enfríe el baño de criopreservación.

Cuando las muestras de tejido estén listas para ser incrustadas, primero aplique resina de inclusión en el tercio inferior o la mitad del tejido, donde el músculo se encuentra con el corcho. Esto debe hacerse de forma ordenada para reducir la interferencia de la resina con los escalones posteriores. Luego, deje caer inmediatamente el corcho en el baño de 2-metilbutano enfriado a menos 140 grados centígrados.

Incluya hasta ocho preparaciones de tejido por lote. En el baño, revuelva los pañuelos durante 30 segundos, raspando el fondo del vaso de precipitados para evitar que los corchos de los pañuelos se congelen en la solución. Después de 30 segundos, con una herramienta de metal, saque un corcho de papel tisú del 2-metilbutano.

A continuación, retire rápidamente el deslizamiento de la cubierta de soporte. Vuelva a sumergir el exceso de 2-metilbutano en el baño y luego deje caer el corcho de papel en el baño de nitrógeno exterior. Después de que todos los tejidos se hayan transferido al nitrógeno líquido, muévalos a un recipiente y guárdelos a menos 80 grados centígrados.

Después de preparar el criostato y montar una muestra de tejido, use los controles gruesos y finos para avanzar la muestra hasta la cuchilla para que toque la hoja. Restablezca la suma de los espesores de sección a cero en este punto. A continuación, configure el criostato en la función de recorte con un grosor de sección de 30 micras.

Y corte y deseche secciones hasta la profundidad de tejido deseada. Para recolectar criosecciones de manera eficiente para la extracción de ARN, primero abra el tubo de recolección y colóquelo cerca del portador de la cuchilla. Allí, use un cepillo limpio y preenfriado para recoger cada sección y transferirla al tubo.

Las secciones anteriores del tibial de ratón de 30 micras agrupadas tomadas de 400 a 4.000 micras de profundidad de tejido suelen producir de 25 a 50 miligramos de músculo. Si la resina incrustada rodea la criosección, bloquee el freno de mano y use una cuchilla de afeitar para afeitar pequeños trozos de resina hasta que solo quede una capa delgada alrededor de la parte superior del músculo. Corta siempre la resina con la hoja en ángulo alejado del músculo.

Una fina capa de resina de inclusión no perjudica sustancialmente la extracción de ARN posterior. Si hay resina de inclusión más espesa, use cepillos para separarla del músculo antes de mover la criosección al tubo de recolección. Durante el proceso de seccionamiento, cuando se deseen secciones histológicas, restablezca el grosor del corte a siete micras utilizando los controles de criostato.

Luego, corte y deseche de cuatro a siete secciones para obtener una superficie de tejido consistente y uniforme y tome nota de la profundidad de este tejido. Ahora, corta una buena sección y oriéntala en la superficie del portacuchillas. Usando un portaobjetos de microscopio a temperatura ambiente, levante la sección y devuelva el portaobjetos a temperatura ambiente.

Recoja todas las secciones deseadas y luego tome nota de la profundidad final del tejido. Después de completar el seccionamiento, registre rápidamente el peso de las criosecciones agrupadas para el aislamiento de ARN. Regrese inmediatamente el tubo a la cámara de criostato para mantener la temperatura de las secciones cerca de los 20 grados centígrados negativos.

Comience transfiriendo rápidamente las criosecciones agrupadas a hielo y agregue aproximadamente un milímetro de reactivo de extracción de ARN orgánico por cada 50 miligramos de criosecciones. Cuanto antes se aplique el reactivo, menos se degradará el ARN. A continuación, utilizando una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 18, homogeneice las criosecciones sin hacer demasiadas burbujas extrayendo repetidamente una solución y expulsándola sobre las paredes del tubo.

Utilice la punta de la aguja para dispersar los trozos agrupados. Después de cada cinco golpes, regrese brevemente la muestra al hielo para mantenerla fría. Una vez homogeneizada, utilice una aguja de calibre 22 para triturar cuidadosamente la muestra con cinco golpes más.

A continuación, vuelva a colocar la muestra en hielo. Repite este proceso tres o cuatro veces para conseguir una homogeneidad de tejido muy finamente dispersa. Una vez hecho el homogeneizado final, se deja incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente para interrumpir los complejos moleculares.

A continuación, en una campana extractora, agregue 0,1 mililitros de BCP por mililitro de reactivo de aislamiento de ARN. Luego, agite el tubo vigorosamente durante 15 segundos. No utilice un vórtice.

Luego, incube la muestra a temperatura ambiente durante dos o tres minutos. Después de la breve incubación, centrifugar la muestra durante 15 minutos a 12.000 g y cuatro grados centígrados. Luego, recoja cuidadosamente la fase superior clara que contiene el ARN.

Transfiéralo a un tubo limpio y agregue un volumen igual de 70% de etanol, compuesto en agua de mar profunda. Después de vórtice brevemente el tubo, déjelo incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceda siguiendo el protocolo de texto. Las preparaciones de ARN del músculo esquelético se realizaron a partir del tibial anterior del ratón.

Tres días antes, a algunos músculos se les inyectó cardiotoxina 10 micromolar y a otros solución salina. La pureza y el rendimiento del ARN de estas muestras fueron excelentes. La producción de ARN fue sustancialmente mayor en los músculos tibiales anteriores después de la lesión por toxina.

La integridad de los tejidos y la producción de ARN podrían influir en esta observación. La persistencia de la calidad del ARN preparado se evaluó utilizando un microlitro de ARN que se había almacenado a 20 grados centígrados negativos durante 18 meses. Las bandas prominentes de ARN ribosómico 18S y 28S todavía son evidentes en muestras que demuestran una alta calidad de ARN.

Se tiñeron secciones de siete micras para la expresión de la cadena pesada de miosina embrionaria, que se ve en rojo. Para detectar fibras regeneradoras, teñido para el colágeno seis, visto en verde, que delinea las fibras musculares y teñido con dappy, en azul, para observar los núcleos. Cuando hay una mala inyección de toxina, la lesión parece mínima.

Una inyección de toxina exitosa da como resultado que una región mucho más grande del compartimiento muscular objetivo se vea afectada. El grado de lesión podría utilizarse como criterio de inclusión para el análisis de ARN. Una vez dominadas, las secciones de corte para la extracción de ARN y la diapositiva histológica se pueden completar en menos de media hora para un solo tejido.

Después de este procedimiento, se puede seguir a otras tinciones histológicas de inmunofluorescencia para responder a una amplia variedad de preguntas. Las criosecciones agrupadas también se pueden usar para recolectar ADN o proteínas.